一种精浆果糖吲哚法定量检测试剂、试剂盒及其检测精浆果糖的方法

摘要

本发明公开了一种精浆果糖吲哚法定量检测试剂、试剂盒及其检测精浆果糖的方法。所述精浆果糖吲哚法定量检测试剂，包括去蛋白液、碱性溶液、显色液、浓盐酸、果糖标准液，还包括用于覆盖在比色液表面避免浓盐酸挥发的保护剂，所述比色液或者是待测管中稀释后的精浆与去蛋白液、碱性溶液、显色液、浓盐酸的混合液，或者是标准管中稀释后的不同浓度的标准液与显色液、浓盐酸的混合液。所述精浆果糖吲哚法定量检测试剂盒，包括去蛋白液、碱性溶液、显色液、浓盐酸、果糖标准液，还包括用于覆盖在比色液表面避免浓盐酸挥发的保护剂、可密闭的反应管或内壁包覆隔离膜的反应管。本发明由于加入防止浓盐酸挥发的保护剂，能有效保护环境和仪器。

说明书

技术领域

本发明涉及一种体外诊断用试剂、试剂盒及应用其于检测的方法，具体涉及一种精浆果糖吲哚法定量检测试剂、试剂盒及其检测精浆果糖的方法。

背景技术

在男性不育的理论与临床研究中，精浆果糖作为精囊特异性的分泌指标，一直占有很重要的地位，广泛应用于鉴别单纯输精管阻塞所致的无精症和输精管、精囊发育不良引起的无精症；此外，它也能间接反映雄性激素的分泌水平。

过去，国内主要是采用间苯二酚法检测精浆果糖浓度，其方法存在温育温度为90℃，要加入强腐蚀性浓盐酸且结果准确性不高等缺点。世界卫生组织(WHO)推荐用吲哚法定量检测精浆果糖，但其方法中也要使用强腐蚀性浓盐酸，浓盐酸的挥发性导致容易污染环境，在上仪器操作时容易腐蚀损坏仪器，并且反应在玻璃试管中进行，不易密闭无法控制浓盐酸的挥发也不便于操作。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能够有效保护环境和仪器的精浆果糖吲哚法定量检测试剂、试剂盒及其检测精浆果糖的方法。

为实现上述目的，本发明的基本构思是在包括去蛋白液、碱性溶液、显色液、浓盐酸、果糖标准液的WHO推荐用精浆果糖吲哚法定量检测试剂中再加上用于覆盖在比色液表面避免浓盐酸挥发的保护剂。所述比色液或者是待测管中稀释后的精浆与去蛋白液、碱性溶液、显色液、浓盐酸的混合液或者是标准管中稀释后的不同浓度的标准液与显色液、浓盐酸的混合液。

所述保护剂是脂溶性具有良好透光性的有机溶剂，可优选甘油与Tween-80的混合物，其中甘油的体积占30～70％。

为更有效的减少浓盐酸挥发、减小反应管对反应的干扰，本发明采取的进一步的技术方案是一种精浆果糖吲哚法定量检测试剂盒，其特征在于：在包括上述含保护剂的精浆果糖吲哚法定量检测试剂的基础上，还包括可密闭的反应管或内壁包覆隔离膜的反应管。

所述可密闭的反应管可以是Eppendorf反应管或内壁包覆隔离膜的Eppendorf反应管，也可以是其他便于密闭的玻璃管等。

所述隔离膜可以是甲基硅油膜或者是含有其他基团的硅油膜。

本发明并提出应用所述含保护剂的精浆果糖吲哚法定量检测试剂进行精浆果糖定量检测的方法，包括以下步骤：

a)将待测精液离心后取精浆样本适量，稀释后加去蛋白液、碱性溶液作去蛋白处理，取离心后的上清液装入反应管，作为待测管；

b)将原果糖标准液稀释为不同浓度的标准液，分别取与待测管中液体相等的体积装入各自的反应管，作为标准管；

c)在待测管和各标准管中分别加入显色液、浓盐酸，各管所加同种液体的体积相同，水浴反应后，冷却，作为比色液；

d)将各管比色液分别移至各酶标微孔；

e)由酶标仪比色，检测各微孔的吸光度；

f)根据各标准管的浓度、精浆的稀释倍数和检测到的各微孔的吸光度，由酶标仪计算标本的真实果糖浓度。

其特征在于：在步骤d)将各管比色液移至酶标微孔后，每微孔再加保护剂，充分振荡后再进行步骤e)。

所述各步骤中使用的反应管优选可密闭的反应管，在水浴反应中将反应管密闭，可进一步减少浓盐酸挥发；也可优选内壁包覆隔离膜的反应管，可减小反应管对反应的干扰。

所述各步骤中使用的反应管可进一步优选内壁包覆甲基硅油隔离膜的Eppendorf反应管，既能进一步减少浓盐酸挥发又避免了使用普通Eppendorf反应管干扰反应的缺陷。

采用本发明提供的技术方案，有如下优点：1)上酶标仪比色时加入保护剂，防止浓盐酸挥发而污染环境腐蚀仪器；2)在可密闭的反应管中完成过程，解决了在普通玻璃试管中反应无法控制浓盐酸挥发的缺点；3)在内壁包覆隔离膜的反应管中反应，减小了反应管对反应的干扰，提高检测准确度；4)如进一步选用内壁包覆隔离膜的Eppendorf反应管则同时具有环保和结果准确的优点。因此本发明较现广泛采用的世界卫生组织推荐的试剂和方法更环保、更安全，能适于临床常规开展。

具体实施方式

下面对本发明作进一步的详细说明。

实施例一、一种精浆果糖吲哚法定量检测试剂盒，其中包括：

a)去蛋白液：1～3％的ZnSO₄·7H₂O水溶液；

b)碱性溶液：0.02～0.5mM的NaOH水溶液；

c)显色液：2×10^-3～10×10^-3％的吲哚、0.1～0.3％的苯甲酸混合水溶液；

d)37％的浓盐酸；

e)保护剂：Tween-80、甘油混合液，甘油占总体积的30～70％；

f)果糖标准液：1.12～3.36mM的果糖、0.1～0.3％的苯甲酸混合水溶液；

g)内壁包覆甲基硅油隔离膜的Eppendorf反应管。

本例中，碱性溶液也可以是碳酸钠溶液等其他碱性溶液；显色液也可以是间苯二酚等在强酸高温条件下能与果糖反应生成有颜色产物的溶液；保护剂也可以是其他脂溶性具有良好透光性的有机溶剂，只要能覆盖在比色液表面阻止浓盐酸挥发同时不影响液体的透光性就可以选用；隔离膜也可以是含有其他基团的硅油膜。

实施例二、一种精浆果糖吲哚法定量检测试剂盒的详细制作方法，包括以下步骤：

a)配制去蛋白液

i)取ZnSO₄·7H₂O 1～3克，置于烧杯加适量去离子水溶解；

ii)用去离子水定容至100毫升，振荡摇匀过滤；

b)配制碱性溶液；

i)取AR级NaOH 100～120克置于烧杯，加去离子水200毫升，将烧杯置冷水中搅拌，待溶解后倒入聚乙烯塑料瓶中，室温静置数日。

ii)取浓NaOH上清液适量，放入500毫升容量瓶中，加去离子水至所需浓度。

c)配制显色液；

i)取1～3克苯甲酸，加去离子水900毫升，50～100℃水浴振荡溶解；

ii)取20～100毫克吲哚溶入上述溶液，50～100℃水浴振荡溶解后加去离子水至1000毫升；

d)取市售AR级浓盐酸；

e)取市售AR级Tween-80、甘油混合，甘油占总体积的30～70％，作为保护剂；

f)制作内壁包覆甲基硅油隔离膜的Eppendorf管；

i)取1.5毫升Eppendorf管若干支，每支加满5～8％的甲基硅油水溶液，静置10分钟，使甲基硅油充分吸附于管壁；

ii)倾去Eppendorf管内液体，置37℃烘烤10小时，使之充分烘干；

g)配制果糖标准液。

i)取1～3克苯甲酸，加去离子水900毫升，50～100℃水浴振荡溶解；

ii)取1.12～3.36mmol果糖溶入上述溶液，加去离子水定容至1000毫升。

实施例三、一种采用实施例二中制得的精浆果糖吲哚法定量检测试剂盒进行精浆果糖定量检测的方法的全过程，具体步骤为：

a)待测精液标本1000g离心10分钟，倾倒精浆。

b)取精浆20ul，加稀释液200ul、去蛋白液50ul、碱性溶液50ul，混合，室温放置15分钟，2000g离心20分钟或者8000g离心5分钟，取上清50ul，装入内壁包覆甲基硅油隔离膜的Eppendorf管，作为待测管；

c)将2.24mM的果糖标准液向下对倍稀释为1.12mM、0.56mM、0.28mM、0.14mM，用去离子水作零果糖标准液，各取50ul装入内壁包覆甲基硅油隔离膜的Eppendorf管，作为标准管；

d)在制得的待测管和各标准管中分别加入显色液50ul、浓盐酸500ul，迅速加盖，混匀，50℃水浴20分钟，再以冰水混合液冷却15分钟或置-20℃冷却5分钟；

e)将各管液体移至酶标微孔，每管分装两孔，每孔250ul，每微孔再加保护剂50ul，充分振荡后酶标仪470nm比色；

f)在酶标仪上输入各标准管的应用浓度，即各标准管的实际浓度×精浆稀释倍数16，按“平滑曲线”方式拟合标准曲线，酶标仪输出的即为检测标本的真实果糖浓度。

本例中采用对倍稀释的方法来获得不同浓度的果糖标准液，在实际操作中也可以用其他比例的稀释方法来制备标准液，只要所得稀释液果糖浓度是确定的。本例中采用了0～2.24mM共六种不同浓度的标准液来制备标准曲线，在实际操作中可以根据实际精度的需要确定两种或者两种以上的不同浓度的标准液来制备标准曲线。

本发明以其环保、安全和准确性在男性不育的理论与临床研究、诊断等方面，有广泛的应用前景。