一种提高栽培红豆杉中紫杉烷类化合物含量的方法

摘要

本发明公开了一种提高栽培红豆杉中紫杉烷类化合物含量的方法。本发明在适宜栽培红豆杉的条件下，施入含铜化合物作为肥料添加剂。在土壤栽培的红豆杉的根部，每株施入0.00002～0.0002摩尔的含铜化合物或在水栽培的红豆杉水培养液中施入含铜化合物，使其水培养液Cu2+浓度为0.0001～0.001mol/L。本发明缓解了红豆杉中紫杉烷类化合物的含量低的难题。紫杉烷类化合物具有极高的经济价值，本发明的应用前景广阔。

说明书

技术领域

本发明涉及植物领域，具体是涉及一种提高栽培红豆杉中紫杉烷类化合物含量和产量的方法。

背景技术

红豆杉(Taxus spp.)，俗称“水松”，国家一级保护植物，含紫杉烷类化合物，其次生代谢化合物紫杉醇是治疗乳腺癌和卵巢癌的特效药，对肺癌、卡波氏肉瘤等其它多种恶性肿瘤也有很好的疗效，是当今世界上公认的广谱、强活性抗癌药；可特异地促进微管蛋白的聚合，阻断细胞分裂，是细胞学研究的得力工具。紫杉醇在生长缓慢的红豆杉中含量很低，提取分离的成本很高，价格非常昂贵。临床和科研需求的日益增加使许多地方的红豆杉大面积地消失，导致本来有限的自然资源更加匮乏。为此，国内外许多政府机构、医药公司及个人已投入了巨额资金，建立了药用林，以定期采集枝叶，相对稳定地获得紫杉醇及其10-deacetylbaccatin III、Baccatin III等化学半合成前体，这也与保护野生资源的利益一致。

但是很多盲目性的投资和种植园建设导致了很严重的问题。据调查，红豆杉中紫杉醇含量很低，且随品种、年龄、季节的不同而变化，在国内一些地方栽培的红豆杉枝叶中检测不到紫杉醇，已造成了资源、财力、人力和物力的浪费。紫杉烷类化合物在红豆杉中合成量非常小甚至于不合成，相关的酶活力也很低。因此，能否找到一种提高红豆杉紫杉烷类化合物含量的方法显得特别重要。迄今，尚未有对栽培的红豆杉小树施以不同浓度铜化合物的报道。

发明内容

本发明的目的在于针对上述红豆杉中紫杉烷类化合物含量低的问题，提供一种可以提高栽培红豆杉中紫杉烷类化合物含量的方法。

本发明通过大量的实验研究，发现在适宜栽培红豆杉的条件下施入适量的Cu²⁺可以提高红豆杉中紫杉烷类化合物的含量。在土壤栽培中，在每株红豆杉的根部施入0.00002～0.0002摩尔的含铜化合物可以明显提高紫杉烷类化合物的含量，含铜化合物的最佳施入值为0.0002摩尔/株。在水栽培中，在红豆杉水培养液中施入含铜化合物，使其水培养液Cu²⁺浓度为0.0001～0.001mol/L，可以明显提高紫杉烷类化合物的含量，Cu²⁺浓度的最佳值为0.001mol/L。

上述红豆杉为2～3年生的曼地亚红豆杉或南方红豆杉。

上述含铜化合物为CuSO₄·5H₂O。

对于植物Cu²⁺是必要的微量元素，作为很多酶的活化剂和辅酶参与很多氧化还原反应。当以大剂量施加于植物时，铜往往导致氧化胁迫或各种活性氧因子的产生。而氧化逼迫或各种活性氧因子具有细胞毒性，致使光和与呼吸作用、酶活性、DNA构型和膜的完整性发生变化，而这些变化又都可进一步的抑制植物的生长。在本研究中，施用的剂量大时都会导致植物生长受阻和针叶枯死，尤其是老叶。

栽培试验的结果显示，适当剂量的Cu²⁺能大大提高10-脱酰基巴卡丁III的含量和产量。基于紫杉烷类化合物的生物合成途径，可以推测Cu²⁺应能够通过提升10-脱酰基巴卡丁III水平提高紫杉醇的含量。

本发明的有益效果：本发明通过大量的实验研究，发现在栽培红豆杉过程中施入适量的Cu²⁺可以提高红豆杉中紫杉烷类化合物的含量，从而缓解了红豆杉中紫杉烷类化合物的含量低的难题。由于紫杉烷类化合物具有极高的经济价值，本发明的应用前景广阔。

附图说明

图1为不同剂量的Ag⁺和Cu²⁺盐处理的各栽培实验组紫杉醇和10-脱酰基巴卡丁III含量的柱状图；

图2为不同剂量的Ag⁺和Cu²⁺盐处理前后的各栽培实验组每棵树苗的鲜生物量均重柱状图；

图3为不同剂量的Ag⁺和Cu²⁺盐处理的各栽培实验组总的紫杉醇和10-脱酰基巴卡丁III产量柱状图；

图4为水培Taxus wallichiana var.mairei小苗的图片；

图5为不同浓度的Cu²⁺处理的水培红豆杉组紫杉醇和10-脱酰基巴卡丁III的含量图；

图6为不同浓度的Cu²⁺处理前后红豆杉实验组和对照组每棵小苗平均鲜生物量重柱状图；

图7为用含不同浓度Cu²⁺盐的培养基处理的各栽培Taxus wallichianavar.mairei小苗实验组总的紫杉醇和10-脱酰基巴卡丁III产量的柱状图；

其中，图4中，a：浓度为10^-2M Cu²⁺的培养基栽培的小苗的根；b：浓度为10^-3M Cu²⁺的培养基栽培的小苗的根；c：对照栽培的小苗的根；d：浓度为10^-3M Cu²⁺的培养基栽培的小苗的茎和叶；e：对照组小苗的茎和叶。

具体实施方式

实施例1土壤栽培

1.植物材料和处理

野外栽培实验的材料是于2003年5月从成都植物微繁有限公司购买的二年生曼地亚红豆杉(Taxus×media)小树，种植在广东省清远市连山县上草镇红豆杉实验园中(海拔647m)。每棵植株于2003年5月26日栽培时进行了第一次称鲜重并于2004年5月26日连根挖出，用水冲干净土壤基质后再次称鲜重。种植的土壤疏松肥沃，适合红豆杉的生长。

实验设置了14组Taxus×media小树，每组20棵，12组用于实验，2组用于作对照。每个实验组都施加了不同剂量的蓝矾溶液(见表1)。2004年3月26日采集了每组中每棵植株枝叶，合成混合样品。每组新鲜样品都在通风的地方阴干，并磨成粉末用于下一步的化学分析。样品的干鲜生物量重量的比率亦经过测量后作了估算(见表2)。

表1 Taxus×media小树的土壤栽培中对各实验组中每棵小树的蓝矾施用量。

重金属盐                                  处理

化合物         10^-1M Cu²⁺    10^-2M Cu²⁺     10^-3M Cu²⁺      对照

CuSO₄·5H₂O  500mg/plant     50.0mg/plant     5.00mg/plant       -

各种剂量的蓝矾都用20ml水溶解，于2003年7月1日，即移栽的一个月之后，一次性施加于每个试验组的每一株植株。

          表2 Taxus×media样品的干/鲜生物量重比率估测

样品序号       1        2         3        4         平均±标准误

鲜生物量重     40.00    40.00     40.00    40.00     40.0±0.00

干生物量重         16.12     15.88     16.56     15.92     16.12±0.31

干/鲜生物量重比率  40.3％    39.7％    41.4％    39.8％    40.3±0.78％

2.结果和结论

如表3所示，高剂量下蓝矾都明显地抑制Taxus×media小树生物量的积累，小剂量下则对其影响轻微。与细胞培养中出现的结果不同，额外施加AgNO₃不同程度上降低了两种紫杉烷类的含量，尤其是大剂量施加时，如图1、2、3所示。虽然大剂量的时候也会有负作用，铜盐作为肥料的添加剂适量施用能不同程度的提高两种紫杉烷类的含量和产量，(表3和图1、3)。各组紫杉醇和10-脱酰基巴卡丁III产量由各组估算的干重和含量估算。栽培实验各组总的干重是根据总的鲜重和平均干/重比率的乘积估算的，估测平均干/鲜重比率见表2。施加50.0mg CuSO₄·5H₂O/株的组，10-脱酰基巴卡丁III的含量和产量分别显著地提高了37.9±0.3％和35.6±2.5％。

表3土壤栽培的Taxus×media每株的平均生物量鲜重(g)和每组紫杉烷类化合物的含量

处理   顺序         平均鲜重(g)                      紫杉烷类含量(％)

               移栽前        采样时             紫杉醇           10-DAB III

10-1M   1    1.89±0.55    5.01±0.65^**   0.0380±0.0014^**   0.0218±0.0012

Cu²⁺   2    2.06±0.40    4.39±1.10^**   0.0386±0.0020^**   0.0210±0.0015

10^-2M  1    2.11±0.45    6.22±0.86      0.0517±0.0031      0.0290±0.0014^**

Cu²⁺   2    2.00±0.39    6.38±1.18      0.0508±0.0027      0.0285±0.0020^**

10^-3M  1    1.95±0.52    6.51±1.05      0.0496±0.0025      0.0254±0.0013^**

Cu²⁺   2    2.04±0.48    6.33±1.31      0.0502±0.0016      0.0243±0.0019^**

Control 1    2.04±0.31    6.34±0.99      0.0489±0.0044      0.0207±0.0020

        2    1.97±0.43    6.47±1.07      0.0494±0.0028      0.0210±0.0016

每纵行中数据与对照的t-检验，^**1％和^*5％水平。

实施例2水栽培

1.植物材料和处理

用于水培实验的一年生Taxus wallichiana var.mairei树苗2003年6月24日购买于中国广东省北部的大东山自然保护区。所有用于实验的小苗是根据相似的高度，近似的生物量进行筛选的。用双蒸水冲洗掉根系中的土壤基质，并且处理时尽可能地减少了对根部的伤害。然后将植株转移到32公升(17(高)×65(长)×29(宽)厘米)盛满相应处理培养液的塑料容器中，培养基中用气泵连续不断地、均匀地通以气体，培养基塑料容器的塑料板上穿有直径6厘米的10个孔洞。每棵植株用中间劈开带有小孔的橡胶塞固定于一个长孔中，每两棵水培的Taxus wallichiana var.mairei小苗相距10厘米。各种处理的塑料容器随机放置于遮阴棚下，每个处理设两个重复，每个重复10棵小苗。

所有水培植株全部都水培于Hogland培养液(Hoagland andAmon，1950)中，根据实验处理的不同额外施加不同剂量的CuSO₄·5H₂O(见表4)。为了避免盐分沉淀以及营养匮乏，每个月更换培养液，并且定期补加双蒸水以维持培养液的浓度和体积。所有营养溶液的pH值是用Sartorius pH测量仪测量，用NaOH和HCl溶液调节pH值至5.5～6.0。

表4水培的Taxus wallichiana var.mairei小树Hogland培养液中CuSO₄·5H₂O的添加量

处理            10^-2M Cu²⁺/L  10^-3M Cu²⁺/L  10^-4M Cu²⁺/L  空白对照

CuSO₄·5H₂O   2.5g/L          0.25g/L         0.025g/L        -

“-”表示末加CuSO₄·5H₂O的处理。所有处理组均用Hogland培养液(Hogland培养液每升含：490mg MgSO₄·7H₂O，950mg Ca(NO₃)₂·4H₂O，610mg KNO₃，120mg NH₄H₂PO₄，0.45mg MnCl₂·4H₂O，0.03mg ZnCl₂，0.01mg CuCl₂·2H₂O and 0.006mg Na₂MoO₄·2H₂O)。

水培植株上方1米处覆盖以透明的塑料板，并且于其上再覆盖以透光率为40％左右黑色的遮阳网，使之生长于光照强度为1813.4±226.7MJm^-2year^-1的环境中。植株从2003年6月24日到2004年6月26日在环境温度下水培了367天。每棵植株在2003年6月26日水培之前进行了称重，并且于2004年6月26日收获时再次称重。所有的新鲜植株在通风干燥的环境中风干并磨成粉末用于随后的化学分析。

2.结果和结论

对于水培的Taxus wallichiana var.mairei小苗，其生长都依Cu²⁺的浓度的不同而不同程度地受到抑制。与对照相比，根的伸长强烈受阻，针叶出现黄白色。根不但明显的偏短，而且尖端苍白膨大(图4)。水培培养液中Cu²⁺的浓度为10^-4Mol/L时能显着地分别提高红豆杉10-脱酰基巴卡丁III的含量和产量11.1±1.27％和10.0±3.53％，同时紫杉醇的含量和产量也有轻微但不显着的增长(表5，图5，7)。当培养基中Cu²⁺的浓度最高，即为10^-2M时，紫杉醇与10-脱酰基巴卡丁III的含量和生物量鲜重都会显着下降。当培养基中Cu²⁺的浓度为10^-3M时10-脱酰基巴卡丁III的含量提高了42.4±0.7％之多，同时轻微地提高了紫杉醇的含量，但也显着地抑制了植株的生长。各组紫杉醇和10-脱酰基巴卡丁III产量由各组干重(见表6)和含量估算。

表5水培Taxus wallichiana var.mairei小苗各组每株平均鲜生物量重(g)和各组紫杉醇与10-脱酰基巴卡丁III的含量

处理        顺序         平均鲜重(g)                       紫杉烷类含量

                    移栽前        采样时             紫杉醇            10-DAB III

10^-2M Cu²⁺  1    1.54±0.33    2.66±0.47^**   0.0121±0.0015^**   0.0298±0.0028^**

              2    1.62±0.28    2.54±0.51^**   0.0118±0.0013^**   0.0281±0.0019^**

10^-3M Cu²⁺  1    1.56±0.25    4.38±0.61^**   0.0218±0.0024^*    0.0784±0.0051^**

              2    1.48±0.22    4.46±0.54^**   0.0227±0.0011^*    0.0772±0.0035^**

10^-4M Cu²⁺  1    1.59±0.39    8.14±0.80      0.0208±0.0016      0.0605±0.0037^**

           2       1.60±0.31       7.98±1.06         0.0212±0.0010      0.0612±0.0021^**

对照       1       1.55±0.27       8.02±0.96         0.0207±0.0028      0.0549±0.0039

           2       1.51±0.35       8.25±1.20         0.0197±0.0016      0.0544±0.0046

每纵行中数据与对照的t-检验，^**1％和^*5％水平。

表6各实验组和对照组的总的生物量干重，水培组的干重都是鲜植株用电烤箱在60℃下烤至恒重。

处理        10^-2M Cu²⁺      10^-3M Cu²⁺       10^-4M Cu²⁺      对照

重复1       10.67             17.59              32.31             31.78

重复2       10.34             18.12              31.47             32.95

总之，在合适的剂量处理下，Cu²⁺能促进栽培的红豆杉小树紫杉烷类化合物的产量但Ag⁺达不到这种效果，Ag⁺在各种剂量处理下都因剂量施加的不同而不同程度地抑制了紫杉烷类化合物的合成和红豆杉植株的生长。CuSO₄·5H₂O在红豆杉的栽培中显示了比较好的应用前景。