TNFα高亲和力嵌合抗体及其用途

摘要

本发明涉及一种新的人肿瘤坏死因子(hTNF－α)高亲和力嵌合抗体和其用途。本发明利用抗体库筛选结合计算机辅助分析获得一株具有高亲和力的嵌合抗体，识别hTNF的141－146位，较上市的抗体Remicade具有更高的亲和力、一致的中和活性，识别位点不同。本发明的抗体可用于治疗与TNF－α相关的疾病。

说明书

技术领域

本发明涉及利用噬菌体抗体库技术与计算机辅助合理设计方法结合筛选获得的人肿瘤坏死因子(hTNF-α)高亲和力嵌合抗体(本发明中命名为CH22)。

背景技术

人肿瘤坏死因子α(hTNFα)是一种由单核、巨噬、T淋巴、中性粒、肥大或内皮细胞分泌产生的细胞因子，可介导多种生物学活性。当hTNF-α在体内的大量产生和释放可引起机体免疫平衡失调，并可与其它炎症因子一起产生多种病理损伤，例如恶病质和败血症休克所致的多器官功能衰竭、类风湿性关节炎(RA)、关节强硬性脊椎炎(AS)、多发性硬化症(MS)、炎症性肠病(IBD)、移植物抗宿主病(GVHD)和骨髓造血紊乱综合症(MDS)等多种疾病。因此，通过应用中和hTNF-α活性的抗体，可阻断因hTNF-α水平异常增高导致的机体病理性损伤，最终达到对疾病的有效治疗目的。美国Centocor公司研制生产的抗hTNF-α嵌合抗体(商品名Remicade^)，美国FDA、欧盟和日本相继已批准用于RA、结肠Crohn病和AS的临床治疗。

本研究组于上世纪八十年代已经制备得到抗hTNFα鼠源单克隆抗体(McAb)Z12(黎燕等，生物工程学报，1991，7(2)，121-126)，具有中和hTNFα细胞毒性功能，其亲和力在K_a＝8×10⁷L/mol。在其人源化过程中，抗体的亲和力又有显著地降低。本发明尝试借助链替换(Chain Shuffling)方法，以鼠源抗体Z12为母本，通过噬菌体抗体库技术亲和筛选，借助计算机合理设计获得高亲和力嵌合抗体，以期达到在保持抗体中和活性的同时显著提高抗体亲和力的目的。

发明内容

本发明基于原有的母本鼠源抗体Z12，采用一种新的策略(即噬菌体抗体库链替换技术与计算机辅助合理设计相结合)获得高亲和性抗体。

首先，在母本鼠源抗体Z12基础上，通过链替换方法对构建的噬菌体抗体库进行筛选，获得潜在的具有较高中和活性的嵌合抗体。

利用同源模建方法对筛选的嵌合抗体可变区空间构象进行合理分析，在理论指导下将其与母本抗体Z12空间构象进行结构、表观性征的比较；通过分子对接方法构建抗体与hTNFα相互作用的复合物空间构象，借助相关理论方法对复合物的稳定性、结合强弱以及相互作用区域进行理论分析，确定具有高亲和活性的嵌合抗体。通过生物学试验获得该抗体，借助功能性试验对其中和活性进行验证。

本发明通过以下步骤获得了一株高亲和力抗TNFα嵌合抗体。

1、利用噬菌体抗体库技术筛选TNFα高亲和力嵌合抗体：

构建供链替换(Chain Shuffling)应用的抗体文库，通过亲和富集筛选获得阳性噬菌体抗体克隆，基因测序获得抗体可变区基因序列。

2、计算机辅助合理预测抗hTNFα高亲和力嵌合抗体：

利用同源模建方法对抗体库筛选获得的抗体可变区的空间构象进行模拟，在分子力学及动力学条件下，选择CVFF、Amber力场对其优势构象进行分析。在距离几何学、计算机图形学基础上对筛选的抗体可变区三维构象与母本抗体Z12空间构象进行比较，初步分析筛选抗体可变区构象与母本抗体Z12构象的差异。

通过分子对接方法获得抗体与抗原hTNFα相互作用的复合物模型，借助计算机图形学技术、反应自由能理论、分子间氢键形成理论对筛选的抗体可变区与抗原TNFα作用模式进行比较，同时借助建立的母本抗体Z12与TNFα相互作用的数学模型，确定具有高亲和性的嵌合抗体。

本发明通过上述策略获得了一株具有高亲和力(K_a＝6×10¹⁰L/mol)的抗hTNFα嵌合抗体CH22。显而易见的是，本发明的嵌合抗体的抗原结合部分也在本发明的保护范围之内。

3、高亲和性嵌合抗体CH22生物学效应评价：

借助理论预测结果，通过生物学方法对嵌合抗体CH22生物学功能进行实验分析：嵌合抗体CH22能够特异性结合hTNFα，其抗原识别的主要表位hTNFα141-146表位，相对于母本抗体Z12，CH22亲和力提高750倍，中和活性TNFα的能力提高10倍；比Remicade^(Infliximab，FDA批准用于临床治疗类风湿性关节炎的嵌合抗体)亲和力高6倍。它们识别TNFα的功能表位不同，但中和TNFα活性的能力相同。通过功能试验表明，抗体CH22具有同时识别重组和天然hTNFα的能力，具有良好的临床应用前景。

附图说明

图1.3.1.1  EILSA测定免疫小鼠血清效价。

图1.3.1.2  小鼠脾淋巴细胞总RNA的电泳图谱。

图1.3.2.1  RT-PCR扩增得到抗体基因文库。

1：Fd片段的PCR产物；2：DNA标记(DL2000)；3：轻链PCR产物

图1.3.3.1  噬菌体抗体表达载体p3MH(示意图)。

Lac：启动子；

OmpA和PelB：信号序列；

9E10：编码McAb 9E10识别的表位；

His6：组胺酸尾

图1.3.3.2  噬菌体抗体表达载体p3MH酶切位点的鉴定。

1：p3MH；             2：p3MH/SacI；

3：p3MH/XbaI；        4：p3MH/XhoI；

5：p3MH/SpeI

图1.3.3.3  p3MH/Z12L酶切鉴定图谱。

1：DNA标记(DL2000)；

2-4：p3MH/Z12L/SacI+XbaI；

5：p3MH/SacI+XbaI

图1.3.3.4   p3MH/Z12L序列测定结果。

图1.3.3.5   p3MH/Z12H酶切鉴定图谱。

1：DNA标记(DL2000)；2：p3MH/XhoI+SpeI；3：p3MH/Z12H/XhoI+SpeI

图1.3.3.6   p3MH/Z12H序列测定结果。

图1.3.5.1   噬菌体抗体H22、Ke、Kg与Z12比较对rh-TNFα相对亲和力。

图2.2.1.1  pGEM-T Easy/噬菌体抗体克隆酶切鉴定图谱。

1：DNA标记(DL2000)；

2-5：pGEM-T Easy/噬菌体抗体基因/EcoRI

图2.2.1.2  抗体克隆H22重链Fd部分基因测序报告。

图2.2.1.3  抗体克隆Ke轻链基因测序报告。

图2.2.2.1  抗体可变区基因的翻译。

图2.2.2.2  抗体可变区基因FR、CDR区分类。

图2.2.3.1  抗体A2H可变区空间构象示意图。

图2.2.3.2  抗体C2H可变区空间构象示意图。

图2.2.3.3  抗体H22可变区空间构象示意图。

图2.2.4.1  抗体A2H可变区与TNFα作用的复合物空间构象。

图2.2.4.2  抗体A4H可变区与TNFα作用的复合物空间构象。

图2.2.4.3  抗体H22可变区与TNFα作用的复合物空间构象。

图3.3.1.1  嵌合抗体表达载体PWS3示意图。

图3.3.1.2  重组表达质粒PWS3H22的构建和鉴定。

(A)：PWS3H22的酶切消化

1：HindIII/XhoI消化的PWS3H22；2：BamHI/XbaI消化的PWS3H22；3：DL2000标记

(B)：在1％琼脂糖凝胶上PCR鉴定PWS3H22

1：H22重链可变区产物；2：H22轻链可变区产物；3：DNA标记(DL2000)

图3.3.2.1  CH22对TNF-α结合特异性检测。

A：ELISA检测CH22对TNF-α的特异性结合，1.阳性对照(Z12)；2.CH22；3.阴性对照(人IgG)；

B：蛋白质印迹检测CH22对TNF-α的特异性结合，1.PBS；2.阴性对照(人IgG)；3.阳性对照(Z12)；4.CH22

图3.3.3.1纯化抗体分子SDS-PAGE电泳图。

1.2.CH22；3.Z12；4.Remicade^；5.人IgG

图3.3.4.1  几种不同抗hTNFα抗体抗原识别位点比较。

图4    本发明的高亲和力嵌合抗体构建流程图。

具体实施方式

1、噬菌体抗体库的构建及亲和筛选

1.1  材料

菌株和质粒

本发明中使用的生物材料包括：大肠杆菌JM109菌，XLI-Blu菌(Invitrogen)；噬菌体抗体库Fab段表达载体p3MH(Barbas CF 3rd，KangAS，Lerner RA，Benkovic SJ.Proc Natl Acad Sci USA.1991 Sep15；88(18)：7978-82)

工具酶、试剂

限制性内切酶购自New England Biolabs公司；

T4 DNA连接酶、pGEM-T Easy载体试剂盒、逆转录酶购自Promega公司；

Pyrobest DNA聚合酶、DNA分子量标准DL2000购自TaKaRa公司；

TRIzol Reagent购自Invitrogen公司；

二磷酸腺苷(ADP)为Biopool产品；

DNA片段回收试剂盒购自OMEGABIO-TEK公司；

质粒回收试剂盒购自天为时代公司；

辣根过氧化物酶标记的anti-M13抗体购自amersham pharmacia公司；

其他常用化学试剂均为进口或国产分析纯；

1.2方法

1.2.1小鼠脾脏分离制备淋巴细胞

小鼠眼球除血，泡至75％乙醇中。取出小鼠放置平板上，俯卧位。用镊子夹起左侧皮毛部，剪开皮肤、腹膜，分离脾脏，放置平皿中。轻柔剪去脾脏两侧系膜及周围组织，于平皿中加入1-2ml生理盐水，轻摇平皿洗涤。用平扁齿镊子轻挤压脾脏包膜，将脾脏细胞挤至平皿中，形成细胞悬液。预先于试管中加入3ml小鼠淋巴细胞分离液，再加入6ml细胞悬液加入时沿管壁缓缓加入，形成不同的液面层。室温离心2000rpm 30分钟，轻轻环绕吸取液面细胞，加入生理盐水6-8ml混匀洗涤。离心1500rpm 5分钟弃上清，所得沉淀即为淋巴细胞。

1.2.2脾淋巴细胞细胞总RNA的提取

取淋巴细胞悬液计数，按1×10⁷细胞分装入EP管中，1500rpm离心5分钟，弃生理盐水，留细胞沉淀。在每管中分别加入1ml TRIzol，用手反复摇匀至细胞碎片完全被裂解。室温静置几分钟后，每管加入0.2ml氯仿，在手中反复振荡摇匀，室温静置10分钟。将EP管置于高速台式冷冻离心机，4℃，12000rpm离心30分钟。小心吸取上层液相置于另一无菌EP管中，于管中加入等体积异丙醇，室温沉淀10分钟。4℃，12000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用75％乙醇洗一遍。沉淀的RNA在室温自然干燥，切勿抽干。每管用30ml无RNA酶的纯水重悬干燥后的RNA。立即置于冰浴用于cDNA合成或置-70℃长期保存。

1.2.3 RNA甲醛变性电泳

电泳胶：0.3g琼脂糖、21.6ml无RNA酶的去离子水，微波炉加热融化后，再加3ml 10×mops，5.4ml甲醛。

样品处理：5μl RNA样品，5μl 10×mops，25μl甲酰胺，9μl甲醛混匀后，56℃反应15分钟后，加上样缓冲液进行电泳。

电极缓冲液(10×)：0.4M mops，0.1M醋酸钠，0.01M EDTA。

电泳结束后，EB染色，紫外观察。

1.2.4 PCR引物

本发明引物主要用于扩增抗体IgG重链Fd部分、轻链κ链的全长基因，具体如下。

用于扩增抗体重链Fd基因引物：

A(正义)5’-CCAGTTCGGAGCTCGTTGTGACTCAGGAATCT-3’(SEQ ID NO：9)

B(正义)5’-CCAGTTCCGAGCTCGTGTTGACGCAGCCGCCC-3’(SEQ ID NO：10)

C(正义)5’-CCAGTTCCGAGCTCGTGCTCACCCAGTCTCCA-3’(SEQ ID NO：11)

D(正义)5’-CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGTATCCA-3’(SEQ ID NO：12)

E(正义)5’-CCAGATGTGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCA-3’(SEQ ID NO：13)

F(正义)5’-CCAGATGTGAGCTCGTCATGACCCAGTCTCCA-3’  (SEQ ID NO：14)

G(正义)5’-CCAGTTCCGAGCTCGTGATGACACAGTCTCCA-3’  (SEQ ID NO：15)

H(反义)5’-CCGACTAGTTCATTTCAGCTCCAGCCAGGTG-3’   (SEQ ID NO：16)

I(反义)5’-CTCGACACTAGTTTTGCGCTCAACTGTCTT-3’    (SEQ ID NO：17)

J(反义)5’-TGTGTGACTAGTGTCACCAAGTGGGGTTTT-3’    (SEQ ID NO：18)

K(反义)5’-GCATGAACTAGTTGGGGGACCATATTTGGA-3’    (SEQ ID NO：19)

用于扩增抗体轻链全长基因引物：

L(正义)5’-AGGTCTCGAGCTCGAGTCTGG-3’      (SEQ ID NO：20)

M(正义)5’-AGGTCTCGAGCTCGAGTCAGG-3’      (SEQ ID NO：21)

N(正义)5’-AGGTCTCGAGTCCGAGTCTGG-3’      (SEQ ID NO：22)

O(正义)5’-AGGTCTCGAGTTCGAGTCAGG-3’      (SEQ ID NO：23)

P(正义)5’-AGGTCTCGAGGCTGAGTCTGG-3’      (SEQ ID NO：24)

Q(正义)5’-AGGTCTCGAGCGTAAGTCTGG-3’      (SEQ ID NO：25)

R(正义)5’-AGGTCTCGAGGGAAAGTCAGG          (SEQ ID NO：26)

S(反义)5’-GACTTGGTCTAGACGAGACGGTGAC-3’  (SEQ ID NO：27)

^*划线部分分别是XhoI、SpeI、SacI、xbaI的酶切位点。

1.2.5抗体轻、重链基因文库的建立(RT-PCR)

取10μg总RNA，依次加入AMV 5×缓冲液10μl，Oligo(dT)(500ng/μl)2μl，10mmol/L dNTPs4μl，Rnasin(50U/μl)1μl，去离子水补至50μl、反转录酶100U，42℃延伸1小时。70℃灭活逆转录酶15分钟，置冰浴中，产物为cDNA第一链。然后在100μl PCR反应体系中，分别加入反转录产物2μl，Pyrobest酶10×buffer 10μl，上下游引物各1μl，10mmol/L dNTPs 1μl，加Pyrobest酶2-5U，去离子水补至100μl。95℃变性5分钟，循环参数为：94℃1分钟，50℃1分钟，72℃1分钟，共35个循环，72℃后延伸10分钟。

1.2.6 DNA片段的纯化

用OMEGABIO-TEK公司的DNA片段纯化试剂盒，纯化按照说明书进行。用0.8％普通琼脂糖凝胶电泳，分离出欲回收的DNA片段，在长波紫外光下切下含目的DNA片段的胶块，放入离心管中，加入三倍胶体积的化胶液，55℃水浴完全溶解胶块。然后加入DNA回收柱，室温放置2分钟，10,000rpm离心30秒，洗涤缓冲液1ml分别把沉淀洗两次，离心弃废液，用50μl去离子水加到柱中，室温放置2分钟后，离心，纯化的DNA片段在水溶液里。

1.2.7载体P3MH/Z12L和P3MH/Z12H的构建

从已克隆抗体Z12轻链全长及重链Fd段的载体pGEM-Teasy/Z12L和pEM-Teasy/Z12H中，通过PCR的方法，重新获得抗体基因。将载体P3MH和纯化的PCR产物分别按照相对应地酶切消化以后，连接、转化XLI-Blu宿主菌，最后经酶切及测序鉴定，成功构建P3MH/Z12L和P3MH/Z12H载体。

1.2.8载体DNA和纯化PCR产物的酶切

抗体库基因克隆中的双酶切

       P3MH/Z12L&P3MH/Z12H        (10μg，～4700bp)    纯化PCR产物  (1μg，～680bp)    SpeI       10U    XhoI       10U    SacI       10U    XbaI       10U       20U       20U       20U       20U

酶切反应按常规进行，一般在37℃水浴至少3-4小时，也可过夜消化，最长不要超过20小时。载体DNA用量与PCR产物用量比为10∶1。酶切反应后需进行电泳以纯化所需的片段，方法如1.2.6所述。

1.2.9电转感受态细菌XLI-Blu的制备

在LB-四环素平皿中挑选一个XLI-Blu单菌落，接种入10ml四环素抗性的2×YT培养液，37℃振荡培养过夜。取上述菌液作1∶50稀释，接种入500ml2×YT培养液，其中含有10ml 20％葡萄糖和5ml1mol/L氯化镁，37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.7-0.8。将上述细菌培养液体置于冰浴15分钟，4000rpm 4℃离心20分钟。弃上清，加入250ml预冷的10％甘油，4000rpm 4℃离心20分钟。弃上清重复上一步。弃上清，用总量为20ml预冷的10％甘油，重悬细胞沉淀，冰浴静置30分钟，3500rpm 4℃离心20分钟。弃上清，加入1ml10％甘油重悬细胞，分装小管，立即使用或-70℃长期保存。

1.2.10噬菌体抗体库(κ/Z12)和噬菌体抗体库(H/Z12)的构建

取酶切消化后纯化回收的载体DNA 2μg，预酶切轻链或重链基因文库各500ng，加入2μl高浓度连接酶，加相应的连接缓冲液，16℃连接12-16小时。取事先制备好的电转感受态菌XLI-Blu 400μl加入上述连接产物置冰浴中。另取空隙为0.2cm电转杯一个，将上述每管混合物沿管壁轻轻加入，注意无气泡，置电转杯于电转仪中，设置电转时的电压为2.5KV，电击30秒-1分钟。电转后立于每个电转杯中加入2ml SOC培养液，然后立即转入细菌培养箱中，37℃振荡培养1小时。从中取10至50μl培养液，稀释成不同浓度后，分别涂于含有Amp的2×YT平皿中，以检测转化效率及计算库容量，其余菌液转入一三角瓶，加入10ml新鲜含有Amp的2×YT培养液，37℃振荡培养1小时。加入100ml含有Amp和四环素双抗的2×YT培养液，37℃振荡培养1小时。加入10¹²pfu辅助噬菌体VSCM13，37℃振荡培养2小时。加入50μg/ml卡那霉素，37℃振荡培养过夜。将上述细菌培养液4000rpm 4℃离心20分钟。将上清置另一个无菌三角瓶，加入4％PEG8000和3％NaCl溶解后，放置于冰浴中，沉淀30分钟。然后9000rpm 4℃离心20分钟。用2ml无菌PBS(pH＝7.4)重悬噬菌体沉淀，瞬时离心。上清即为噬菌体抗体库，将此抗体库分装成小管，待用或存放-20℃。

1.2.11 噬菌体抗体库的亲和富集筛选

将用于筛选特异性抗体的抗原(rhTNFα)用0.1mol/LpH9.6碳酸钠一碳酸氢钠溶液做一定量稀释后包被96孔板，4℃过夜。次日洗去板内未吸附抗原，用3％BSA-PBS或用10％小牛血清37℃封闭1小时。弃封闭液，在每孔中加入50-70μl噬菌体抗体库，37℃孵育2小时。弃孔中未结合噬菌体，用TBS/Tween20(pH7.5的50mmol/Ltris-HCl，150mmol/L氯化钠，0.5％Tween20)洗液洗每一孔，共洗10～20遍，使充分洗去非特异性吸附噬菌体。用蒸馏水洗两遍，将每孔的液体吸干净。加入3～5μl 2mol/L tris碱，使溶液的pH值在7左右，以中和洗脱下来的噬菌体溶液。立即加入2ml新鲜制备的OD₆₀₀＝1左右的XLI-Blu菌，室温孵育15-20分钟。转入一200ml三角瓶中，加入10ml含有Amp和四环素双抗的2×YT培养液，立即取10μl噬菌体溶液，稀释成不同浓度以滴定洗脱下来的噬菌体，其余部分37℃振荡培养1小时。加入100ml含有Amp和四环素双抗的2×YT培养液，37℃振荡培养1小时。加入10¹²pfu辅助噬菌体VSCM13，37℃振荡培养2小时。加入50μg/ml卡那霉素，37℃振荡培养过夜。收集培养后的噬菌体如1.2.10所述。重复以上富集筛选步骤，直至投入产出比不再上升，经多轮富集筛选后，将洗脱下来的噬菌体感染新鲜制备的XLI-Blu菌，37℃培养过夜，保存长有单个菌落的平皿于4℃待用。

1.2.12辅助噬菌体毒种制备

从平皿中挑取单个XLI-Blu菌落接种入10ml含有四环素的2×YT培养液中。37℃振荡培养过夜。将上述过夜培养菌1∶500稀释入10ml含有四环素的2×YT培养液中，37℃振荡培养1小时。从噬菌体培养皿中挑取单个噬菌体病毒空斑，接种入上述10ml菌液中，37℃振荡培养2小时。加入含有10μg/ml四环素和50μg/ml卡那霉素的2×YT培养液，总量至500ml，37℃振荡培养过夜。3500-4000rpm 4℃离心15分钟。取上清，70℃裂解20分钟，再次离心。取上清，无菌分装小管中，存放4℃至少可使用半年，半年后需依此方法重新制备。

1.2.13噬菌体毒种的滴定

准备不含任何抗生素的LB培养平皿5-6个。用普通LB培养基制0.7％琼脂糖，即为表层琼脂糖，冷至42℃并在42℃保存。将上述噬菌体溶液作10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10稀释。取稀释的XLI-Blu菌，OD₆₀₀＝1左右，分装小试管，100μl/小试管，标明10^-6至10^-10稀释度。加入前步骤中依次稀释的噬菌体到每个相应的标准稀释度的试管中，37℃缓慢振荡反应20分钟。加入表层琼脂糖3ml至每个试管中，立即转入事先准备好的平皿置37℃培养过夜。计算平皿中的空斑数，与稀释倍数相乘，即为噬菌体的计数单位-pfu(particle formingunit)。

1.2.14 ELISA比较抗体相对亲和力

将rh-TNFα溶解于包被液(碳酸盐缓冲液pH9.6，4μg/ml稀释)，100μl/孔包被ELISA亲和96孔板，4℃放置8小时后，10％小牛血清37℃封闭1小时。PBST洗板三次，按50μl/孔加入不同浓度的噬菌体抗体，室温90分钟，PBST洗板三次，加入辣根过氧化物酶标抗体(HRP-antiM13，50μl/孔)，室温40分钟后，PBST洗板三次，以OPD显色系统显色，测OD492nm吸光度值。根据ELISA结果最终筛选得到与rh-TNFα结合活性大于Z12的噬菌体抗体克隆。

1.3 结果

1.3.1 rh-TNFα免疫小鼠血清效价测定、总RNA提取

从ELISA测定免疫小鼠血清效价的结果(图1.3.1.1)可以看到，经r-TNFα皮下、腹腔多点多次注射后的五只小鼠得到成功免疫，免疫血清效价平均达到1∶200000左右。

依照小鼠脾淋巴细胞分离实验方法及TRIzol Reagent提取细胞总RNA试验手册(Invitrogen公司提供)，提取成功免疫小鼠脾淋巴细胞总RNA(图1.3.1.2)。

1.3.2噬菌体抗体基因文库的获得

从小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA，经反转录，添加特异引物，用高保真DNA聚合酶扩增35个循环，可以得到约660bp的清晰条带，分别为抗体重链Fd段基因文库和轻链全长基因文库(图1.3.2.1)。

1.3.3  噬菌体抗体表达载体P3MH的鉴定、P3MH/Z12L和

P3MH/Z12H重组质粒的构建

借助噬菌体抗体表达载体P3MH的构建示意图(图1.3.3.1)，通过酶切电泳结果(图1.3.3.2)显示，载体p3MH被SacI、XbaI、XhoI及SpeI四种酶单酶切后，与空载体相比均呈线性化，表明载体p3MH上的SacI、XbaI、XhoI及SpeI四个酶切位点均完好无损，可以用于Fd和轻链全长基因的克隆。

用SacI、XbaI双酶切pGEM-T Easy/Z12κ，获得抗体的轻链全长基因。将其与经过SacI、XbaI双酶切的p3MH载体连接。经转化，挑克隆，提质粒，进行酶切鉴定(图1.3.3.3)，结果表明，样品2、3、4(图1.3.3.3)中的克隆经过SacI和XbaI的双酶切后，均得到660bp的轻链基因，而并未得到1.2Kb的片段，说明轻链基因已经克隆到p3MH载体上；将其进行测序(图1.3.3.4)，结果正确，表明成功构建P3MH/Z12L重组质粒。

采用同样的方法，将经过XhoI、SpeI双酶切的p3MH载体与上述从pGEM-T Easy/Z12Fd经XhoI、SpeI酶切得到的抗体重链Fd基因进行连接，构建原核表达重组质粒P3MH/Z12H。经转化，挑克隆，提质粒，进行鉴定(图1.3.3.5)，并测序(图1.3.3.6)成功，表明成功构建P3MH/Z12H重组质粒。

根据链替换(chain shuffling)原理实验的方法，将通过PT-PCR扩增得到的抗体重链基因文库和重组质粒p3MH/Z12L构建噬菌体抗体库(H/Z12κ)；同时，将抗体轻链基因文库和重组质粒p3MH/Z12H构建噬菌体抗体库(κ/Z12H)。通过噬菌体毒种滴定确定抗体库的库容，根据噬菌体毒种滴定确定噬菌体抗体库(κ/Z12H)和(H/Z12κ)均达到了1×10⁷。

1.3.4噬菌体抗体库(κ/Z12H)和噬菌体抗体库(H/Z12κ)亲和富集筛选

噬菌体抗体库的亲和富集筛选一般以投入产出比(O/I ratio)作为亲和富集指标。良好的富集筛选，经过每一轮筛选过后，投入产出比会以指数级增长。当其投入产出比不再增长，或者甚至出现负增长时，亲和富集筛选过程即可停止，否则，亲和富集筛选过程可以一直进行，直到出现上述情况为止(表1.3.4.1)。

                表1.3.4.1  噬菌体抗体库亲和富集筛选

                             噬菌体数量(pfu)筛选轮次   产出噬菌体    投入噬菌体     O/I比抗体库(κ/Z12H)    1    2    3    4    5抗体库(H/Z12κ)    1    2    3    4    7×10⁶    6.8×10⁷    6×10⁸    4×10⁹    1×10⁹    1×10⁷    9×10⁷    8×10⁸    6.2×10⁸    1.25×10¹¹    1.2×10¹¹    1.2×10¹¹    1.2×10¹¹    1.2×10¹¹    1.2×10¹¹    1.2×10¹¹    1.2×10¹¹    1.2×10¹¹    6×10^-5    5.7×10^-4    5×10^-3    3×10^-2    8.4×10^-3    8.3×10^-5    7.5×10^-4    6.7×10^-3    5.2×10^-3

1.3.5通过ELISA比较噬菌体筛选抗体的相对亲和力

将亲和富集筛选后得到的单个克隆噬菌体，通过侵染宿主菌得到噬菌体抗体，与噬菌体抗体Z12比较对r-TNFα的结合力。采用ELISA比较各噬菌体抗体与r-TNFα相对亲和力得到的阳性克隆(部分阳性结果见图1.3.5.1)，通过这种方法共筛选了108个噬菌体抗体克隆，其中得到18个抗体相对亲和力高于Z12的噬菌体抗体(见表1.3.5.1)。

         表1.3.5.1噬菌体抗体鉴定结果

 克隆总数  阳性克隆噬菌体抗体库(κ/Z12)噬菌体抗体库(H/Z12 )    38    70    4    14

2、计算机辅助筛选潜在高亲和力嵌合抗体

2.1 方法

2.1.1  噬菌体抗体阳性克隆的序列测定

将P140Fab抗体基因PCR扩增产物分别克隆至pGEM-T Easy载体上，经酶切鉴定无误后(图2.2.1.1)，交与测序公司进行测序。

2.1.2  嵌合抗体可变区三维构象的模拟

利用蛋白质结构数据库(Protein Data Bank，PDB)，通过序列比对(选择Fasta3、Blastp程序)、Kabat分析，确定其母本模型。借助同源模建(Homology)方法对测定的抗体可变区进行空间构象的模拟。在CVFF、Amber力场下，选择分子力学、动力学动态模拟对其构象进行能量优化(依次经过最陡下降(收敛判据0.05KJ/mol，收敛步骤5000步)、共轭梯度(收敛判据0.01KJ/mol，收敛步骤10000步))。

2.1.3  嵌合抗体可变区与TNFα相互作用复合物空间构象的模拟

借助TNFα晶体结构模型(PDB号：1tnf)，利用分子对接程序对嵌合抗体与TNFα相互作用的复合物结构进行探讨。遵循“结构互补、静电匹配”原则，在CVFF、Amber力场下，经分子力学、动力学动态模拟对嵌合抗体与TNFα相互作用模式的最佳匹配程度进行理论预测。

2.1.4  高中和活性嵌合抗体的确定

结合反应自由能理论、分子间氢键形成理论，借助母本抗体Z12与TNFα相互识别模式，确定具有高中和活性、高亲和力的抗体。

2.2结果

2.2.1  利用噬菌体抗体库筛选的阳性抗体的克隆、测序

将P140Fab抗体基因PCR扩增产物分别克隆至pGEM-T Easy载体上，经酶切鉴定无误后(图2.2.1.1)，交与测序公司。共得到全新抗体轻链全长基因序列信息4个，重链Fd段基因序列信息14个。部分测序结果如下：由于抗体基因序列信息较多，测序结果仅以抗体H22重链Fd段基因和抗体Ke轻链全长基因序列为例(图2.2.1.2和2.2.1.3)。

2.2.2  抗体可变区序列分析

利用www.expasy.ch对测序获得的抗体可变区碱基序列进行翻译，获得其氨基酸序列(图2.2.2.1)。通过Kabat数据库对抗体可变区序列进行FR、CDR分类分析(图2.2.2.2)。

2.2.3  抗体可变区空间构象的获得

在图形工作站Octane2(R12000)上，利用InsightII2000程序包构建筛选抗体可变区空间构象。图2.2.3.1、图2.2.3.2、图2.2.3.3分别给出了抗体可变区A2H、A4H、CH22空间构象示意图。

2.2.4  抗原一抗体作用复合物的构建、高亲和力抗体的确定

图2.2.4.1、图2.2.4.2、图2.2.4.3分别给出了抗体可变区A2H、A4H、H22与TNFα相互作用的复合物模型。表2.2.4.1列出了抗体可变区与TNFα相互作用模式及识别区域。通过相互作用的自由能、分子间氢键形成数目及识别区域确定CH22具有高于母本抗体Z12亲和能力的理想抗体。

                 表2.2.4.1  抗体—抗原作用模式分析

抗体         分子间氢键        相互作用能(KJ)           主要识别区域

 Z12             31                -413.88                135-150

 H22             36                -425.37                136-149

 A2H             19                -289.54                86-97

 A4H             24                -345.21                137-145

利用阿仑纽斯公式计算，可以初步得出，CH22抗体的亲和能力较母本抗体Z12亲和能力高～120倍。

通过计算机辅助分析，确定嵌合抗体CH22识别的hTNF-α功能表位141-146位；同时确定嵌合抗体CH22保持其生物学效应的56个重要残基(抗体重链可变区V_H：26-31，48-52，90-95，66-68；抗体轻链可变区V_L：26-33，52-65，72-76，98-106)。

3、高亲和力抗体CH22的生物学功能测定

3.1  材料

菌株和质粒

大肠杆菌JM109菌、XLI-Blu菌、BL21菌(Invitrogen)，单链抗体表达载体PET32-c(Novagen)，CHO细胞(ATCC，美国)，PWS3载体(白银，俞莉章，吕英谦，艾军魁等，中华医学杂志，2003，83(4)：333-338)

工具酶、试剂

限制性内切酶：NcoI、BssHII、BstEII、XhoI、XbaI、BamHI、HindIII及EcoRV购自New England Biolabs公司；T4 DNA连接酶、WizardDNA纯化试剂盒、pGEM-T Easy载体试剂盒为Promega公司产品；DNA片段回收试剂盒、Taq DNA聚合酶、DNA分子量标准DL2000购自TaKaRa公司；焦炭酸二乙酯(DEPC)为Sigma产品；HisTrap(镍离子螯合柱)购自Novagen公司；Lipfectamine2000为GIBCO公司产品；DMEM培养基、胎牛血清、羊抗鼠Fab多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgGFc(美国Sigma)，其他常用化学试剂均为进口或国产分析纯。限制性内切酶购自New England Biolabs公司；T4 DNA连接酶、pGEM-T Easy载体试剂盒、逆转录酶购自Promega公司；PyrobestDNA聚合酶、DNA分子量标准DL2000购自TaKaRa公司；TRIzolReagent购自Invitrogen公司；二磷酸腺苷(ADP)为Biopool产品；DNA片段回收试剂盒购自OMEGABIO-TEK公司；质粒回收试剂盒购自天为时代公司；辣根过氧化物酶标记的anti-M13抗体购自amershampharmacia公司；其他常用化学试剂均为进口或国产分析纯。

3.2方法

3.2.1  真核表达载体PWS3H22的构建及表达

由于通过抗体库获得的抗体基因不具有前导肽序列，所以首先根据BLAST分析，设计出最优化的抗体前导肽序列。结合分析表达载体PWS3的顺式作用元件后，重新设计引物，将分别克隆在pGEM-TEasy载体H22重链和轻链可变区基因通过PCR扩增出来，克隆到PWS3表达载体中，构建PWS3H22真核表达载体，进行真核转染。转染基本参数包括：(1)CHO细胞密度为1×10⁵个/ml，在转染前一天接种到直径100mm的细胞培养皿中，细胞培养过夜，(2)当细胞达到80％贴壁时，将完全培养液移去，换无血清培养基孵育2-8小时，(3)将经酶切鉴定无误的表达载体4μg，10μl脂质体分别溶于250μl无抗生素、无血清的DMEM培养基中，充分混匀后，室温放置5分钟，再将两种溶液充分混匀，室温放置30分钟。同时用无抗生素、无血清DMEM洗涤待转染培养细胞两次，向DNA-脂质体混合物中加入2.5ml无抗生素、无血清的DMEM培养基，混合后加入培养细胞中。将培养瓶放入37℃孵箱孵育6小时后吸去培养液，(4)将转染液弃去，(5)加入5ml含抗生素和10％小牛血清的DMEM培养基，继续培养约24小时。待细胞长满后，换成无血清的DMEM培养基。(6)60小时收上清，将细胞转入稳定表达，加压筛选。

3.2.2嵌合抗体CH22纯化

含嵌合抗体CH22培养液用0.1mol/LpH8.0PB透析过夜后，上样于Protein A Sephorase CL-4B层析柱，用相同缓冲液洗脱杂蛋白后，用pH6.0柠檬酸缓冲液洗脱CH22，收集洗脱峰并浓缩。

3.2.3 CH22与TNF-α特异性结合实验

分别将hTNF-α以一定浓度包被ELISA亲和96孔板及SDS-PAGE分离，ELISA及Western blot试验分析鉴定ScFv-H22与TNF-α特异性结合。ELISA、Western blot试验基本操作见(《分子克隆》)。

3.2.4 CH22抗原识别表位确定实验

将含有hTNF-α、hTNF-αD141-146的超声上清，用包被液稀释成10μg/ml进行包被。100μl/孔包被ELISA亲和96孔板，4℃放置8小时后，2％BSA封闭过夜。PBST洗板三次，加入CH22按100μl/孔进行ELISA检测。室温90分钟，PBST洗板三次，加入辣根过氧化物酶标抗体(HRP-GAH，购自PIERCE公司)50μl/孔，室温40分钟后，PBST洗板三次，以OPD显色系统显色，测A_492nm吸光度值。

3.2.5  L929细胞毒中和实验

L929是小鼠成纤维细胞系，它对于TNF-α高度敏感，生长环境中存在ng水平的TNF-α即可以导致L929细胞大量死亡。本试验首先取生长旺盛的L929细胞，按照TNF-α生物学活性测定方法确定其活性单位(IU)，然后以10IUTNF-α与不同浓度的抗TNF-α抗体混合并与L929细胞(3×10⁴、孔)一同加入96孔培养板，同时加放线菌素D(0.1μg/孔)，37℃，5％CO₂条件下培养20小时，用结晶紫染色后，加入33％乙酸，自动酶联仪测定A_570nm。

3.2.6嵌合抗体CH22亲和力测定

按照经典测定抗体亲和力方法—Scatchard分析的方法设计试验，首先将抗原(hTNF-α)浓度固定，按照一定浓度稀释抗体(CH22)，得到抗体CH22与hTNF-α结合的标准曲线。在此基础上，在抗体与抗原结合的饱和浓度范围内，取若干浓度作为抗体亲和力测定的标准浓度点，测定结合抗体及未结合抗体的浓度，根据公式B/F＝Ka(S-B)；其中B：代表结合抗体浓度，F：代表游离抗体浓度，S：代表抗体总浓度

3.2.7嵌合抗体CH22、Remicade^识别位点、亲和能力、中和活性比较

为了进一步确定嵌合抗体CH22的生物学效应，选择已经通过FDA批准的临床治疗抗体Remicade^作为对照进行实验。利用hTNF缺失突变体(hTNF_23-89[表示缺失23-89位残基]、hTNF_53-92、hTNF_141-146)对二者的识别位点进行分析，利用ELISA及细胞毒实验对二者的亲和能力、中和活性进行比较。

3.3  结果

3.3.1  重组表达质粒PWS3H22的构建及鉴定

取测序分析正确的克隆，分别用XbaI、BamHI消化pGEM-TEasy/H22VκS，用XhoI、HindIII消化pGEM-T Easy/H22VHS，入胶回收纯化后，将H22VκS和H22VHS片段分别克隆在经酶切(BamHI/XbaI、XhoI/HindIII)的PWS3表达载体上(图3.3.1.1和图3.3.1.2)。

3.3.2  CH22与hTNF-α特异性结合的检测

分别通过ELISA和Western blot试验证明经过真核表达和纯化后得到的CH22能够与hTNF-α特异性结合，证明通过以上方法筛选得到的抗体保留了母本抗体Z12的识别特异性。(图3.3.2.1)

3.3.3  CH22抗体分子鉴定

含嵌合抗体CH22真核细胞表达上清，经过Protein ASephorase CL-4B层析柱纯化后，SDS-PAGE电泳分析，得到分子量为155kDa蛋白条带(图3.3.3.1)，与人IgG和Remicade^嵌合抗体分子量相同。

3.3.4  CH22抗原识别表位确定试验

理论预测结果显示，抗体CH22的抗原识别表位与母本抗原Z12保持一致，我们将hTNFαD29-88缺失突变体、hTNFαD53-91缺失突变体、hTNFαD141-146缺失突变体、hTNF分别进行原核表达，并将表达上清包被在亲和96孔板中，通过ELISA检测几种不同的抗hTNFα抗体与其二者识别差异，从而确定抗体的抗原识别位点，并与Remicade^抗体和Enbrel^识别位点进行比；结果显示，Z12和CH22抗原识别位点保持一致，而与Remicade^(经FDA批准上市的抗hTNFα嵌合抗体)和Enbrel^不同。(图3.3.4.1)

3.3.5  L929细胞毒中和实验

Z12具有良好的中和hTNF-α细胞毒的能力，L929细胞毒中和试验结果表明，(表3.3.5.1)抗体CH22保持了Z12的中和功能，并且在此基础上有所提高，提示其具有良好的临床应用前景。

         表3.3.5.1抗TNF-α抗体中和细胞毒比较

    项目对TNF-α的中和滴度^*    中和率(％)    Z12(阳性对照)    CH22    PBS(阴性对照)    1,000    50,000    ＜1    75.4±9.3    86.6±11.7    0.65+0.07

^*滴度定义为抑制10U/ml TNF-α的细胞毒效应的最高样品稀释度的倒数。

3.3.6  嵌合抗体CH22亲和力测定

根据经典测定抗体亲和力方法-Scatchard分析的方法测定的结果，将测得的数据拟合成一条直线，求得这条直线的负斜率即为抗体CH22亲和常数(K_a)结果见图3.3.5.1。

                    序列表

<110>北京天广实生物技术有限公司

<120>TNFα高亲和力嵌合抗体及其用途

<130>1040003

<160>27

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>223

<212>蛋白质

<213>小鼠

<400>1

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

            20                  25                  30

Val Leu His Trp Leu Gln Pro Lys Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Ile

        35                  40                  45

Gly Tyr Val Tyr Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Gln Tyr Asn Glu Arg Phe

    50                  55                  60

Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met Asp Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Phe Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Gly Trp Leu Gln Arg Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

            100                 105                 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser

        115                 120                 125

Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val

    130                 135                 140

Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu

145                 150                 155                 160

Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

                165                 170                 175

Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr

            180                 185                 190

Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro

        195                 200                 205

Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Ser Gly Pro

    210                 215                 220

<210>2

<211>212

<212>蛋白质

<213>小鼠

<400>2

Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Val Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Asn Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

            20                  25                  30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

        35                  40                  45

Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu

65                  70                  75                  80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Ser Pro Thr

                85                  90                  95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr

            100                 105                 110

Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala

        115                 120                 125

Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val

    130                 135                 140

Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser

145                 150                 155                 160

Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr

                165                 170                 175

Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys

            180                 185                 190

Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn

        195                 200                 205

Arg Asn Glu Cys

    210

<210>3

<211>10

<212>蛋白质

<213>小鼠

<400>3

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Leu His

1               5                   10

<210>4

<211>17

<212>蛋白质

<213>小鼠

<400>4

Tyr Val Tyr Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Gln Tyr Asn Glu Arg Phe Arg

1               5                   10                  15

Gly

<210>5

<211>12

<212>蛋白质

<213>小鼠

<400>5

Gly Trp Leu Gln Arg Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val

1               5                   10

<210>6

<211>10

<212>蛋白质

<213>小鼠

<400>6

Asn Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr

1               5                   10

<210>7

<211>7

<212>蛋白质

<213>小鼠

<400>7

Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1               5

<210>8

<211>9

<212>蛋白质

<213>小鼠

<400>8

Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Ser Pro Thr

1               5

<210>9

<211>32

<212>DNA

<213>合成的

<400>9

ccagttcgga gctcgttgtg actcaggaat ct                                      32

<210>10

<211>32

<212>DNA

<213>合成的

<400>10

ccagttccga gctcgtgttg acgcagccgc cc                                    32

<210>11

<211>32

<212>DNA

<213>合成的

<400>11

ccagttccga gctcgtgctc acccagtctc ca                                    32

<210>12

<211>32

<212>DNA

<213>合成的

<400>12

ccagttccga gctccagatg acccagtatc ca                                    32

<210>13

<211>32

<212>DNA

<213>合成的

<400>13

ccagatgtga gctcgtgatg acccagactc ca                                    32

<210>14

<211>32

<212>DNA

<213>合成的

<400>14

ccagatgtga gctcgtcatg acccagtctc ca                                    32

<210>15

<211>32

<212>DNA

<213>合成的

<400>15

ccagttccga gctcgtgatg acacagtctc ca                                    32

<210>16

<211>31

<212>DNA

<213>合成的

<400>16

ccgactagtt catttcagct ccagccaggt g                                     31

<210>17

<211>30

<212>DNA

<213>合成的

<400>17

ctcgacacta gttttgcgct caactgtctt                                       30

<210>18

<211>30

<212>DNA

<213>合成的

<400>18

tgtgtgacta gtgtcaccaa gtggggtttt                                       30

<210>19

<211>30

<212>DNA

<213>合成的

<400>19

gcatgaacta gttgggggac catatttgga                                       30

<210>20

<211>21

<212>DNA

<213>合成的

<400>20

aggtctcgag ctcgagtctg g                                                21

<210>21

<211>21

<212>DNA

<213>合成的

<400>21

aggtctcgag ctcgagtcag g                                                21

<210>22

<211>21

<212>DNA

<213>合成的

<400>22

aggtctcgag tccgagtctg g                                                21

<210>23

<211>21

<212>DNA

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