生产鬼臼毒素及其糖甙和山萘酚黄酮类物质的毛霉菌、方法和应用

摘要

本发明公开了一株新的毛霉菌及其生产鬼臼毒素及其糖甙和山萘酚黄酮类物质的方法和应用。可生产鬼臼毒素及其糖甙和山萘酚黄酮类物质的菌株是毛霉(Mucor podophyllus)J.X.Huang sp.nov GJ－TW8，已于2005年4月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC № M 205032。该菌是从陕西太白山桃儿七植物根内分离、筛选、纯化得到纯菌株，具有生产与桃儿七植物相同的多种有药用价值的生物活性物质的生理特性，可应用于鬼臼毒素类物质及山萘酚黄酮类物质的生产，对开发鬼臼类原料资源提供了新途径。

说明书

技术领域

本发明涉及一株新的毛霉菌及其生产鬼臼毒素及其糖甙和山萘酚黄酮类物质的方法和应用，属于微生物技术领域。

背景技术

鬼臼毒素(Podophyllotoxin，PPT)及山萘酚(Kaempferol)黄酮类化合物是存在于小檗科(Berheridaceae)，即鬼臼类植物中的一类具有药用价值的生物活性物质。1880年Podwyssotzkii从美洲桃儿七树脂中首次分离到鬼臼毒素结晶。19世纪40年代，King等人报道了鬼臼毒素具有秋水仙碱样作用，可引起细胞变异。之后一系列医学，生物学研究证实了鬼臼毒素具有抗肿瘤活性作用。但由于其毒性较大，在临床的应用受到限制，20世纪50年代深入研究了其活性与构效的关系，合成并筛选出以其为母体的大量的衍生物，一些衍生物具有生物活性高、毒性低的特点，可用于临床治疗多种疾病。如：鬼臼乙叉苷(etoposid.VP16，依托泊甙)和鬼臼噻吩苷(tenipeside.VM26，替尼泊甙)是具有临床应用的广谱抗肿瘤药物。此外鬼臼毒素类还可用于农药杀虫剂。

目前鬼臼毒素主要是从野生鬼臼类植物的根茎中提取，而这类植物在全世界仅有4属15种，我国有3属12种，主要生长在秦岭，西藏等高海拔地区，其生长缓慢，且鬼臼物质含量低。由于鬼臼类物质在医药和农林防治方面具有广阔的应用前景，其需求量日益增加，对这类植物原料的大量采集，已使这类植物资源遭到严重破坏；造成生物多样性和生态环境无法弥补的损失。因此解决资源问题具有重要意义。

近年来，利用一些微生物具有产生和宿主相同或相似生理活性物质的特点，对植物内生菌进行了大量的研究，已有从桃儿七、山荷叶中分离到分布于丛梗孢属以及青霉属的内生菌培养物，经层析分析具有与鬼臼毒素相同的Rf(迁移率)值的报道(中国药物与临床，2003.3(3)、生物技术，2004.14(2))。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株可生产鬼臼毒素及其糖甙和山萘酚黄酮类物质的毛霉菌。

本发明的目的之二是提供一种利用上述菌株生产鬼臼毒素及其糖甙和山萘酚黄酮类物质的方法。

本发明的目的之三是提供利用上述菌株生产鬼臼毒素及其糖甙和山萘酚黄酮类物质的应用，为开发鬼臼类原料资源提供新途径。

可生产鬼臼毒素及其糖甙和山萘酚黄酮类物质的菌株是毛霉(Mucorpodophyllus)J.X.Huang sp.nov GJ-TW8，已于2005年4月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC NoM205032。

毛霉(Mucor podophyllus)J.X.Huang sp.nov GJ-TW8(以下简称GJ-TW8菌)是从陕西太白山桃儿七植物根内分离、筛选、纯化得到纯菌株，其鉴定特征如下：

(1)菌落特征

在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基和查氏培养基上：菌丝蔓延生长，呈疏松絮状，初为白色，PDA培养基上5天后充满平皿，查氏培养基上7天后充满平皿，呈灰白色(见附图1)。

(2)菌体形态特征

孢囊梗由菌丝生出，呈假轴分枝或单轴分枝，直立或具弹性弯曲，表面平滑，直径4.5～12.3μm，长750～2160μm，分枝长450～1200μm，偶在分枝处有一隔膜。孢子囊球形，孢子囊大小不均，大孢囊直径80～120μm，小孢囊直径24～80μm，成熟后呈淡褐色。孢囊壁极易消解(见附图2)。

囊轴球形，直径12～30μm，无色或淡褐色。

孢囊孢子长卵形或微柠檬形，两端钝，大小4.8～7.2×2.4～3.6，孢子长宽比1.5～2∶1，表面平滑，无色(见附图3)。培养基内可见孢子萌发时膨胀呈圆形、卵圆形酵母细胞型，直径5.2～16μm或6.4～14.5×4.2～12μm，长出芽管形成不发达的假菌丝(见附图4)。

菌丝管状无隔，培养3天菌丝间交叉出现联结使菌丝体呈网状结构，联结节呈球形或不规则球形1 4～24μm或24～27×14～24μm(见附图5)，接合孢子不易见。基内菌丝管状分枝，成熟呈淡褐色，并出现大量球形脂滴。

(3)生理特征

生长温度范围8℃～35℃，最适生长温度25℃～29℃。

在有机氮、铵态氮合成培养基上生长良好，硝态氮、亚硝态氮生长略差。

综合上述特征，依据《真菌鉴定手册》等真菌分类文献，上述菌株具有毛霉属基本特征，但与该属各种比较有明显不同特征，其分类所属毛霉目，毛霉科，毛霉属，冻土毛霉组新种。

生产鬼臼毒素及其糖甙和山萘酚黄酮类物质的方法，包括如下步骤：(A)将毛霉(Mucor podophyllus)J.X.Huang sp.nov GJ-TW8 CCTCC NoM 205032菌株接于种子培养基，在28-30℃(范围)培养5-6天，转接于发酵培养基发酵培养7-9天；(B)上述发酵培养物经抽滤，收集菌丝体，冷冻、破碎菌丝体，分别用氯仿、正丁醇依次萃取破碎的菌丝体，收集萃取物，减压浓缩；(C)氯仿萃取物上硅胶柱层析分离，依次用氯仿、9.5∶0.5和9∶1的氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，收集9.5∶0.5的氯仿-甲醇洗脱液，浓缩可得鬼臼毒素；(D)收集9∶1氯仿-甲醇洗脱部分，浓缩得山萘酚及黄酮类粗品；(E)浓缩的正丁醇萃取物，上硅胶柱层析分离，分别依次用氯仿、9∶1的氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，收集9∶1的氯仿-甲醇洗脱液，浓缩可得鬼臼毒素葡萄糖甙。

本发明的有益效果：提供的一株毛霉新种具有生产与桃儿七植物相同的多种有药用价值的生物活性物质的生理特性，可应用于鬼臼毒素类物质及山萘酚黄酮类物质的生产；本发明的菌种营养要求简单、易培养、生产周期短、具有工业化规模生产的应用潜力；对开发鬼臼类原料资源提供了新途径，对保护植物生态多样性具有重要意义。

附图说明

附图1为GJ-TW8菌的菌落形态；

附图2为GJ-TW8菌成熟孢囊及分枝的孢囊梗结构(10×10倍显微镜)；

附图3为GJ-TW8菌孢囊孢子形态(10×40倍显微镜)；

附图4为GJ-TW8菌孢子萌发呈酵母型细胞形态(10×20倍显微镜)；

附图5为GJ-TW8菌菌丝联结结构(10×20倍显微镜)；

附图6为GJ-TW8菌产生的鬼臼毒素¹³C核磁共振图谱；

附图7为GJ-TW8菌产生的鬼臼毒素¹H核磁共振图谱；

附图8为山萘酚HPLC标准图谱；

附图9为GJ-TW8菌产生的山萘酚HPLC图谱；

具体实施方式：

产物表征使用的仪器及条件：

INOVA-400核磁共振波谱仪(Varian，USA)

         检测条件：溶剂：氘代氯仿；温度：25℃；内标：TMS；

         频率：¹H 400 MHZ，¹³C 125MHZ；累加：64次。

HITACHI高效液相色谱仪

         检测器：HITACHI L-7420

         色谱柱：YWG-C₁₈ 10um 250mm×4.6mm

         流动相：甲醇-0.4％磷酸60∶40

         流速：1ml/min

         检测波长：360nm

         温度：25℃

实施例1

从太白山采回桃儿七植株，用组织分离法，分离、纯化、筛选出GJ-TW8纯菌株保存备用。

PDA培养基：20％马铃薯汁100ml，蔗糖2g，pH 6.5。种子培养基加2g琼脂；发酵培养基为液体。

本发明提供的GJ-TW8菌株，接于种子培养基，28℃培养5天，转接于装有200ml发酵培养基的500ml三角瓶中，29℃，180r/min，摇瓶培养7天，共收集发酵培养物40L，经抽滤，收集湿菌丝体约4250g，冷冻4h后取出，破碎菌丝体，依次分别用等体积氯仿和正丁醇萃取破碎的菌丝体。分别收集氯仿萃取物和正丁醇萃取物，分别于60℃减压浓缩至10ml。

浓缩的氯仿萃取物，采用湿法上硅胶柱层析分离(硅胶200～300目，柱长32cm，直径4cm)，分别用氯仿、氯仿-甲醇(9.5∶0.5，9∶1，8∶2)、甲醇依次洗脱，以标准试剂鬼臼毒素(sigma公司)和山萘酚(甙尔塔天然有机化合物公司)为对照，薄层显色检测洗脱液。收集氯仿-甲醇(9∶1)洗脱部分，减压浓缩，待溶剂挥发后获得黄色粉末，高效液相检测为山萘酚及黄酮类物质(见附图8、9)，共得到369mg。收集的氯仿-甲醇(9.5∶0.5)洗脱液浓缩后二次上硅胶柱(硅胶200～300目，柱长26cm，直径2cm)分离纯化，依次用氯仿、氯仿-甲醇(9.5∶0.5，9∶1)洗脱，收集9.5∶0.5洗脱液，减压浓缩，溶剂挥发后得到鬼臼毒素晶体，进一步使用乙醚重结晶纯化得108mg、纯度为93％以上的白色针状结晶，核磁检测与标准品图谱相同(见附图6、7)。鬼臼毒素产率为0.48mg/g干菌体。

浓缩的正丁醇萃取物，上硅胶柱层析分离(硅胶200～300目，柱长32cm，直径4cm)分别依次用氯仿、氯仿-甲醇(9∶1，8∶2)洗脱，与标准鬼臼毒素葡萄糖甙对照薄层显色检测洗脱液，收集9∶1洗脱液浓缩，再用制备薄层层析纯化(薄层硅胶GF₂₅₄，展层剂为氯仿-甲醇(9∶1))，与鬼臼毒素葡萄糖甙标准品对照，Rf值相同，将斑点铲下，甲醇浸洗收集，甲醇洗液浓缩，产物为鬼臼毒素葡萄糖甙。

实施例2

ISP发酵培养基：可溶性淀粉10g，K₂HPO₄ 1.0g，MgSO₄ 1.0g，NaCl 1.0g，(NH₄)₂SO₄ 2.0g，微量元素液1ml，蒸馏水1000ml，pH6.8(微量元素液：FeSO₄·7H₂O 0.1g，MnCl₂·4H₂O 0.1g，ZnSO₄·7H₂O 0.1g，蒸馏水100ml)

本发明提供的GJ-TW8菌株接种于PDA种子培养基28℃、培养5天后，转接于装有200ml ISP发酵培养基的500ml三角瓶中，29℃，180r/min，摇瓶培养7天，收集湿菌丝体3160g，冷冻4h，破碎菌丝体，依次分别用等体积氯仿和正丁醇萃取破碎的菌丝体。分别收集氯仿萃取物和正丁醇萃取物，分别于60℃减压浓缩至10ml。

浓缩的氯仿萃取物，采用湿法上硅胶柱层析分离(硅胶200～300目，柱长32cm，直径4cm)分别依次用氯仿、氯仿-甲醇(9.5∶0.5，9∶1，8∶2)、甲醇依次洗脱，以标准试剂鬼臼毒素和山萘酚为对照，薄层显色检测洗脱液。收集氯仿-甲醇(9∶1)洗脱部分，减压浓缩，溶剂挥发后得黄色粉末，为山萘酚及黄酮类粗品物质共263mg。收集氯仿-甲醇(9.5∶0.5)洗脱液浓缩二次上硅胶柱(硅胶200～300目，柱长26cm，直径2cm)，依次用氯仿、氯仿-甲醇(9.5∶0.5，9∶1)洗脱，收集9.5∶0.5洗脱液，减压浓缩，溶剂挥发后得到鬼臼毒素晶体。进一步乙醚重结晶纯化得95mg纯度为95％的鬼臼毒素白色针状晶体，产率为0.51mg/g干菌体。

浓缩的正丁醇萃取物，上硅胶柱层析分离(硅胶200～300目，柱长32cm，直径4cm)分别依次用氯仿、氯仿-甲醇(9∶1，8∶2)洗脱，与标准鬼臼毒素葡萄糖甙对照薄层显色检测洗脱液，收集9∶1洗脱液浓缩，再用制备薄层层析纯化(薄层硅胶GF₂₅₄，展层剂为氯仿-甲醇(9∶1))，与鬼臼毒素葡萄糖甙标准品对照，Rf值相同，将斑点铲下，甲醇浸洗收集，甲醇洗液浓缩，产物为鬼臼毒素葡萄糖甙。