轮状病毒蛋白、衍生的蛋白和肽在调节组织通透性中的应用

摘要

本发明涉及轮状病毒蛋白VP4、VP8及其衍生的融合蛋白和肽在增强药物通过细胞旁侧途径的传递中的应用。这些轮状病毒蛋白及其衍生的肽可用于减少癌细胞，或正常细胞之间由于外科手术、损伤、化疗、疾病、炎症或其它病理状况产生的不希望的细胞粘附。

说明书

技术领域

本发明涉及调节紧密连接密封的方法，具体地涉及抑制细胞粘附以及组织通透性屏障形成的蛋白和肽的应用。

背景技术

紧密连接(TJ)

多细胞生物中具有不同分子组成(尿、乳、胃液、血液等等)的液体包含在通过上皮(例如肾小管)和内皮(血管)形成的隔室中。这些细胞片层(sheet)构成了生物体内环境和隔室内容物之间的边界。因此，为了使血液组分进入到特定的组织，必须首先通过血管的管壁内皮细胞穿越血管的内腔。如果物质通过内脏进入躯体，首先必须通过由腔内衬的上皮细胞形成的屏障，并通过皮肤进入血液，上皮和内皮片层一定是交叉的。

尽管细胞-细胞粘附对组织的发育以及维持生物体内离散的隔室至关重要，但是仍然需要细胞粘附控制的调控的条件。当由上皮或内皮形成的屏障难以将药物递送到肌体内特异性组织和肿瘤时，将会遇到这种情况。

物质经由内皮和上皮的通道为两个平行的途径：跨细胞途径(tanscellularpathway)和细胞旁侧途径(paracellular pathway)。在前一途径中，离子和分子采用位于上皮和内皮的原生质膜中的运输通道、载体和泵。促进药物经过肌体内特异性组织的尝试通常依赖于这种体内运输分子的特异性通道或载体。然而由于其较低的内源性运输速率或施加的药物较差地发挥功能使得这种方法基本上是无效的，。

为了克服这些障碍，已分析经由细胞旁侧途径进行的运输。这些途径包括相邻细胞之间存在的细胞间隙并且由紧密连接(TJ)进行调节。

TJ是围绕在顶点和侧膜之间界限的细胞边界的结构。它表现出两个基本的作用：1)作为经由细胞旁侧途径调节离子，水和分子通过的门控；以及2)作为阻断脂类和蛋白质膜平面内(within the plane of the membrane)径向扩散的栅栏。这些栅栏是至关重要的，因为其维持顶部和基底侧原生质膜之间的脂类和蛋白质的极化分布(polarized distribution)(Cereijido等，1998)。

通过超薄切片电子显微照片，观察到TJ为一系列邻近细胞的膜的外部小叶之间的熔点“缝口”。在这些接触点，细胞间隙被完全去除。在冷冻-破碎复制品品的电子显微照片上，TJ出现在原生质膜上，作为原生质侧面(P)上连续和吻合的纤丝网络，在外原生质侧面(E)具有互补的凹槽(Gonzalez-Mariscal等，2001)。

已有两个模型被建议用来说明TJ的化学性质。在蛋白模型中，由与邻近细胞的并列膜中的配对物(partner)的膜内在蛋白形成TJ链(strand)。在脂模型中，TJ纤丝被认为是由反转的圆柱形胶束(micelles)形成的(Kachar等，1982)。尽管双层的脂内容物看上去对于TJ的形成是重要的，但近年来对TJ特异性内在蛋白的发现则强烈支持了TJ的蛋白模型。

TJ是由皮质(cortical)和内在蛋白的复合排列构成的。前者，迄今已鉴定出16种不同的分子。某些起到支架的功能，其将TJ的内在蛋白连接于肌动蛋白细胞支架(ZO-1，ZO-2，ZO-3和连蛋白(cingulin))(Citi等，1988；Gonzalez-Mariscal等，2000)，或作为跨膜连接蛋白(MUPP1，MUPP2和MUPP3)的交联剂(Hamazaki等，2002)。其它的与到TJ的泡囊运输有关(Rab13，Rab3b)(Zahraoui等，1994)，与通过与激酶(Par3和Par6)(Izumi等，1998)和Ras(例如AF6)(Yamamoto等，1997)的连接进行的细胞信号传导有关，以及通过其特异性结合于转录因子(ZO-1和ZO-2)而进行的基因表达有关(Balda等，2000)。在TJ中发现的一些其它皮质蛋白(cortical protein)的作用仍然不清楚[例如Jeap(Nishimura等，2002)，Pilt(Kawabe等，2001)，Barmotin(Zhong等，1993)和symplekin(Keon等，1996)]。

在TJ中发现了三种内在蛋白：紧蛋白(occludin)，密蛋白(claudin)和JAM。紧蛋白是第一个被鉴定的(Furuse等，1993)。其被认为是TJ链的组分，因为用特异性抗体进行的免疫复制品电子显微技术揭示了其在TJ纤丝内的标记(Saitou等，1997)。

此外，当被导入到L成纤维细胞中时，形成了缺少TJ的类似于TJ链的结构。

紧蛋白含有四个跨膜区域，两个类似大小的胞外环，以及三个胞质区域：一个胞内的短翻转，一个小的氨基末端区域和一个长的羧基末端区域。

一系列证据表明紧蛋白在TJ中起重要的作用。因此，上皮细胞中这种蛋白的突变体形式的过量-表达导致屏障以及TJ的栅栏功能(Balda等，1996b；McCarthy等，1996)(Bamforth等，1999)以及嗜中性粒细胞的跨上皮迁移的改变(Huber等，2000)，(Lacaz-Vieira等，1999)，(Medina等，2000)(Vietor等，2001)。另外，已在数种组织中观察到紧蛋白表达与上皮的密封程度之间的相关关系，这是通过跨上皮电阻抗(TER)和到胞外指示剂的通透性的。

尽管有这些证据，但是紧蛋白的生理功能还没有完全地被理解。在这方面应强调胚细胞和携带紧蛋白基因中的无效突变的小鼠仍能形成发育良好的TJ(Saitou等，1998)，尽管动物在出生后显示生长延缓以及在一些组织中出现组织异常(Saitou等，2000)。

最近，其它称为密蛋白1和密蛋白2的内在蛋白被确定为TJ的组分。通过数据库检索和cDNA以及基因组克隆，密蛋白家族已经扩展为20个成员(Tsukita等，2001)。所有的密蛋白编码20到27kDa的具有四个跨膜结构域的蛋白；两种胞外环，其中第一个显著长于第二个，以及短的羧基胞内尾部。

当密蛋白被转染到成纤维细胞中时，它们赋予了细胞-细胞聚集的活性，富集在细胞接触点并形成看来像TJ链的纤丝的网络。此外，在免疫复制品电子显微技术中抗各种密蛋白s的抗体选择性标记上皮的TJ纤丝。所有这些证据表明密蛋白为TJ链的主链。

各种密蛋白种类能够产生不同的冰冻破碎的模式。因此，密蛋白1或3在复制品子的原生质表面上(P面)形成具有连续平滑纤丝的TJ(Furuse等，1999)，而密蛋白2或5产生具有与外胞质面(E面)相联的不连续链的接头(Morita等，1999b)。相反密蛋白11在几乎没有分支的P面上构成平行的TJ链(Morita等，1999a)。

异源的密蛋白可在单个TJ链内相互作用，且它们的特定组合产生各种不同的冷冻破碎模式。因此密蛋白1和3形成的链是连续的且与P面相关联，而密蛋白1和2或3和2形成的链在E面凹槽中具有均匀散射的颗粒。在细胞旁侧空间中，除某些组合外，属于邻接细胞的各种密蛋白的胞外环也可以相互作用，(Furuse等，1999)。

上皮和内皮中的不同密蛋白的表达可在不同组织中产生丰富多样的通透性和细胞旁侧离子选择性。显示出各种各样TER的肾单位沿着不同的管状区段(近侧为6Ωcm²而集合管中为870-2000Ωcm²)表达几乎所有的密蛋白，然而每一种只限于特定的区段(Enck等，2001；Kiuchi-Saishin等，2002)(Reyes等，2002)：密蛋白5和15在内皮，密蛋白2，10和11在近侧段，密蛋白1，3和8在远曲小管以及密蛋白1，3，4和8在收集段。

不同密蛋白表达的启动被在发育水平上调节。因此，密蛋白5在视网膜色素上皮细胞发育过程中瞬间表达(Kojima等，2002)，密蛋白11在支持细胞(Sertoli cell)中在Y基因中的性别确定区域的表达峰之后立即表达(Hellani等，2000)，且密蛋白6被发现在胚胎干细胞与上皮细胞中的命运相同(Turksen等，2001)。

密蛋白16在具有低血镁高钙尿综合症(HHS)的病人中被突变(Simon等，1999)。这些病人的Henle′s薄上肢的细胞旁侧Mg²⁺和Ca²⁺重吸收显示出选择性的缺陷，其中Henle′s在此位点具有完整的NaCl再吸收能力(Blanchard等，2001)。因此密蛋白16看上去好像起Mg²⁺和Ca²⁺细胞旁侧通道选择性的作用(Goodenough等，1999)。其它的密蛋白也被证明是离子选择性的。因此当密蛋白4被转染到上皮细胞中时，通过Na+通透性的选择性降低而降低了细胞旁侧传导性，而对Cl^-通透性没有显著的影响(Van Itallie等，2001)。

二十多年前，Claude注意到TER与TJ链数目一起增加，其并非以希望的电阻串联添加的直线方式，而是指数地增加(Gonzalez-Mariscal等，2001)。

为解释这种关系，一种方案认为在TJ链内存在离子通道或孔道(Claude 1978；Gonzalez-Mariscal等，2001)。现在已经开始对密蛋白进行鉴定，看来好像TJ的离子选择性可通过构成TJ链的孔道或通道的特异性密蛋白同种型来测定。通过分析密蛋白的胞外环，发现了电荷残基的分布和数目的巨大差异。例如第一个环的等电点从密蛋白16的4.17到密蛋白14的10.49，且在第二胞外环中从密蛋白2，7，10和14的4.05到密蛋白13的10.5。根据胞外环序列的pKls，密蛋白16是阳离子孔道，一种方案与在病人中观察到的其突变的作用相一致，而密蛋白4，11和17为阴离子孔道(Mitic等，2001)。

TJ紧密度的变化好象是通过不同密蛋白种类的组合和配合比来确定。因此，当表达密蛋白1和4的MDCK细胞与密蛋白结合肽(产气荚膜梭菌肠毒素，(Clostridium perfringens enterotoxin)CPE)一起温育时，由TJ选择性地除去密蛋白4，TER产生显著的减少(Sonoda等，1999)。

此外，当密蛋白-2被导入到高抗性MDCK细胞(MDCK I)中时，TJ变得松散且形态上类似于在低抗性细胞(MDCK II)发现的那些，其通常含有密蛋白2(Furuse等，2001)。

密蛋白的致癌作用是有争议的。密蛋白4在胰腺癌和胃肠癌中过量表达，且用TGFβ或CPE治疗，肠毒素特异性地靶向密蛋白4，导致肿瘤生长的显著减少(Michl，2001)。相反，在大量的癌和癌细胞系中，其它的密蛋白保持低的或不能检测。例如密蛋白1在大多数人乳腺癌中不表达，但其启动子或编码序列却不存在改变(Hoevel等，2002；Kramer等，2000)，密蛋白7在头和颈鳞状细胞性癌中是下调的(Al Moustafa等，2002)。

上皮闸门功能中的特定密蛋白的重要作用通过下述观测被突出显示：密蛋白1缺陷小鼠中的上皮缺失了屏障功能，导致动物的脱水，皱皮以及在出生一天内死亡(Furuse等，2002)。在这些小鼠中，紧蛋白仍然在复层上皮的所有皮层中表达，且密蛋白4集中保持在粒层的第二和第三层。因此在上皮中，密蛋白-1构成了TJ屏障功能的不可缺少的元件。

TJ的最后的内在蛋白为JAM以及三个类JAM蛋白(Palmeri等，2000)。它们属于免疫球蛋白超家族，具有单一的跨膜部分且它们的胞外部分由两倍的免疫球蛋白类似区域组成。JAM看上去不是TJ链的构成成分，因为将其转染到成纤维细胞中不产生纤丝。JAM在紧蛋白和密蛋白的交联以及单核细胞的跨上皮和跨内皮移动中起作用(Martin-Padura等，1998)。

紧密连接的生理学和病理学调控

上皮和内皮处于不同的生理学和病理学环境，这些环境引起TJ密封程度的变化。通过大量的因子诸如钙(Gonzalez-Mariscal等，1990；Martinez-Palomo等，1980)，激素，细胞因子和生长因子，G蛋白和磷脂酶的激活，cAMP和二甘油酯的产生(Balda等，1991)，以及通过不同的激酶进行的TJ蛋白的磷酸化(Avila-Flores等，2001；Balda等，1996a；Sakakibara等，1997)调节TJ通透性的变化。

近年来肠病原体(例如大肠杆菌，鼠伤寒沙门氏菌)以及细菌毒素对TJ的作用已经被确定(Hecht2002。因此，用产气荚膜梭菌肠毒素(CPE)进行的治疗通过从链中特异性除去密蛋白3和4破坏了TJ和TER(Sonoda等，1999)，而血球凝集素和霍乱弧菌的ZOT毒素取决于它们对紧蛋白(Wu等，2000)和PKC(Fasano等，1995)的相应的作用增加了上皮细胞的通透性。从发育的观点来看，用模仿TJ内源性调节物的毒素计数的细菌的优点在于通过穿越上皮细胞屏障它们获得了进入新环境的通道。这些好象是霍乱弧菌的情况，作为调节TJ内源性蛋白最近已被利用产生抗ZOT毒素的抗体鉴定(Fasano 1999；Wang等，2000)。

轮状病毒

轮状病毒是由胃肠炎引起的导致小于2岁的儿童发病和死亡的主要原因。这些Reoviridae家族的病毒具有由RNA的11个双链部分组成的基因组，由三个同中心的蛋白层所包围。最外层是平滑的并由称为VP7的37kDa糖蛋白形成。其中大约60个由称为VP4的88kDa蛋白形成的刺突，向外放射(Estes 1996)。

VP4对于早期的病毒-细胞相互作用是必不可少的，因为其参与受体结合和细胞通透。事实上，轮状病毒的传染性依赖于通过胰蛋白酶将VP4特异性分裂为肽VP5和VP8(Almeida等，1978；Espejo等，1981)。

体内轮状病毒感染只限于回肠微绒毛(Kapikian等，1996)。体外传染性限制较少，如多种肾脏和肠上皮细胞系都易感染轮状病毒(Estes等，1989)。

某些轮状病毒结合于含有唾液酸(SA)的细胞表面受体，而其它的(例如人轮状病毒)不需要SA来进行传染(Fukudome等，1989)。因此结合SA似乎不是轮状病毒感染的必要步骤。此外，与次级的SA独立受体相联可克服特定轮状病毒与SA的最初的交互作用。SA依赖的恒河猴轮状病毒(rhesusrotavirus)(RRV)最初通过VP8结合于细胞(Fiore等，1991；Isa等，1997)，而RRV的变体其不再依赖SA的存在(例如nar3)，通过VP5与细胞相互作用(Zarate等，2000b)。将动物和人来源的包括RRV、其SA独立变体nar3以及人轮状病毒菌株Wa等众多菌株的特征进行比较，表明轮状病毒含有整联蛋白配体序列(Coulson等，1997)(Guerrero等，2000)且α₂β₁整联蛋白被nar3以及RRV在次级相互作用中，在与含有细胞受体的SA初次接触之后，用作初级细胞受体(Zarate等，2000a)。整联蛋白aVβ3被所有的三个轮状病毒菌株用作共同-受体(co-receptor)，在它们最初附着于细胞之后(Guerrero等，2000)。整联蛋白αXβ₂和α₄β₁，也被认为参与轮状病毒的细胞进入(Coulson等，1997；Hewish等，2000)。

除作为病毒的细胞受体之外，整联蛋白构成了介导细胞和胞外基质之间相互作用的αβ杂二聚体的家族。这些相互作用在细胞增殖、移动和分化的调控中起重要的作用。在上皮细胞和内皮细胞中，整联蛋白在基底外侧原生质膜中具有极化的分布和定位。因此，肠的内腔或汇合的上皮细胞系的顶部表面的轮状病毒仅在基底外侧表面具有到它们的整联蛋白受体的通道，如果密封细胞旁侧的TJ是开放的。

因为如在本说明书的开始时所述，本领域需要调节连接的紧密性以及促进药物穿过通透性屏障的化合物，我们开始进行研究轮状病毒蛋白调节TJ密封的能力。本发明完成了这些需求并提供了其它相关的优点。最近，细胞转化已被与特定密蛋白的过量表达相关联(Michl等，2001)。因此，靶向连接蛋白的轮状病毒蛋白及其衍生的肽也可以用于降低肿瘤细胞的生长。

在本发明中，我们用来源于恒河猴轮状病毒(RRV)的VP4分子的蛋白和肽进行研究。轮状病毒感染各种各样的脊椎动物，诸如鸡、马、猪、猴子和人，且已经由相同种类的不同个体中分离到数株病毒。然而，由于不同轮状病毒菌株的大多数中的VP4的氨基酸序列维持高度的同一性，预计不管其来源如何，不同菌株将对TJ起类似的作用。因此，在本发明中，我们进一步是指VP4及其衍生的肽，而不专门强调它们的来源。

发明概述

本发明提供了调节由细胞-细胞粘附介导的紧密连接以及通透性屏障形成的蛋白、肽以及方法。

在本发明的一个方面，为轮状病毒蛋白VP4、其衍生的多肽VP8或由它们衍生的肽在诱导紧密连接开放中的应用。

本发明的另一个方面为轮状病毒蛋白VP4、其衍生的多肽VP8或由它们衍生的肽在增加上皮以及内皮细胞旁侧通透性中的应用。

本发明一个重要的方面，为轮状病毒蛋白VP4、其衍生的多肽VP8或由它们衍生的肽在允许和/或增强治疗剂经由细胞旁侧途径的通过中的应用。

本发明的另外一个方面，为轮状病毒蛋白VP4、其衍生其多肽VP8或由它们衍生的肽在调节和/或增强治疗剂经肠、鼻、眼睛、阴道以及直肠上皮的通过中的应用。

在本发明进一步的一个目的，为轮状病毒蛋白VP4、其衍生的多肽VP8或由它们衍生的肽在允许和/或增强皮肤病药物的通过中的应用。

本发明的另一个方面，为轮状病毒蛋白VP4、其衍生其多肽VP8或由它们衍生的肽在允许和/或增强治疗剂穿过血脑屏障中的应用。

本发明进一步的一个方面，为增强药物传递到哺乳动物的肿瘤中，包括将轮状病毒蛋白VP4、其衍生的多肽VP8或它们衍生的肽、与药物联合给药于患癌症的哺乳动物。

本发明此外提供了含有轮状病毒蛋白vp4、其衍生的多肽vp8或其衍生的肽以及药用载体的药物组合物。此种组合物可进一步包括一种药物。此外，或者，这种组合物可包括一或多种：a)调节紧密和/或粘附连接的肽；和/或b)特异性结合于TJ蛋白的抗体或抗原结合片段。

在另一方面，本发明目的在于提供轮状病毒蛋白VP4、其衍生的多肽VP8或其衍生的肽，在治疗哺乳动物癌症中的应用，其中哺乳动物癌症中的上皮细胞转化与紧密连接蛋白的过量表达有关。

在本发明一个相关的方面，轮状病毒蛋白VP4、其衍生的多肽VP8或其衍生的肽，可通过破坏构成肿瘤生长以及转移出现的前提条件的新微血管的生长用于治疗癌症和/或抑制转移。

在本发明另一个相关方面，蛋白VP4、其衍生的多肽VP8或其衍生的肽可用于减少在肿瘤细胞之间、肿瘤细胞和正常细胞之间、或由于外科手术、损伤、化疗、疾病、炎症或危害细胞活力或功能的其它病症所导致的正常细胞之间的不需要的细胞粘附。

本发明应用的蛋白VP4的优选形式，具有序列ID SEQ.1。

本发明应用的多肽VP8的是另一种优选形式，具有序列ID SEQ.2。

本发明应用的又一优选形式为具有ID SEQ.3的VP8的片段141到182。

141IDVVKTTQNGSYSQYGPLQSTPKLYGVMKHNGKIYTYNGETP₁₈₂

本发明另一优选实施方案是使用一种或者多种下列源于VP4的肽：

肽SEQ.ID 4：₁₄₄VVKT₁₄₇

肽SEQ.ID 5：₁₅₁SYSQYGPL₁₅₈

肽SEQ.ID 6：₁₇₄IYTY₁₇₇

肽SEQ.ID 7：₁₈₃NVTT₁₈₆

这种肽没有限制可以是环状的(在其每个末端包括Cys)或者是线性的。

参考下列详述以及附图，本发明的这些及其它方面将变得更加清楚。

附图说明

图1.病毒蛋白VP8以可逆的方式减少上皮细胞的单层(MDCK)的TER。TER在对照MDCK单层(实心正方形)以及在那些接受4μg/ml VP5(空心正方形)，GST-VP8(实心三角形)或His-VP8(空心三角形)的单层中进行确定。在此及其后的附图中，显示的实验值相应于中值±标准误差。独立测量值的数目显示在每一实验点。

图2.当VP8从培养基撤出时单层恢复其TER。接受4μg/ml GST-VP8的单层显示TER显著的减少(实心三角形)。然而，如果冲洗单层并将其转入不含GST-VP8(箭头)的培养基中时，单层恢复它们的TER。(实心正方形＝培养在不含VP8的培养基中的单层)。

图3.VP8对TER的作用是剂量依赖的。具有0.4(空心圆)，4(实心三角)或10μg/ml(空心三角)GST-VP8的MDCK单层温育显示TER的剂量-依赖的降低。

图4.VP8改变了TJ蛋白ZO-1，紧蛋白和密蛋白-3的模式分布。汇合的MDCK单层培养在具有4μg/ml VP8的培养基中。一个小时后，固定单层并用抗ZO-1、紧蛋白、密蛋白-3的特异性抗体进行免疫荧光处理。

箭头显示对照单层的细胞边缘的ZO-1、紧蛋白和密蛋白-3的清晰分布。在用GST-VP8处理的细胞中，ZO-1在细胞质(箭头)中显示出强烈的免疫反应性，密蛋白-3细胞边界染色在单层的大面积中变得几乎不可检测(箭头)且紧蛋白轮廓鲜明的(clear)染色被细胞边缘(箭头)的扩散和广泛标记所代替。

箭头显示对照单层的细胞边缘的ZO-1、紧蛋白和密蛋白-3的清晰分布。箭头显示ZO-1、紧蛋白和密蛋白-3的弥漫着色似乎靠近VP8处理的单层的细胞边缘。

图5.对用VP8处理的MDCK单层中的TJ进行冷冻-破碎分析。固定有或没有用4μg/ml VP8培养的汇合的MDCK单层并且按照标准方法进行冷冻-破碎处理。(a)显示对照(A)和VP8处理的单层(B)的典型的图像。后者中，在其中网络深远和复杂的(profound and complex)区域之间发现一些松散的末端(箭头)。P＝原生质面；E＝外胞质面；条形图＝200nm。(b)显示了TJ的形态学分析。分别分析对照(浅色条形图)和VP8处理的单层(实心条形图)的1,239和1,124TJ位点。

图6.VP8抑制上皮细胞单层中TER的发展(development)。

通过将在低钙培养基(1-5μM Ca²⁺)中培养的汇合的MDCK单层转入正常的钙培养基(1.8mM Ca²⁺)中来发展它们的TER(实心方块)。如果单层被转入到含有4μg/ml VP5(空心正方形)的正常钙培养基中，抗性发展如在对照环境中的。如果单层被培养在含有4μg/ml VP8(实心三角)的正常钙培养基中，则在TER的发展过程中检测到明显的抑制。

图7.VP8的序列含有一些高度类似于存在于紧蛋白和密蛋白外部环中的片段的区域。(A)VP8序列的有底纹的片段与紧蛋白或密蛋白的胞外环的区域具有≥50％的同一性。紧挨着括号，表示类似蛋白的名称(例如cl2，occl等)。肽VP8_141-182的序列显示在框架内。(B)具有紧蛋白外部环的VP8_150-159和VP8_174-177的序列比较。(C)不同的VP8片段和密蛋白之间的序列比较。VP8中有底纹字母对应的氨基酸与密蛋白中的存在相应的氨基酸相同。所采用的不同密蛋白的序列登录号为：密蛋白1，大鼠，NP113887；密蛋白2，狗，AAK57433；密蛋白3，大鼠，NP113888；密蛋白4，小鼠，NP034033；密蛋白5，大鼠，AAF73425；密蛋白6，小鼠，Q9Z262；密蛋白7，大鼠，CAA09790；密蛋白8，小鼠，Q9Z260；密蛋白9，小鼠，NP064689；密蛋白10，小鼠，Q9Z056；密蛋白11，大鼠，NP445909；密蛋白12，人，XP004591；密蛋白13，小鼠，Q9Z054；密蛋白14，小鼠，NP062373；密蛋白15，小鼠，NP68365；密蛋白16，大鼠，NP571980；密蛋白17，人，P56750；密蛋白18，小鼠，P56857；密蛋白19，小鼠，AAF98323；密蛋白20，人P56880。

图8.添加肽His-VP8_141-182减少上皮细胞单层的TER。用4μg/ml的肽His-VP8_141-182处理的铺满的MDCK单层(实心的三角形)显示与只用His洗脱缓冲液处理的单层相比TER明显减少(实心的正方形。

图9.添加肽VP8_141-182(SEQ ID No.3)抑制了上皮细胞单层中TER的发展。低钙培养基(1-5μM Ca²⁺)中培养的铺满的MDCK单层在转入正常钙培养基(1.8mM Ca²⁺)后发展其TER。如果反之将单层转入含有4μg/ml的肽VP8141-182的正常钙培养基(实心的三角形)，检测到明显抑制TER的发展。

图10.添加肽SEQ.ID.No 7减少上皮细胞单层的TER。铺满的MDCK单层用肽SEQ ID No.4，5，6或7以100或500μg/ml的浓度进行处理。虽然在存在肽SEQ.ID.No 4，5或6时培养的单层显示出类似于对照培养(虚线)的TER，但是用肽No 7处理的单层显示出显著较低的TER(Student-t检验，P＜0.05)。

图11.链脲菌素显著增加了大鼠血糖的浓度。确定从雄性Wistar大鼠眼眶获得的血样的葡萄糖浓度。对接受腹膜内注射链脲菌素(75mg/kg体重)(虚线)或模拟(mock)注射(连续的线)三天后的大鼠进行实验。在此及其后附图中，在隔夜禁食(时间＝0)后或在动物接受膳食后的不同时期采集血样。每一品系对应于一个动物获得的结果。

图12.口服给药胰岛素不降低糖尿病大鼠的血糖浓度。患有链脲菌素诱导的糖尿病的大鼠肠胃外给药胰岛素(Humulin，中效，6IU)降低血糖浓度(连续的线)。相反，当口服给药胰岛素(30IU)时葡萄糖的浓度持续较高(虚线)。

图13.当胰岛素与VP8一起口服给药时，血糖浓度降低。患有链脲菌素诱导的糖尿病的大鼠口服接受VP8(100μg)(虚线)或VP8(100μg)以及胰岛素(30IU)(连续的线)。只有后者的处理，血糖浓度降低。

发明详述

如上所述，本发明涉及轮状病毒蛋白VP4(SEQ.ID No.1)及其功能变体，以及衍生的蛋白VP8(SEQ：ID.No.2)和VP8_141-182SEQ ID No.3)以及源于它们的肽(SEQ ID No.4，5，6以及7)，促进和/或增强药物试剂经由上皮以及内皮通过的应用。

VP4为轮状病毒蛋白。衍生VP4的轮状病毒的具体株系对于本发明不是至关重要的。

本发明包括任意菌株的VP4，其与来源无关，天然的或遗传操作的VP4，VP4的功能变体，只要其保持调节紧密连接密封的能力。

蛋白VP4，VP8或其衍生片段可例如通过单独过量表达其cDNA或与其它基因融合的cDNA的遗传操作的大肠杆菌菌株来获得和纯化，所述其它基因为诸如组氨酸或谷胱甘肽-s-转移酶)。

蛋白VP4，VP8和VP8_141-182可用于产生单克隆或者多克隆抗体，该抗体可利用本领域公知的方法(Abrams等，1986)对紧密连接产生与蛋白VP4，VP8或其衍生的片段和肽相同的作用。

或者，蛋白VP4和VP8可以以全长形式、较短形式、作为融合蛋白形式或者作为衍生的合成的功能肽形式使用。

在本发明另一方面，提供了确定促进或增强TJ开放的蛋白VP4的区域的方法。这种方法利用下列步骤：

A)提取和/或培养上皮或内皮。

B)测定这种上皮/内皮的跨上皮电阻。

C)测定添加来源于轮状病毒蛋白VP4的肽，片段或融合蛋白到上皮/内皮后跨上皮电阻是否降低。

D)任选地，当TJ关闭时，不能穿越细胞旁侧途径的分子或药物(例如甘露糖醇，葡聚糖)可以用于确定细胞旁侧渗漏是否由来源于轮状病毒蛋白VP4的肽，片段或融合蛋白诱导。

本发明使用的″跨上皮电阻的减少”是指由TJ提供的离子和分子经由细胞旁侧途径通过的电阻的减少。

确定蛋白VP4，VP8或其衍生的片段和肽的生物活性的分析对于本发明不是至关重要的。例如，所述分析可以包括(1)分析嵌在Ussing小室中回肠的组织电阻的降低(Fasano等，1991)；(2)分析以下实施例1中所述Ussing小室中上皮细胞系单层的组织电阻的降低；或(3)如美国专利5,827,534和美国专利5,665,389所述分析肠或鼻对药物吸收的增强。

在本发明的另一方面，蛋白VP4，VP8或其衍生的片段和肽可用于治疗癌症，诸如胰腺癌，其中上皮细胞的转化与紧密连接蛋白的过量表达有关(例如，密蛋白-4)(Michl等，2001)。

此外，蛋白VP4，VP8或其衍生的片段和肽可用于通过破坏新毛细管的TJ，治疗癌症和/或抑制转移，所述新毛细管的形成构成肿瘤生长和转移出现的前提条件。

在本发明另一个相关方面，蛋白VP4、其衍生的多肽VP8或它们衍生的肽可用于减少正常细胞之间由于外科手术，损伤，化疗，疾病，炎症或其它危害细胞活力或功能的病症而引起的不需要的细胞粘附。

可通过本领域公知的方法，例如通过实施例1所述的方法获得和纯化蛋白VP4和VP8。

本发明的“功能性肽”或“功能性蛋白”是指来源于VP4的任一多肽，该多肽能够降低跨上皮电阻和/或能够调节TJ结构和/或其分子组分外观。

在本发明的另一方面，药物组合物的特征在于递送治疗性化合物，这种组合物包括：A)治疗剂，和B)增强有效量的蛋白VP4，VP8或其衍生的片段和肽。

药物组合物优选为用于肠递送的口服剂量的组合物，用于鼻递送的鼻用药剂量的组合物或用于通过血脑屏障递送药物的静脉用药剂量的组合物。

用于肠递送口服剂量的组合物含有：C)治疗剂，和D)增强有效量的蛋白VP4，VP8或其衍生的片段和肽，其可以使治疗剂经由肠上皮吸收。

用于小肠递送的口服剂量的组合物是本领域公知的。这种口服剂量组合物可以是溶液，片剂或胶囊的剂型。

在本发明的上下文，口服剂量的组合物包括含有水试剂的液相组合物。在这种组合物中，最好在恰好给药前制备组合物，以便降低本发明蛋白和多肽稳定性的潜在问题。

用于鼻递送治疗剂的鼻用药剂量组合物含有：A)治疗剂；和B)增强有效量鼻吸收的VP4，VP8或其衍生的片段和肽。

用于鼻递送的鼻用药剂量的组合物是本领域公知的。这种鼻用药剂量组合物通常包括已广泛用于制备药物剂型的水溶性聚合物。所使用的特定水溶性聚合物对于本发明不是至关重要的，并且可选自用于鼻剂型的任一水溶性聚合物。

用于经由血脑屏障递送治疗剂的静脉用药剂量的组合物含有：(A)治疗剂；和(B)血脑屏障吸收增强有效量的VP4，VP8或其衍生的片段和肽。

用于递送到脑的静脉用药剂量组合物是本领域公知的。这种静脉用药剂量组合物通常包括生理学稀释剂，例如蒸馏水，或0.9％(w/v)NaCl。

“鼻”递送的组合物不同于“肠”递送的组合物，因为后者已具有胃抵抗特性以防活性剂在胃中的酸性分解(例如VP4，VP8或其衍生的片段和肽和治疗剂)，而前者通常含有水溶性聚合物以便减少粘纤毛的清除，以及获得鼻给药剂的可再生的生物利用率。“静脉”递送组合物不同于“鼻”和“肠”递送组合物，因为在“静脉”递送组合物中不需要胃抵抗或水溶性聚合物。

给药方式对本发明不是至关重要的。尽管，用于肠递送组合物的优选给药方式为口服；用于鼻递送组合物的优选给药方式为鼻内；经由血脑屏障递送的优选给药方式为静脉内。

所使用的具体治疗剂对于本发明不是至关重要的，并且可以为例如任一药物化合物，生物学活性肽，疫苗或不是经由跨细胞途径(transcellularpathway)吸收的任一其它部分，不管大小或电荷情况。

可以用于本发明的药物化合物的实例包括作用于心血管系统的药物，作用于中枢神经系统的药物，抗肿瘤药以及抗生素。

可以用于本发明的作用于心血管系统的药物实例包括利多卡因(lidocarine)，腺苷，多巴酚丁胺(dobutamine)，多巴胺，肾上腺素，去甲肾上腺素以及酚妥拉明(phentolamine)。

可以用于本发明的作用于中枢神经系统的药物的实例包括吗乙苯吡酮(doxapram)，阿芬太尼(alfentanil)，地佐辛(dezocin)，纳布啡(nalbuphine)，丁丙诺啡(buprenorphine)，纳洛酮(naloxone)，酮咯酸(ketorolac)，咪达唑仑(midazolam)，propofol，metacurine，mivacurium以及琥珀酰胆碱。

可用于本发明的抗肿瘤药的实例包括阿糖胞苷，丝裂霉素，亚德利亚霉素(doxorubicin)，长春新碱以及长春花碱。

可用于本发明的抗生素的实例包括2，6-二甲氧基苯青霉素(methicillin)，美洛西林(mezlocillin)，哌拉西林(piperacillin)，cetoxitin，头孢尼西(cefonicid)，头孢美唑(cefmetazole)以及氨曲南(aztreonam)。

可用于本发明的生物学活性肽的实例包括激素，淋巴因子，球蛋白以及白蛋白。

可用于本发明的激素的实例包括睾丸激素，nandrolene，促生育素(menotropins)，黄体酮，胰岛素以及urofolltropin。

可用于本发明的淋巴因子的实例包括干扰素-α，干扰素-β，干扰素-γ，白介素-1，白介素-2，白介素-4以及白介素-8。

可用于本发明的球蛋白的实例包括α-球蛋白，β-球蛋白以及γ球蛋白(免疫球蛋白)。

可用于本发明的免疫球蛋白的实例包括多价IgG或特异性IgG，IgA以及IgM，例如抗-破伤风抗体。

可用于本发明的白蛋白实例为人血清白蛋白以及卵清蛋白。

可用于本发明的疫苗的实例包括肽抗原以及减毒的微生物以及病毒。

可用于本发明的肽抗原的实例包括肠毒性大肠杆菌热不稳定肠毒素的B亚基，霍乱菌毒素的B亚基，肠病原体的荚膜抗原，肠病原体的伞毛(fimbriae)或菌毛(pili)，HIV表面抗原，尘埃过敏原以及阿卡鲁过敏原(acari allergen)。

可用于本发明的减毒的微生物以及病毒的实例包括肠毒性大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli)，肠道病源性大肠杆菌(enteropathogenicEscherichia coli)，霍乱弧菌，弗氏志贺菌(shigella flexneri)，伤寒沙门氏菌，以及幽门螺旋菌。

当治疗剂为胰岛素时，本发明的药物组合物可用于治疗糖尿病。

所使用的治疗剂的量对于本发明不是至关重要的，并且将根据所选的特定药物，被治疗的疾病或病症，以及被治疗受试者的年龄，体重和性别而改变。

所使用的VP4，VP8或其衍生的片段和肽的量对于本发明不是至关重要的，并且将根据被治疗受试者的年龄，体重和性别而改变。

所使用的治疗剂与VP4，VP8或其衍生的片段和肽的比例对于本发明不是至关重要的，并且将根据在所选定时间段内被递送的治疗剂的量而改变。

下列实施例通过例示而非限制的方式提供。

实施例1

轮状病毒蛋白VP8对上皮细胞单层的密封程度的作用

此实施例举例说明用于评价轮状病毒蛋白对跨上皮电阻的作用的试验。

A)VP8克隆

根据以前的描述将RRV VP8片段(VP4基因核苷酸1到750)克隆在pGEX-4T-1(Pharmacia)和pET-6HIS质粒中(Dowling等，2000；Isa等，1997)。

B)VP5克隆

根据以前的描述将RRV VP5片段(VP4基因核苷酸749到2347)克隆在pGEX-4T-2(Pharmacia)中(Zarate等，2000b)。

C)融合蛋白的表达、纯化和给药

按照以前描述的标准方法表达和纯化融合蛋白(Frangioni等，1993)。为将其应用于实验，融合蛋白VP5和VP8溶于新鲜的Dulbecco′s最低要求培养基(DMEM)中以及通过经由0.22μm过滤装置灭菌。

D)细胞培养

如以前的描述培养MDCK细胞(Gonzalez-Mariscal等，1990)并用于70-90区段之间的实验。

E)跨上皮电阻的测定

通过测定穿越单层的跨上皮电阻(transepithelial electricalresistance)(TER)评价紧密连接的密封程度。标准方法如下(Gonzalez-Mariscal等，1990)。简要地，将生长在微孔过滤器上的单层设置在具有0.23cm2暴露区域的两个Lucite小室之间。通过安置在距单层2.0cm处的Ag-AgCI电极输送电流；用置于膜1.0mm处的第二套电极测定引起的电压偏转。如果减去过滤器和电解液的影响，所有报道的值仅仅对应于单层。每一平皿用于单个的测定。

图1显示了添加4μg/ml的VP8-GST或VP8-His，而不是4μg/ml的VP5-GST，在处理30分钟后显著地减少上皮细胞单层的TER。VP8对单层电阻的作用随时间变得可逆(reversible)。为进一步说明后者，我们进行另一个试验，其中从培养基中去除GST-VP8。在图2中观察到在这些单层中，单层的TER如何被恢复。

图3显示了VP8对TER的作用是剂量依赖的。

实施例2

VP8改变了TJ蛋白的细胞边缘分布。

此实施例举例说明了用于评价vp8对TJ蛋白分布的作用的试验。

A)TJ蛋白的免疫定位。

在玻璃盖玻片中培养MDCK细胞。将铺满的培养物暴露于4μg/ml的GST-VP8一个小时。用2％p-甲醛的pH 7.4，PBS溶液固定细胞30分钟，并用0.2％-TX渗透3分钟。

用PBS冲洗细胞5次，然后用不含Ig的1％BSA阻断30分钟(ResearchOrganics 1331-a)。在4℃与兔抗ZO-1(Zymed 61-7300，稀释1∶100)，密蛋白3(Zymed 34-1700，稀释3μg/ml)或紧蛋白(Zymed 71-1500，在1％的无Ig的BSA稀释1∶100)的多克隆抗体一起隔夜培养单层。用PBS冲洗5次后，在室温下将盖玻片与第二抗体(FITC-共轭的山羊抗-兔，目录号：65-6111，稀释1∶100，Zymed)一起培养1小时。在用抗衰减试剂(antifade reagent)Vectashield(Vector Laboratories Inc.)固定之前，将单层在PBS中冲洗5次。

利用具有氪-氩激光器的共焦显微镜(MRC-600，Bjo-Rad)检验单层的荧光。

图4.显示了对照单层(箭头)的邻近细胞之间的侧膜上的ZO-1，密蛋白-3和紧蛋白的显著的环状结构。在对照条件中，密蛋白-3也在细胞质中产生扩散的染色。在GST-VP8处理的单层中，ZO-1在细胞质中(箭头)显示出强烈的免疫活性。密蛋白-3的蜂巢状排布通过近似缺少侧面染色(lateral staining)(箭头)的大范围的形状被改变，紧蛋白标记的单层显示在细胞边缘(箭头)显示出广泛的和扩散的染色。这些结果证实VP8改变了这些TJ组分的分布。

实施例3

VP8对TJ的冰冻破碎外观(freeze fracture appearance)的作用。

此实施例说明了TJ纤丝的模式如何通过VP8被改变。

A)TJ蛋白的冰冻破碎(Freeze fracture)分析。

将MDCK细胞的汇合单层与4μg/ml的溶于DMEM中的GST-VP8一起培养一小时，而对照单层保留在DMEM中。

从用2.5％戊二醛固定30分钟并用高达20％浓度的甘油逐渐渗透的单层获得冷冻-破碎的复制品(Freeze-fracture replicas)，其中在单层渗透时放置1小时。然后从基质(substrate)分离单层并在液氮中冷冻。在-120℃和2×10^-6mmHg下利用Balzers装置(BAF400T)进行冰冻破碎。

蒸发铂和碳之后，在铬混合物中降解有机物质1个小时。在蒸馏水中仔细冲洗复制品并安置在聚醋酸甲基乙烯脂涂敷的栅格(Formvar coated grids)中。在电子显微镜JEOL 200EX中进行观察。

为评价TJ链模式中的改变，我们计算垂直于连接(junction)主轴的截取线的链的数目，每48nm，以及上部和最低链之间的距离。分别分析对照和VP8处理的59和54μm的TJ网络(network)。

如先前报道的(Gonzalez-Mariscal等，1985)，通过下述的函数定义连接的量：

x

TJ的量＝∑ni％i

n＝1

其中ni为TJ区段中的链的数目，且％为样品中存在的链的数的百分比。

总连接宽度定义为：

x

总连接宽度＝∑ni％i

n＝1

其中ni为TJ区段中的上部的和最低纤丝之间的距离，且％i为样品中的所述宽度存在的百分比。

图5A显示MDCK细胞的典型的TJ冰冻破碎模式。TJ被区分为互补于E面上凹槽的原生质膜的P面中的交联纤丝的网络。VP8处理诱导垂直于TJ纤丝网络的松散末端的出现。

主要的TJ轴的排列也是较简单的，因为纤丝失去了它们的互联外形。图5B中的图像例证了VP8处理的单层中观察到的TJ模式。

图5的较低部分(lower panel)的形态度量学分析，显示TJ链数目的分布以及对照和VP8处理的单层之间的连接总数都没有变化。然而，对连接宽度进行的分析，很显然在VP8处理的单层中出现非常深远的(profound)连接(950到1800nm)。这一变化是由于垂直于主要连接轴的VP8处理单层中的松散末端的频繁的出现(松散末端的数目/VP8处理单层中0.32μm的连接相对于对照单层中0.17μm的连接的线性量)。在VP8处理细胞的TJ模式中的这些变化，可解释这些单层中观察到的减小的TER。

实施例4

VP8对TJ装配的作用

此实施例举例说明了评价VP8对TJ蛋白形成的作用的上皮试验。

A)评价TJ装配的钙-开关试验

利用Ca²⁺开关试验评价VP8抑制TJ发展(development)的能力(Gonzalez-Mariscal等，1990)。将细胞铺板在微孔过滤器上并在DMEM中培养1小时(标准的钙培养基，NC；1.8mM Ca²⁺)。然后，用无Ca²⁺的PBS冲洗产生的单层三次并转入到不含Ca²⁺的最低要求培养基(低钙培养基，LC；1-5μM Ca²⁺)中。20小时后，将实验单层转入到含有4μg/ml GST-VP8或GST-VP5的LC培养基中，溶解在LC培养基中，而对照单层再次在LC培养基中温育。30分钟之后，实验单层转入含有4μg/ml的GST-VP8或GST-VP5的NC培养基中。对照单层改为NC培养基。在单层转入NC培养基后，在不同时间点测定TER。

图6显示了添加4μg/ml的GST-VP8而不是GST-VP5是如何延缓钙-开关试验中上皮细胞的细胞旁侧屏障(epithelial paracellular barrier)的发展。

实施例5

VP8衍生的蛋白和肽调节组织通透性。

此实施例举例说明选择可增强或调节TJ开放的VP8区域的方法。

A)鉴定VP8中存在类似TJ蛋白紧蛋白和密蛋白的胞外环的区域。我们比较轮状病毒蛋白VP8与紧蛋白和密蛋白1到20的外部环的氨基酸序列。我们观察到在一些区段中存在≥50％的相似性。观察结果显示为图7A中的带阴影的序列。然后我们显示了VP8的这些序列在不同种类来源的紧蛋白的胞外环中的保守情况(图7B)，以及在不同的密蛋白中(图7C)的保守情况。

B)由含有一些类似于密蛋白和紧蛋白的胞外环区域的VP8区域产生His融合蛋白VP8_141-182。含有氨基酸141-182(SEQ ID No.3)的VP8区域被选择，因为其含有一些类似于紧蛋白和密蛋白中存在的区域的区域。利用pET-6HIS质粒构建组氨酸融合蛋白，并根据标准方法进行表达和纯化(Dowling等，2000)。

C)合成VP8中存在的一些肽，其中的肽与密蛋白和紧蛋白的胞外环具有≥50％的相似性。肽SEQ ID No.4：₁₄₄VVKTT₁₄₈，SEQ ID No.5：₁₅₁SYSQYGPL₁₅₈，SEQ ID No.6：₁₇₄IYTY₁₇₇，以及SEQ ID No.7：₁₈₃NVTT₁₈₆由American Peptide Company，Inc.合成，通过在每一肽的氨基和羧基末端添加半胱氨酸残基形成的环状形式具有超过80％的纯度。

D)评价融合蛋白VPS_141-182对组织通透性的作用的试验。对穿越上皮细胞单层的TER的测定如实施例1所述。

图8显示添加4μg/ml的VP8141-182(SEQ ID No.3)显著减少MDCK单层的TER。

图9证明在钙切换试验中添加4μg/毫升的VP8_141-182(SEQ ID No.3)抑制上皮细胞旁侧细胞屏障的发展。

图10列举了添加SEQ ID No.7：₁₈₃NVTT₁₈₆的肽显著减少MDCK单层的TER。相反，给药SEQ ID No.4：₁₄₄VVKT₁₄₇；5：₁₅₁SYSQYGPL₁₅₈和6：₁₇₄IYTY₁₇₇对于单层电阻无作用。

实施例6

VP8对口服给药胰岛素给糖尿病大鼠的作用。

此实施例举例说明用于评价VP8对口服给药胰岛素的作用的试验。

A)糖尿病大鼠的制备

将雄性Wistar大鼠(230-250gr.)在畜舍(温度22到24℃，50到55％湿度)中培养于通过照射灭菌并不限量给水的PicoLabRodent Diet 20上。根据国际推荐的方法管理和处理动物。

I型糖尿病用腹腔内注射稀释在pH 4.5的柠檬酸盐缓冲液0.1M(Sigma，商品目录号S4641)中的链脲菌素(75mg/Kg重量；Sigma，商品目录No.S0130)进行诱导。在使用之前制备链脲菌素溶液且避光保存。

B)测定血液中葡萄糖的浓度。

利用肝素化毛细管(Chase Scientific Glass Inc.Cat.No.2501)，从大鼠的眼眶凹处采集一滴血液。利用反应性的条带(One Touch，LIFESCAN，Johnson&Johnson)和市售的糖度计(One Touch Basic Plus，LIFESCAN，Johnson&Johnson)确定血糖浓度。对健康动物以及已经在试验前至少3天接受链脲菌素腹腔内注射的动物确定葡萄糖浓度。

图11说明链脲菌素处理如何显著地增加处理的动物血液中葡萄糖的水平。

C)向糖尿病大鼠给药胰岛素。

为了研究通过给药胰岛素产生的葡萄糖浓度的改变，从已经隔夜禁食的糖尿病动物收集第一血样。动物接受食物(Lab Diet 5053)后立即，以及30分钟以后根据下列流程进行处理：1)中效作用的人胰岛素(3-6IU/大鼠；HumulinN，HI-310，Lilly)通过肠胃外给药。2)经由食管大鼠套管口服给药在400μl NaHCO₃(1.5g/100ml，pH 8.3-8.4)中的中效作用(15-30IU/大鼠；HumulinN，HI-310，Lilly)的人胰岛素(Fine Science Tools；商品目录号18061-75)以中和胃酸度。3)使用食管大鼠套管，口服给药于400μl NaHCO₃(1.5g/100ml，pH 8.3-8.4)溶液中的100μg的GST-VP8以及中效作用(intermediate action)的人胰岛素(15-30IU/大鼠；HumulinN，HI-310，Lilly)。4)将100μg的GST-VP8经由食管大鼠套管进行口服给药。开始每一上述操作后在不同时间测定血糖的水平。

图12显示口服给药胰岛素与肠胃外给药胰岛素相反没有减少糖尿病大鼠的血糖浓度。

图13显示口服胰岛素连同VP8，糖尿病大鼠的血糖浓度显著减少。

参考文献目录

1.Abrams，P.G.，Rossio，J.L.，Stevenson，H.C.，Foon，K.A.，1986.Optimal strategies for developing human-human monoclonal antibodies.MethodsEnzymol.121，107-119.

2.Al Moustafa，A.E.，Alaoui-Jamali，M.A.，Batist，G.，Hernandez-Perez，M.，Serruya，C.，Alpert，L.，Black，M.J.，Sladek，R.，Foules，W.D.，2002.Identification of genes associated with head and neck carcinogenesis bycDNAmicroarray comparison between matched primary normal epithelial andsquamous carcinoma cells.Oncogene.21，2634-2640.

3.Almeida，J.D.，Hall，T.，Banatvala，J.E.，Totterdell，B.M.，Chrystie，I.L.，1978.The effect of trypsin on the growth of rotavirus.J.Gen.Virol.40，213-218.Avila-Flores，A.，Rendon-Huerta，E.，Moreno，J.，Islas，S.，Betanzos，A.，Robles-Flores，M.，Gonzalez-Mariscal，L.，2001.Tight-junctionproteinzonula occludens 2 is a target of phosphorylation by protein kinase C.Biochem.J.360，295-304.

 4.Balda，M.S.，Anderson，J.M.，Matter，K.，1996a.The SH3 domain ofthe tight junction protein ZO-1 binds to a serine protein kinase thatphosphorylatesa region C-terminal to this domain.FEBS Lett.399，326-332.

 5.Balda，M.S.，Gonzalez-Mariscal，L.，Contreras，R.G.，Macias-Silva，M.，Torres-Marquez，M.E.，Garcia-Sainz，J.A.，Cereijido，M.，1991.Assembly andsealing of tight junctions：possible participation of G-proteins，phospholipase C，protein kinase C and calmodulin.J.Membr.Biol.122，193-202.

 6.Balda，M.S.Matter，K.，2000.The tight junction protein ZO-1 and aninteracting transcription factor regulate ErbB-2 expression，EMBO J.19，2024-2033.

 7.Balda，M.S.，Whitney，J.A.，Flores，C.，Gonzalez，S.，Cereijido，M.，Matter，K.，1996b.Functional dissociation of paracellular permeability andtransepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateralintramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junctionmembrane protein.J.Cell Biol.134，1031-1049.

8.Bamforth，S.D.，Kniesel，U.，Wolburg，H.，Engelhardt，B.，Risau，W.，1999.A dominant mutant of occludin disrupts tight junction structure andfunction.J.Cell Sci.112(Pt 12)，1879-1888.

9.Blanchard，A.，Jeunemaitre，X.，Coudol，P.，Dechaux，M.，Froissart，M.，May，A.，Demontis，R.，Fournier，A.，Paillard，M.，Houiller，P.，2001.Paracellin-1is critical for magnesium and calcium reabsorption in the humanthick ascending limb of Henle.Kidney Int.59，2206-2215.

10.Cereijido，M.，Valdes，J.，Shoshani，L.，Contreras，R.G.，1998.Roleof tight junctions in establishing and maintaining cell polarity.Annu.Rev.Physio.60，161-177.

11.Citi，S.，Sabanay，H.，Jakes，R.，Geiger，B.，Kendrick-Jones，J.，1988.Cingulin，a new peripheral component of tight junctions.Nature.333，272-276.

12.Claude，P.，1978.Morphological factors influencing transepithelialpermeability：a model for the resistance of the zonula occludens.J.Membr.Biol.39，219-232.

13.Coulson，B.S.，Londrigan，S.L.，Lee，D.J.，1997.Rotaviruscontains integrin ligand sequences and a disintegrin-like domain that areimplicated in virus entry into cells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94，5389-5394.

14.Dowling，W.，Denisova，E.，LaMonica，R.，Mackow，E.R.，2000.Selective membranepermeabilization by the rotavirus VP5^*protein is abrogatedby mutations in an internal hydrophobic domain.J.Virol.74，6368-6376.

15.Enck，A.H.，Berger，U.V.，Yu，A.S.，2001.Claudin-2 is selectivelyexpressed in proximal nephron in mouse kidney.Am.J.PhysiolRenal Physiol.281，F966-F974.

16.Espejo，R.T.，Lopez，S.，Arias，C.，1981.Structural polypeptides ofsimian rotavirusSA11 and the effect of trypsin.J.Virol.37，156-160.

17.Estes，M.K.，1996.Rotaviruses and their replication.In：Fields，B.N.，Knipe，D.N.，Howley，P.M.，Chanock，R.M.，Melnick，J.L.，Monath，T.P.，Roizman，B.，and Straus，S.E.(Eds.)，Fields Virology.New York，pp.1625-1655.

18.Estes，M.K.Cohen，J.，1989.Rotavirus gene structure and function.Microbiol.Rev.53，410-449.

19.Fasano，A.，1999.Substancially  purezonulin，a  physiologicalmodulator of mammalian tight junctions.859931，Fasano，A.，Baudry，B.，Pumplin，D.W.，Wasserman，S.S.，Tall，B.D.，Ketley，J.M.，Kaper，J.B.，1991.Vibriocholerae produces a second enterotoxin，which affects intestinal tightjunctions.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88，5242-5246.

20.Fasano，A.，Fiorentini，C.，Donelli，G.，Uzzau，S.，Kaper，J.B.，Margaretten，K.，Ding，X.，Guandalini，S.，Comstock，L.，Goldblum，S.E.，1995.Zonula occludens toxin modulates tight junctions through protein kinaseC-dependent actin reorganization，in vitro.J.Clin.Invest.96，710-720.

21.Fiore，L.，Greenberg，H.B.，Mackow，E.R.，1991.The VP8 fragmentof VP4 is the rhesus rotavirushemagglutinin.Virology.181，553-563.

22.Frangioni，J.V.Neel，B.G.，1993.Solubilization and purification ofenzymatically active glutathione S-transferase(pGEX)fusion proteins.Anal.Biochem.210，179-187.

23.Fukudome，K.，Yoshie，O.，Konno，T.，1989.Comparison of human，simian，and bovine rotaviruses for requirement of sialic acid inhemagglutinationand cell adsorption.Virology.172，196-205.

24.Furuse，M.，Furuse，K.，Sasaki，H.，Tsukita，S.，2001.Conversion ofzonulae occludentes from tight to leaky strand type by introducing claudin-2 intoMadin-Darby canine kidney I cells.J.Cell Biol.153，263-272.

25.Furuse，M.，Hata，M.，Furuse，K.，Yoshida，Y.，Haratake，A.，Sugitani，Y.，Noda，T.，Kubo，A.，Tsukita，S.，2002.Claudin-based tight junctions arecrucial for the mammalian epidermal barrier：a lesson fromclaudin-l-deficientmice.J.CellBiol.156，1099-1111.

26.Furuse，M.，Hirase，T.，Itoh，M.，Nagafuchi，A.，Yonemura，S.，Tsukita，S.，Tsukita，S.，1993.Occludin：a novel integral membrane proteinlocalizing at tight junctions.J.Cell Biol.123，1777-1788.

27.Furuse，M.，Sasaki，H.，Tsukita，S.，1999.Manner of interaction ofheterogeneous claudin species within and between tight junction strands.J.CellBiol.147，891-903.

28.Gonzalez-Mariscal，L.，Avila-Flores，A.，Betanzos，A.，2001.Therelationship between structure and function of tight junctions.In：Cereijido，M.，Anderson，J.M.(Eds.)，Tight Junctions.Boca Raton，pp.89-119.

29.Gonzalez-Mariscal，L.，Betanzos，A.，Avila-Flores，A.，2000.MAGUKproteins：structure and role in the tight junction.Semin.Cell Dev.Biol.11，315-324.

30.Gonzalez-Mariscal，L.，Chavez，D.R.，Cereijido，M.，1985.Tightjunction formation in cultured epithelial cells(MDCK).J.Membr.Biol.86，113-125.

31.Gonzalez-Mariscal，L.，Contreras，R.G.，Bolivar，J.J.，Ponce，A.，Chavez，

D.R.，Cereijido，M.，1990.Role of calcium in tight junction formation betweenepithelial cells.Am.J.Physio.259，C978-C986.

32.Goodenough，D.A.Wong，V.，1999.Paracellular channels !Science.285，62.

33.Gue.rrero，C.A.，Mendez，E.，Zarate，S.，Isa，P.，Lopez，S.，Arias，C.F.，2000.

34.Integrin alpha (v)beta (3)mediates rotavirus cell entry.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97，14644-14649.

35.Hamazaki，Y.，Itoh，M.，Sasaki，H.，Furuse，M.，Tsukita，S.，2002.Multi-PDZ domain protein 1(MUPP1)is concentrated at tight junctionsthrough its possible interaction with claudin-1 and junctional adhesion molecule.J.Biol.Chem.277，455-461.

36.Hecht，G.，2002.Microbial Pathogens that affect tight junctions.In：Cereijido，M.，Anderson，J.M.(Eds.)，Tight Junctions.Boca Raton，pp.493-515.

37.Hellani，A.，Ji，J.，Mauduit，C.，Deschildre，C.，Tabone，E.，Benahmed，M.，2000.

38.Developmental and hormonal regulation of the expression ofoligodendrocyte-specific protein/claudin 11 in mouse testis.Endocrinology.141，3012-3019.

39.Hewish，M.J.，Takada，Y.，Coulson，B.S.，2000.Integrins alpha2betalandalpha4betal can mediateSAll rotavirus attachment and entry into cells.J.Virol.74，228-236.

40.Hoevel，T.，Macek，R.，Mundigl，O.，Swisshelm，K.，Kubbies，M.，2002.Expression and targeting of the tight junction protein CLDN1 inCLDN1-negative human breast tumor cells.J.Cell Physiol.191，60-68.

41.Huber，D.，Balda，M.S.，Matter，K.，2000.Occludin modulatestransepithelial migration ofneutrophils.J.Biol.Chem.275，5773-5778.

42.Isa，P.，Lopez，S.，Segovia，L.，Arias，C.F.，1997.Functional andstructural analysis of the sialic acid-binding domain of rotaviruses.J.Virol.71，6749-6756.

43.Izumi，Y.，Hirose，T.，Tamai，Y.，Hirai，S.，Nagashima，Y.，Fujimoto，T.，Tabuse，Y.，Kemphues，K.J.，Ohno，S.，1998.An atypical PKC directlyassociates and colocalizes at the epithelial tight junction with ASIP，a mammalianhomologue of Caenorhabditis elegans polarity protein PAR-3.J.Cell Biol.143，95-106.

44.Kachar，B.Reese，T S.，1982.Evidence for the lipidic nature of tightjunction strands.Nature.296，464-466.

45.Kapikian，A.Z.Chanock，R.M.，1996.Rotaviruses.In：Fields，B.N.，Knipe，D.N.，Howley，P.M.，Chanock，R.M.，Melnick，J.L.，Monath，T.P.，Roizman，B.，and Straus，S.E.(Eds.)，Virology.New York，pp.1657-1708.

46.Kawabe，H.，Nakanishi，H.，Asada，M.，Fukuhara，A.，Morimoto，K.，Takeuchi，M.，Takai，Y.，2001.Pilt，a novel peripheral membrane protein attight junctions in epithelial cells.J.Biol.Chem.276，48350-48355.

47.Keon，B.H.，Schafer，S.，Kuhn，C.，Grund，C.，Franke，W.W.，1996.Symplekin，a novel type of  tight junction plaque protein.J.CellBiol.134，1003-1018.

48.Kiuchi-Saishin，Y.，Gotoh，S.，Furuse，M.，Takasuga，A.，Tano，Y.，Tsukita，S.，2002.Differential expression patterns of claudins，tight junctionmembrane proteins，in mouse nephron segments.J.Am.Soc.Nephrol.13，875-886.

49.Kojima，S.，Rahner，C.，Peng，S.，Rizzolo，L.J.，2002.Claudin 5istransiently expressed during the development of the retinal pigment epithelium.J.Membr.Biol.186，81-88.

50.Kramer，F.，White，K.，Kubbies，M.，Swisshelm，K.，Weber，B.H.，2000.Genomic organization of claudin-1 and its assessment in hereditary andsporadic breast cancer.Hum.Genet.107，249-256.

51.Lacaz-Vieira，F.，Jaeger，M.M.，Farshori，P.，Kachar，B.，1999.Small synthetic peptides homologous to segments of the first external loop ofoccludin impair tight junction resealing.J.Membr.Biol.168，289-297.

52.Martin-Padura，I.，Lostaglio，S.，Schneemann，M.，Williams，L.，Romano，M.，Fruscella，P.，Panzeri，C.，Stoppacciaro，A.，Ruco，L.，Villa，A.，Simmons，D.，Dejana，E.，1998.Junctional adhesion molecule，a novel memberof the immunoglobulin superfamily that distributes atintercellular junctions andmodulates monocyte transmigration.J.Cell Biol.142，117-127.

53.Martinez-Palomo，A.，Meza，I.，Beaty，G.，Cereijido，M.，1980.Experimental modulation of occluding junctions in a cultured transportingepithelium.J.Cell Biol.87，736-745.

54.McCarthy，K.M.，Skare，I.B.，Stankewich，M.C.，Furuse，M.，Tsukita，S.，Rogers，R.A.，Lynch，R.D.，Schneeberger，E.E.，1996.Occludin isa functional component of the tight junction.J.Cell Sci.109(Pt 9)，2287-2298.

55.Medina，R.，Rahner，C.，Mitic，L.L.，Anderson，J.M.，Van Itallie，C.M.，2000.

56.Occludin localization at the tight junction requires the secondextracellular loop.J.Membr.Biol.178，235-247.

57.Michl，P.，Buchholz，M.，Rolke，M.，Kunsch，S.，Lohr，M.，McClane，B.，Tsukita，S.，Leder，G.，Adler，G.，Gress，T.M.，2001.

58.Reyes，J.L.，Lamas，M.，Martin，D.，Namorado，M.C.，Islas，S.，Luna，J.，Tauc，M.，Gonzalez-Mariscal，L.，2002.The renal segmentaldistribution of claudins changes with development.Kidney International.62，

59.Saitou，M.，Ando-Akatsuka，Y.，Itoh，M.，Furuse，M.，Inazawa，J.，Fujimoto，K.，Tsukita，S.，1997.Mammalian occludin in epithelial cells：itsexpression and subcellular distribution.Eur.J.Cell Biol.73，222-231.

60.Saitou，M.，Fujimoto，K.，Doi，Y.，Itoh，M.，Fujimoto，T.，Furuse，M.，Takano，H.，Noda，T.，Tsukita，S.，1998.Occludin-deficient embryonic stemcells can differentiate into polarized epithelial cells bearing tight junctions.J.CellBiol.141，397-408.

61.Saitou，M.，Furuse，M.，Sasaki，H.，Schulzke，J.D.，Fromm，M.，Takano，H.，Noda，T.，Tsukita，S.，2000.Complex phenotype of mice lackingoccludin，a component of tight junction strands.Mol.Biol.Cell.11，4131-4142.

62.Sakakibara，A.，Furuse，M.，Saitou，M.，Ando-Akatsuka，Y.，Tsukita，S.，1997.

63.Possible involvement of phosphorylation of occludin in tight junctionformation.J.Cell Biol.137，1393-1401.

64.Simon，D.B.，Lu，Y.，Choate，K.A.，Velazquez，H.，Al Sabban，E.，Praga，M.，Casari，G.，Bettinelli，A.，Colussi，G.，Rodriguez-Soriano，J.，McCredie，D.，Milord，D.，Sanjad，S.，Lifton，R.P.，1999.Paracellin-1，a renaltight junction protein required for paracellular Mg²⁺ resorption.Science.285，103-106.

65.Sonoda，N.，Furuse，M.，Sasaki，H.，Yonemura，S.，Katahira，J.，Horiguchi，Y.，Tsukita，S.，1999.Clostridium perfringens enterotoxin fragmentremoves specific claudins from tight junction strands：Evidence for directinvolvement of claudins in tight junction barrier.J.Cell Biol.147，195-204.

66.Tsukita，S.，Furuse，M.，Itoh，M.，2001.Multifunctional strands intight junctions.Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2，285-293.

67.Turksen，K.Troy，T.C.，2001.Claudin-6：a novel tight junctionmolecule isdevelopmentally regulated in mouse embryonic epithelium.Dev.Dyn.222，292-300.

68.Van Itallie，C.，Rahner，C.，Anderson，J.M.，2001.Regulatedexpression of claudin-4 decreasesparacellular conductance through a selectivedecrease in sodium permeability.J.Clin.Invest.107，1319-1327.

69.Vietor，I.，Bader，T.，Paiha，K.，Huber，L.A.，2001.Perturbation ofthe tight junction permeability barrier by occludin loop peptides activatesbeta-catenin/TCF/LEF-mediated transcription.EMBO Rep.2，306-312.

70.Wang，W.，Uzzau，S.，Goldblum，S.E.，Fasano，A.，2000.Humanzonulin，a potential modulator of intestinal tight junctions.J.Cell Sci.113Pt 24，4435-4440.

71.Wu，Z.，Nybom，P.，Magnusson，K.E.，2000.Distinct effects ofVibriocholeraehaemagglutinin/protease on the structure andlocalization of thetight junction-associated proteins occludin and ZO-1.Cell Microbiol.2，11-17.

72.Yamamoto，T.，Harada，N.，Kano，K.，Taya，S.，Canaani，E.，Matsuura，Y.，

Mizoguchi，A.，Ide，C.，Kaibuchi，K.，1997.The Ras target AF-6 interacts withZO-1 and serves as a peripheral component of tight junctions in epithelial cells.J.Cell Biol.139，785-795.

73.Zahraoui，A.，Joberty，G.，Arpin，M.，Fontaine，J.J.，Hellio，R.，Tavitian，A.，Louvard，D.，1994.A small rab GTPase is distributed in cytoplasmicvesicles in non polarized cells but colocalizes with the tight junction markerZO-1in polarized epithelial cells.J.Cell Biol.124，101-115.

74.Zarate，S.，Espinosa，R.，Romero，P.，Guerrero，C.A.，Arias，C.F.，Lopez，S.，2000a.Integrin alpha2betal mediates the cell attachment of therotavirus neuraminidase-resistant variant nar3.Virology.278，50-54.

75.Zarate，S.，Espinosa，R.，Romero，P.，Mendez，E.，Arias，C.F.，Lopez，S.，2000b.The VP5 domain of VP4can mediate attachment ofrotaviruses to cells.J.Virol.74，593-599.

76.Zhong，Y.，Saitoh，T.，Minase，T.，Sawada，N.，Enomoto，K.，Mori，M.，1993.

77.Monoclonal antibody 7H6 reacts with a novel tightjunction-associated protein distinct from ZO-1，cingulin and ZO-2.J.Cell Biol.120，477-483.

                          序列表

SEQ.ID.NO：1(VP4恒河猴轮状病毒)(Rhesus Monkey Rotavirus)

1 MASLIYRQLL TNSYTVDLSD EIQEIGSTKT QNVTINLGPF AQTGYAPVNWGPGETNDSTT

61 VEPVLDGPYQ PTSFNPPVDY WMLLAPTAAG VVVEGTNNTD RWLATILVEPNVTSETRSYT

121 LFGTQEQITI AYASQTQWKF IDWKTTQNG SYSQYGPLQS TPKLYAVMKHNGKIYTYNGE

181 TPNVTTKYYS TTNYDSVNMT AFCDFYIIPR EEESTCTEYI NNGLPPIQNTRNIVPLALSA

241 RNIISHRAQA NEDIVVSKTS LWKEMQYNRD ITIRFKFASS IVKSGGLGYKWSEISFKPAN

301 YQYTYTRDGE DVTAHTTCSV NGMNDFNFNG GSLPTDFIIS RYEVIKENSYVYVDYWDDSQ

361 AFRNMVYVRS LAANLNSVIC TGGDYSFALP VGQWPVMTGGAVSLHSAGVT LSTQFTDFVS

421 FNSLRFRFRL TVEEPSFSIT RTRVGGLYGL PAAYPNNGKE YYEVAGRLSLISLVPSNDDY

481 QTPITNSVTV RQDLERQLGE LREEFNALSQ EIAMSQLIYL ALLPLDMFSMFSGIKSTIDA

541 AKSMATSVMK KFKKSGLANS VSTLTDSLSD AASSISRGAS IRSVGSSASAWTDVSTQITD

601 VSSSVSSIST QTSTISRRLR LKEMATQTEG MNFDDISAAV LKTKIDRSTQISPNTLPDIV

661 TEASEKFIPN RAYRVINNDE VFEAGTDGRY FAYRVETFDE IPFDVQKFADLVTDSPVISA

721 IIDFKTLKNL NDNYGISRQQ AFNLLRSDPR VLREFINQDN PIIRNRIEQLIMQCRL

SEQ.ID.NO：2(VP8恒河猴轮状病毒)(Rhesus Monkey Rotavirus)

1 MASLIYRQLL TNSYTVDLSD EIQEIGSTKT QNVTINLGPF AQTGYAPVNWGPGETNDSTT

61 VEPVLDGPYQ PTSFNPPVDY WMLLAPTAAG VVVEGTNNTD RWLATILVEPNVTSETRSYT

121 LFGTQEQITI AYASQTQWKF IDVVKTTQNG SYSQYGPLQS TPKLYAVMKHNGKIYTYNGE

181 TPNVTTKYYS TTNYDSVNMT AFCDFYIIPR EEESTCTEYI NNGLPPIQNT R

SEQ.ID.NO：3(VP8_141-182恒河猴轮状病毒)(Rhesus Monkey Rotavirus)

₁₄₁ IDVVKTTQNGSYSQYGPLQSTPKLYAVMKHNGKIYTYNGETP₁₈₂

SEQ.ID 4(Peptide VP8_144-148恒河猴轮状病毒)(Rhesus Monkey Rotavirus)₁₄₄ VVKT₁₄₇

SEQ.ID 5(Peptide VP8_151-158恒河猴轮状病毒)(Rhesus Monkey Rotavirus)₁₅₁ SYSQYGPL₁₅₈

SEQ.ID 6(Peptide VP8_174-177恒河猴轮状病毒)(Rhesus Monkey Rotavirus)₁₇₄ IYTY₁₇₇

SEQ.ID 7(Peptide VP8_183-186恒河猴轮状病毒)(Rhesus Monkey Rotavirus)₁₈₃ NVTT₁₈₆