酵母细胞表达人白细胞介素24的方法

摘要

本发明公开一种酵母细胞表达人白细胞介素24的方法，该方法先是通过克隆一种IL－24基因或具有一个碱基突变的IL－24基因；然后将它们构建到三种表达载体pPIC3.5K、pPIC9K或pA0815上，构建获得8种表达载体；再选用His－的毕赤酵母GS115株、KM71株或SMD1168株作为宿主细胞，用酵母细胞进行胞内可溶性表达或胞外分泌性表达，从而获得稳定、高效表达人白细胞介素24，保证了IL－24正确的空间结构及其生物学活性。

说明书

                                技术领域

本发明涉及利用重组DNA技术生产蛋白质药物的技术领域，具体涉及到一种酵母细胞表达人白细胞介素24的方法。

                                背景技术

1995年哥伦比亚大学Paul.B.Fisher用差减杂交方法在黑色素瘤细胞cDNA文库中发现一个新的与黑色素瘤分化相关基因，即mda-7(melanoma differentiation-associatedgene 7)，并初步试验证明了mda-7具有抑制黑色素瘤增生特性和在黑色素瘤进程中促进终末分化的能力。随后mda-7一直作为肿瘤抑制物被研究，直到2002年Caudell等用一系列的实验证实了mda-7的细胞因子属性，提出将mda-7重新命名为白细胞介素24(interleukin-24，IL-24)，归于IL-24家族。

IL-24基因位于人染色体1q32.2-1q41，有7个外显子和6个内含子。IL-24全长mRNA为1975bp(GENEBANK NM_006850)。IL-24共有206个氨基酸，其中N端有48个氨基酸为信号肽，引导IL-24分泌到细胞外行使功能。带信号肽的IL-24分子量为23.8kD，成熟蛋白的分子量18.4kD。IL-24肽链上第85、99、126位氨基酸处分别有3个N-糖基化位点。还具有3个酪蛋白激酶II磷酸化位点和3个蛋白激酶C磷酸化位点。

IL-24的表达在人细胞中存在较高的组织特异性，主要为免疫细胞亚群，包括正常的或LPS刺激的单核细胞和T细胞，进一步亚型分类显示约15-20％的CD19+和50-80％的CD56+为IL-24表达呈阳性。IL-24在正常黑素细胞和初期黑色素瘤细胞中均有表达，随着黑色素瘤发展IL-24的表达逐渐减少，并在黑色素瘤的转移和浸润期间几乎检测不到IL-24的表达。在50多个不同起源的肿瘤细胞株中都没有测定IL-24蛋白表达。Vincenti等的研究表明IL-24mRNA可被致炎细胞因子——白细胞介素-1β诱导强烈上调，暗示IL-24为早期响应基因具有响应应激的功能。

迄今为止已有许多实验证明IL-24具有显著的抑制肿瘤的作用，能选择性地抑制多种肿瘤生长，诱导肿瘤细胞凋亡，包括人黑色素瘤、神经胶质母细胞瘤、骨肉瘤、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、肺癌、胃癌、鼻咽癌、前列腺癌等。这种抑制作用不依赖p53、Rb和p16等抑癌基因，且对正常细胞没有影响。IL-24抑制肿瘤的机制尚未清楚，目前认为通过多种途径发挥抑制肿瘤的作用，抗肿瘤的效果十分显著，成为肿瘤特异治疗药物的研究开发热点。

随着对IL-24在作用机制以及基因治疗方面深入的研究，一方面肯定了IL-24选择性抑制肿瘤生长的功能，另一方面扩展了其临床应用范围；同时也表现出对IL-24的大量需求，所以，通过基因工程手段大规模生产高纯度天然活性的重组人IL-24成为必然。

目前有关对IL-24的表达的文献显示，在国外集中在由腺病毒介导IL-24在肿瘤细胞中瞬时表达，诱导细胞凋亡的效果十分显著，存在问题一是腺病毒的安全性，二是作用效果短暂。国内有两篇文献，一是在大肠杆菌中包涵体表达，其不足在于包涵体表达方式和无蛋白质翻译后修饰，生物学活性不能保证；二是在COS细胞中瞬时表达，也存在作用效果短暂的问题。

                                发明内容

本发明的目的是提供一种酵母表达重组人IL-24的方法，具体是应用酵母细胞进行胞内可溶性表达或胞外分泌性表达，获得稳定、高效表达人白细胞介素24的工艺，保证IL-24正确的空间结构及其生物学活性。

本发明选用His-的毕赤酵母GS115株、KM71株和SMD1168株，整合性表达质粒是pPIC3.5K、pPIC9K和pAO815，3个载体和3种菌株均购自美国Invitrogen公司，均在一个表达试剂盒里(Multi-copy pichia expression kit”，catalog No.k1750-01)。

本方法包括以下步骤：

1、克隆人IL-24基因：以ConA刺激人外周血单个核细胞的总mRNA为模板，先RT-PCR扩增出总cDNA，再用IL-24特异引物扩增出带有原始信号肽的IL-24(即命名为mIL-24)或不带有原始信号肽的IL-24(即命名为IL-24)。mIL-24和IL-24的序列与Genbank公布的序列一致，Genbank公布的登录号为GenBank NM_006850。或者，

克隆具有点突变的人IL-24基因：以ConA刺激人外周血单个核细胞的总mRNA为模板，先RT-PCR扩增出总cDNA，再用IL-24特异引物扩增出带有原始信号肽的突变IL-24(即命名为smIL-24)或不带有原始信号肽的突变IL-24(即命名为sIL-24)。smIL-24和sIL-24的cDNA序列与Genbank公布的序列对比在同一位置发生碱基的点突变，并由此引起一个氨基酸的变化，核酸和氨基酸的序列见序列表1。

2、体外构建重组表达载体转化毕赤酵母中，进行胞外的分泌性表达和胞内的可溶性表达：

1)体外构建重组分泌性表达载体：

a)将带原始信号序列的IL-24或sIL-24重组到整合型表达载体pPIC9K的多克隆位点EcoR1和Not1之间，得到带有α因子的分泌型表达载体IL-24/pPIC9K或sIL-24/pPIC9K；将不带原始信号序列的IL-24或sIL-24分别与α-因子连接而成的融合基因以及带有原始信号序列的mIL-24或smIL-24分别重组到载体pAO815的EcoRI位点，利用Bgl II和BamHI内切酶在pAO815上体外构建多拷贝表达盒，获得带有α因子的分泌型多拷贝表达载体n(αIL-24)/pAO815和n(αsIL-24)/pAO815；

b)将带有原始信号序列的mIL-24或smIL-24重组到整合型表达载体pPIC3.5K的多克隆位点BamH1和Not1之间，得到带有IL-24自身分泌信号的分泌型表达载体mIL-24/pPIC3.5K或smIL-24/pPIC3.5K。

2)体外构建重组胞内可溶性表达载体：

将不带原始信号序列的IL-24或sIL-24 5’端加上起始密码子ATG，重组到载体pPIC3.5K的多克隆位点EcoR1和Not1之间，得到可溶性表达载体：

(3)毕赤酵母转化：将重组质粒用限制性内切酶Sal I或Sac I酶切成线性质粒，通过电穿孔或原生质体法转化毕赤酵母；可溶性表达载体转化SMD1168酵母菌株，得到重组酵母菌株IL-24/pPIC3.5K/SMD1168或sIL-24/pPIC3.5K/SMD1168；分泌型表达载体分别转化酵母菌株GS115或KM71，得到重组酵母菌株IL-24/pPIC9K/GS115、sIL-24/pPIC9K/GS115、mIL-24/pPIC3.5K/GS115、smIL-24/pPIC3.5K/GS115、n(αIL-24)/pAO815/GS115、n(αsmIL-24)/pAO815/GS115、IL-24/pPIC9K/KM71、sIL-24/pPIC9K/KM71、mIL-24/pPIC3.5K/KM71或smIL-24/pPIC3.5K/KM71。

3、毕赤酵母表达人IL-24：在毕赤酵母培养基中加入甲醇进行诱导表达，甲醇终浓度在0.2-1.0％，温度在28-30℃，诱导的时间3-14天，目标蛋白按预期的进行分泌和可溶性表达，表达量在4-195mg/L。

毕赤酵母中分泌表达人活性蛋白IL-24具有良好的优势：一是它能够防止宿主菌对表达产物的降解、减轻宿主细胞代谢的负荷以及表达产物对宿主的毒性作用；二是能促进分泌蛋白按适当的方式折叠、恢复其天然构象和活性；三是毕赤酵母在表达重组蛋白的同时进行适度的糖基化修饰上，由于毕赤酵母N连接的糖链长度适中且具有少量的0-连接，其次糖链的核心部位没有α-1，3糖苷键，不会引起超抗原反应，提高使用安全性，也有利于糖基化蛋白的生物活性。利用酵母载体上的分泌性的α-因子以及IL-24自身的信号肽引导目的基因分泌表达。用目的蛋白将会大量分泌到培养液中，能够形成准确的二硫键和正确的空间结构，保持了IL-24天然活性；由于不受宿主菌体细胞内蛋白的影响，减少了纯化工艺，提高了回收率；同时酵母细胞结构简单、生长快速、易于培养和发酵、生产成本低、目的蛋白产量高。

本专利用真核酵母来表达IL-24，分泌型表达或可溶性表达以及适当的后修饰，既保证其生物学活性，又获得大量的稳定的蛋白。

                                附图说明

图1：重组质粒IL-24/pPIC9K与sIL-24/pPIC9K的构建示意图；

图2：重组质粒mIL-24/pPIC3.5K与smIL-24/pPIC3.5K的构建示意图；

图3：重组质粒IL-24/pPIC3.5K与sIL-24/pPIC3.5K的构建示意图；

图4：重组质粒n(αIL-24)/pAO815与n(αsmIL-24)/pAO815的构建示意图。

                              具体实施方式

1.克隆人IL-24全基因：

取健康人抗凝血5ml，用淋巴细胞分离液收集白膜层；Hank’s液洗两次，加入RPMI1640完全培养基和总浓度为25μg/ml的ConA，37℃，5％CO2孵育48h；离心收集人外周血单个核细胞，抽提总RNA；由mRNA合成IL-24cDNA，反转录的条件为30℃10s，50℃30s，99℃5s，5℃5s，1个循环。三条引物为：

P1：5’CGGCATATGAATTTTCAACAGAGGC3’，含有EcoR1酶切位点；

P2：5’CCATGGCGGCCCAGGGCCAAGAATTCC3’，含有EcoR1酶切位点；

P3：5’GGATCCTTACAGAGCTTGTAGAATTTCTG3’，含有Not1酶切位点；

用P1和P3一对引物进行PCR反应，条件为：94℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min，扩增smIL-24或mIL-24；用P2和P3一对引物进行PCR反应，条件为：94℃5min；94℃1min，60℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min，扩增smIL-24或mIL-24。所获得的DNA片段分别连接到高效克隆载体pMD18-T(购自大连TAKARA公司)，得到重组质粒IL-24/pMD18-T、sIL-24/pMD18-T、mIL-24/pMD18-T或smIL-24/pMD18-T，用PCR、酶切和核酸测序鉴定。

2.构建毕赤酵母整合型表达载体方式如下：

2.1)本发明所使用的毕赤酵母菌株GS115、KM71和SMD168及其表达载体pPIC3.5K、pPIC9K、pAO815均来自于Invitrogen公司。

2.2)构建酵母表达的重组质粒方法如下：

2.2.1)体外构建重组分泌性酵母表达载体

2.2.1.1)重组分泌性酵母表达载体IL-24/pPIC9K或sIL-24/pPIC9K的构建方法：

2.2.1.1.1)用EcoR I和Not I双酶切重组质粒IL-24/pMD18-T或sIL-24/pMD18-T，获得目的片段IL-24或sIL-24，反应液组成如下，所用内切酶和缓冲液均购自大连TAKARA公司，

重组质粒                50μl

10×H buffer            10μl

BSA                     10μl

Not I                   10U

Not I                   10U

无菌水                  Up to 100μl

总体积                  100μl

2.2.1.1.2)用EcoR I和Not I双酶切表达载体pPIC9K，获得载体片段，反应液组成如下，所用内切酶和缓冲液均购自大连TAKARA公司，

表达载体                50μl

10×H buffer            10μl

BSA                     10μl

Not I                   10U

Not I                   10U

无菌水                  Up to 100μl

总体积                  100μl

2.2.1.1.3)上述酶切反应获得的目的DNA片段和载体片段的大小与预期的大小符合时，使用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段和载体片段，购自上海申友公司，具体操作按试剂盒说明书进行。

2.2.1.1.4)连接反应：T4 DNA连接酶(购自美国MBI公司)将上述回收的目的片段和载体片段DNA连接成重组酵母表达质粒IL-24/pPIC9K或sIL-24/pPIC9K，如图1示，反应液组成如下，22℃，连接过夜。

目的片段              10μl

载体片段              5μl

10×ligase buffer     2μl

T4 ligase             1μl

无菌水                2μl

总体积                20μl

2.2.1.1.5)转化感受态细菌DH5α：大肠杆菌感受态制备按常规方法(《分子克隆实验指南》第二版J.萨姆布鲁克等著科学出版社1999)进行。取上述连接产物10μl分别与感受态细菌100μl混合，4℃，30min，42℃，2min，4℃，10min；然后加入500μl LB培养液，37℃，30min，培养60min；6000rpm，室温离心1min，去上清550μl，剩余溶液重新悬浮细菌沉淀，全部菌液涂Amp+LB平板，37℃培养18小时。

2.2.1.1.6)酶切鉴定：随机挑取4个单菌落接种到5ml Amp+LB培养液中，37℃振荡培养16小时，使用抽提质粒，购自上海申友公司，按试剂盒说明书操作。酶切体系组成为：

重组酵母表达质粒         50μl

10×H buffer             10μl

BSA                      10μl

Not I                    10U

Not I                    10U

无菌水                   Up to 100μl

总体积                   100μl

2.2.1.2)重组分泌性酵母表达载体mIL-24/pPIC3.5K或smIL-24/pPIC3.5K的构建方法：按照2.2.1.1的方法用EcoR I和Not I双酶从重组质粒mIL-24/pMD18-T或smIL-24/pMD18-T上切下目的DNA片段mIL-24/或smIL-24，分别插入到表达载体pPIC3.5K上，连接重组酵母表达质粒mIL-24/pPIC3.5K或smIL-24/pPIC3.5K。如图2示。

2.2.1.3)分泌型多拷贝表达载体n(αIL-24)/pAO815或n(αsIL-24)/pAO815体外构建。

2.2.1.3.1)构建方法：将酵母的分泌信号序列α-factor连接在IL-24或sIL-24的5’端，形成融合基因αIL-24或αsIL-24，再在该融合基因的5’端和3’端加上EcoR I的酶切序列，EcoR I酶切；同时用EcoR I酶切pAO815质粒，37℃，2小时；加入等体积的酚/氯仿，振荡，13200rpm离心5min；取上清再加入等体积的氯仿，振荡，13200rpm离心5min；取上清，加入1/10 3M NaAc，2倍体积的无水乙醇，-30℃ 30min；4℃，13200rpm离心10min，其上清，沉淀用70％冷乙醇漂洗两次，室温干燥；加入pH8.0的无菌水悬浮沉淀。

EcoR I酶切pAO815质粒的去磷酸化，反应体系如下，去磷酸化酶CIAP及缓冲液购置大连TAKARA公司：

pAO815/EcoR I       20μl

10×CIAP buffer     5μl

CIAP                3μl

无菌水              up to 50μl

37℃，30min。用酚/氯仿抽提后，与EcoR I酶切的αIL-24或αsIL-24连接，转化感受态大肠杆菌，涂平板培养，挑单菌落接种Amp+LB液振荡培养，抽提质粒，EcoR I酶切鉴定目的基因是否重组到pAO815质粒上(方法同上)；然后再用HindIII和BamH I鉴定重组质粒的目的基因正反方向：

重组质粒             10μl

10×K buffer         2μl

BamH I               5U

HindIII              5U

无菌水               up to 20μl

37℃，3小时，取10μl进行1％琼脂糖电泳，在紫外灯下观察并拍照。如果除了有约7.7kb之外，还有约400bp的片段，说明目的片段在pAO815载体上是正向，若没有400bp条带，是其他条带则为反向。

2.2.1.3.2)上述方法构建的重组质粒αIL-24/pAO815或αsIL-24/pAO815分别用Bgl I和BamH I双切，回收约2200bp的片段，即为单拷贝表达盒，纯化液加入T4连接酶及其缓冲液，共20μl，16℃进行过夜连接反应；然后加入Bgl II 2U、BamH I 2U、10×Kbuffer 10μl、无菌水至100μl，37℃2小时，目的在于酶切消除头-头、尾-尾连接的表达盒；酶切产物经酚/氯仿抽提和乙醇沉淀(方法同上)后与其对应的并经BamH I酶切及去磷酸化处理的重组质粒(含对应的单拷贝表达盒)连接，转化E.coli DH5α，挑单菌落，抽提质粒，再用Bgl II和BamH I进行酶切鉴定和筛选，电泳观察除了有4028bp和2393bp之外，还有2039bp(αIL-24/pAO815或αsIL-24/pAO815)或4076bp(2×αIL-24/pAO815或2×αsIL-24/pAO815)或6117bp(3×αIL-24/pAO815或3×αsIL-24/pAO8152039)……，则表示是1、2、3……等多拷贝表达盒的条带及质粒条带，挑选含最多拷贝数的重组质粒进一步转化毕赤酵母。其中8(αIL-24)/pAO815和8(αsmIL-24)/pAO815的，构建图示如图4。

2.2.2)体外构建重组胞内可溶性表达载体

按照2.2.1.1的方法用EcoR I和Not I双酶从重组质粒IL-24/pMD18-T或sIL-24/pMD18-T上切下目的DNA片段IL-24/或sIL-24，分别插入到表达载体pPIC3.5K上，连接重组酵母表达质粒IL-24/pPIC3.5K或sIL-24/pPIC3.5K。如图3示

2.3)重组载体转化毕赤酵母及体内筛选多拷贝表达盒的酵母转化子：

2.3.1)由上述方式构建的重组质粒经Sal I酶切线性化后，应用电穿孔法或原生质体法将重组质粒整合到毕赤酵母染色体上。

2.3.1.1)电穿孔法：

接种His^-毕赤酵母GS115、KM71和SMD1168单菌落于500ml YPD培养液中，过夜培养，至OD₆₀₀约为1.3-1.5。4℃，3000rpm，离心5min，收集细胞，250ml冰冻的无菌水悬浮沉淀；按此法用冰冻无菌水再洗一次，冰冻1M山梨醇洗两次后，将酵母细胞悬浮于1ml山梨醇中。取5-20μg经Sal I酶切线性化的DNA，与80μl电转感受态细胞混合于冰冻的0.2cm电转杯中，冰上孵育5分钟。

应用电转仪BIO-RAD Gene Pulse Xcell^TM Electroporation System，以电压2000V、电容25μF、电阻200Ω进行电穿孔，然后加入1ml冰冻的1M山梨醇，取200-600μl溶液涂MD平板。30℃培养，挑选单菌落。获得重组酵母菌株IL-24/pPIC9K/GS115、sIL-24/pPIC9K/GS115、mIL-24/pPIC3.5K/GS115、smIL-24/pPIC3.5K/GS115、8(αIL-24)/pAO815/GS115、8(αsmIL-24)/pAO815/GS115、IL-24/pPIC9K/KM71、sIL-24/pPIC9K/KM71、mIL-24/pPIC3.5K/KM71或smIL-24/pPIC3.5K/KM71；

2.3.1.2)原生质体法：

His^-毕赤酵母GS115、KM71和SMD1168经培养至OD₆₀₀为0.2-0.3，3000rpm，室温离心5min，收集细胞，依次用20ml无菌水、20mlSED、20ml 1M山梨醇、20mlSCE洗涤，最后重悬于1mlSCE液中。加入1μl 1mg/ml的Lyticase(Sigma产品)，30℃消化细胞壁约15min，2500rpm离心5min，获得原生质体，再用20ml 1M山梨醇、20ml CaS各洗1次，最后悬浮于0.6ml的CaS中。取原生质体100μl，加入10μg经Sal I酶切线性化的重组质粒室温孵育10min，再加入1ml PEG/CaT室温孵育10min，经2000rpm室温离心10min，沉淀用150μlSOS液悬浮，室温放置20min后与850μl 1M山梨醇缓慢混合，取100μl与2ml RD软琼脂上层培养基混合后涂布RD平板，30℃培养6天。挑选单菌落。获得重组酵母菌株IL-24/pPIC9K/GS115、sIL-24/pPIC9K/GS115、mIL-24/pPIC3.5K/GS115、smIL-24/pPIC3.5K/GS115、8(αIL-24)/pAO815/GS115、8(αsmIL-24)/pAO815/GS115、IL-24/pPIC9K/KM71、sIL-24/pPIC9K/KM71、mIL-24/pPIC3.5K/KM71或smIL-24/pPIC3.5K/KM71；

2.3.2)G418筛选多拷贝表达盒的酵母转化子：

从RD平板或MD平板上挑选50个重组子接种在MD平板上，然接种在含200μl YPD培养液的96孔板传代三次，使每个重组子的浓度基本一致，各取10μl接种在含不同浓度G418(0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mg/ml)YPD平板上，30℃培养。挑选抗高浓度的重组子(即含有多拷贝表达盒的转化子)做诱导表达。

2.4)毕赤酵母转化子诱导表达人IL-24蛋白：

将获得重组酵母菌株IL-24/pPIC9K/GS115、sIL-24/pPIC9K/GS115、mIL-24/pPIC3.5K/GS115、smIL-24/pPIC3.5K/GS115、8(αIL-24)/pAO815/GS115、8(αsmIL-24)/pAO815/GS115、IL-24/pPIC9K/KM71、sIL-24/pPIC9K/KM71、mIL-24/pPIC3.5K/KM71或smIL-24/pPIC3.5K/KM71单菌落接种到20ml BMGY中，30℃振荡培养48小时，收集菌体并悬浮于10ml BMMY中，30℃振荡培养，每隔12小时取样1ml并每24小时补加0.5％的甲醇。分离5天取样上清，按常规方法进行SDS-PAGE和WesternBlotting进行鉴定和检测，筛选表达量高的重组子进行大量诱导培养。

上述不同重组表达菌株获得重组酵母菌株IL-24/pPIC9K/GS115、sIL-24/pPIC9K/GS115、mIL-24/pPIC3.5K/GS115、smIL-24/pPIC3.5K/GS115、8(αIL-24)/pAO815/GS115、8(αsmIL-24)/pAO815/GS115、IL-24/pPIC9K/KM71、sIL-24/pPIC9K/KM71、mIL-24/pPIC3.5K/KM71或smIL-24/pPIC3.5K/KM71，均有一定量的表达。其中8(αIL-24)/pAO815/GS115和8(αsmIL-24)/pAO815/GS115两个重组菌株的表达量最高，到达195mg/L。而且分泌和可溶性表达形式利于后续的纯化和保持其生物学活性。

上述方法中使用的溶液配方：

1.LB培养基(pH至7.0)：

胰蛋白胨                            10g

酵母提取物                          5g

NaCl                               10g

LB固体培养基再加入2％的琼脂

2.YPD培养基：

蛋白胨                              2％

酵母提取物                          1％

葡萄糖                              2％

YPD固体培养基再加入2％的琼脂。

3.MD固体培养基：

酵母含氮碱基                        1.34％

生物素                              4×10^-5％

葡萄糖                              2％

琼脂                                2％

4.RD固体培养基：

酵母含氮碱基                        1.34％

生物素                              4×10^-5％

葡萄糖                              2％

山梨醇                              1M

无组氨酸的混合氨基酸                0.005％

上层软琼脂                          0.8％

下层琼脂                            2％

5.SCE：

山梨醇                              1M

EDTA                                1mM

柠檬酸缓冲液(pH5.8)                 10mM

6.SED

1ml DTT+19ml SE(1M山梨醇，25mM EDTA(pH8.0)

7.CaS

山梨醇                              1M

Tris-HCl(pH7.5)                     10mM

CaCl₂                              10mM

8.SOS

山梨醇                              1M

YPD                                 0.3倍

CaCl₂                             >

9.CaT

Tris pH7.5                          20mM

CaCl₂                             20mM

10.BMGY

蛋白胨                             2％

酵母提取物                         1％

酵母含氮碱基                       1.34％

生物素                             4×10^-5％

葡萄糖                             2％

磷酸钾缓冲液pH6.0                  100mM

甘油                               1％

11.BMMY

蛋白胨                             2％

酵母提取物                         1％

酵母含氮碱基                       1.34％

生物素                             4×10-5％

葡萄糖                             2％

磷酸钾缓冲液pH6.0                  100mM

甲醇                               0.5％

                                   序列表

<110>中国人民解放军第三军医大

<120>酵母细胞表达人白细胞介素24的方法

<130>

<160>3

<210>1

<211>473

<212>DNA

<213>人白细胞介素24

<400>1

cagggccaag aattccactt tgggccctgc caagtgaagg gggttgttcc ccagaaactg     60

tgggaagcct tctgggctgt gaaagacact atgcaagctc aggataacat cacgagtgcc    120

cggctgctgc agcaggaggt tctgcagaac gtctcggatg ctgagagctg ttaccttgtc    180

cacaccctgc tggagttcta cttgaaaact gttttcaaaa actaccacaa tagaacagtt    240

gaagtcagga ctctgaagtc attctctact ctggccaaca actttgttct catcgtgtca    300

caactgcaac ccagtcaaga aaatgagatg ttttccatca gagacagtgc acacaggcgg    360

tttctgctat tccggagagc attcaaacag ttggacgtag aagcagctct gaccaaagcc    420

cttggggaag tggacattct tctgacctgg atgcagaaat tctacaagct ctg           473

<210>2

<211>473

<212>DNA

<213>具有一个碱基突变的人白细胞介素24

<400>2

cagggccaag aattccactt tgggccctgc caagtgaagg gggttgttcc ccagaaactg     60

tgggaagcct tctgggctgt gaaagacact atgcaagctc aggataacat cacgagtgcc    120

cggctgctgc agcaggaggt tctgcagaac gtctcggatg ctgagagctg ttaccttgtc    180

cacaccctgc tggagttcta cttgaaaact gttttcaaaa accaccacaa tagaacagtt    240

gaagtcagga ctctgaagtc attctctact ctggccaaca actttgttct catcgtgtca    300

caactgcaac ccagtcaaga aaatgagatg ttttccatca gagacagtgc acacaggcgg    360

tttctgctat tccggagagc attcaaacag ttggacgtag aagcagctct gaccaaagcc    420

cttggggaag tggacattct tctgacctgg atgcagaaat tctacaagct ctg           473

<210>3

<211>158

<212>PRT

<213>人白细胞介素24

<400>3

Ala Gln Gly Gln Glu Phe His Phe Gly Pro Cys Gln Val Lys Gly Val

1               5                   10                  15

Val Pro Gln Lys Leu Trp Glu Ala Phe Trp Ala Val Lys Asp Thr Met

            20                  25                  30

Gln Ala Gln Asp Asn Ile Thr Ser Ala Arg Leu Leu Gln Gln Glu Val

        35                  40                  45

Leu Gln Asn Val Ser Asp Ala Glu Ser Cys Tyr Leu Val His Thr Leu

    50                  55                  60

Leu Glu Phe Tyr Leu Lys Thr Val Phe Lys Asn Tyr His Asn Arg Thr

65                  70                  75                  80

Val Glu Val Arg Thr Leu Lys Ser Phe Ser Thr Leu Ala Asn Asn Phe

                85                  90                  95

Val Leu Ile Val Ser Gln Leu Gln Pro Ser Gln Glu Asn Glu Met Phe

            100                 105                 110

Ser Ile Arg Asp Ser Ala His Arg Arg Phe Leu Leu Phe Arg Arg Ala

        115                 120                 125

Phe Lys Gln Leu Asp Val Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Leu Gly Glu

    130                 135                 140

Val Asp Ile Leu Leu Thr Trp Met Gln Lys Phe Tyr Lys Leu

145                 150                 155