用于检测SARS疫苗中残留DNA含量的非洲绿猴的Alu序列

摘要

本发明涉及用于检测SARS疫苗残留DNA含量的非洲绿猴的Alu序列，以及利用所述序列的检测方法。

说明书

发明领域

本发明涉及用于检测SARS疫苗残留DNA含量的非洲绿猴的Alu序列，以及利用所述序列的检测方法。

发明背景

Alu序列是人类、灵长类和啮齿动物染色体上的中等重复序列，因为含有限制性内切酶Alu位点而得名，大约有300,000个拷贝。Alu序列长约280bp，序列的左半部120bp和右半部150bp是两个相似的单位，中间被富含A的区域隔开，在不同Alu家族中5’端比较保守，3’端则由比较有变化的多聚A组成。Alu序列的侧翼还有7-20bp的直接重复，在不同Alu家族中并不保守，而是独特的(Schmid CW，JelinekWR.The Alu family of dispersed repetitive sequences.Science，1982，216：1065-1070)。Grimaldi等对非洲绿猴的Alu序列进行了研究，其Alu序列的分布间隔是8kb，非洲绿猴基因文库中75％的克隆能与人的Alu序列杂交，其Alu序列在DNA顺序、散在性分布方式以及拷贝数等方面与人类是非常相似的(Grimaldi G，Queen C，Singer MF，Intrspersed repeated sequences in the African green monkey genomethat homologous to the human Alu family.Nucleic Acids Research，1981，9(21)：5553-5567)。

过去认为在人类基因组中Alu序列占到3-6％，并且是均一分布的。最近根据人类基因组图谱研究，Alu序列占到10％，其分布不是均匀的，但仍然可以肯定它是散在分布的(Batzer MA，Deininger PL，Alu repeats and human genomic diversity.Nature reviews genetics，2002，3：370-379)。Alu序列的这种散在性及高拷贝性使之可以作为基因组DNA的代表，因此世界卫生组织推荐使用多拷贝基因Alu序列作为探针对疫苗制品痕量DNA进行定性或定量检测。

目前尚未开发出一种简单而且重复性稳定的探针，用于以Vero细胞作为基质制备的疫苗中残留DNA的检测。

发明内容

本发明的一个方面涉及用于检测SARS疫苗中残留DNA的非洲绿猴Alu序列。具体的，所述SARS疫苗为以Vero细胞作为基质的疫苗。

本发明所述非洲绿猴Alu序列选自具有SEQ ID NO：1所示的核酸序列和具有SEQ ID NO：2所示的核酸序列。

在本发明的再一方面涉及利用所述非洲绿猴Alu序列检测SARS疫苗中残留DNA的方法。

在本发明的一个优选实施方案中，利用所述非洲绿猴Alu序列检测SARS疫苗中残留DNA的方法包括如下步骤：

1)将所述的Alu序列进行标记；

2)分别将不同浓度的Vero DNA参比标准以及待测样品预杂交；

3)加入步骤1)中经标记的探针；

4)样品DNA残留量通过与参比Vero细胞DNA杂交信号强度相比较以及样品的体积而确定。

本发明所述方法中采用地高辛序列标记的Alu序列探针进行点杂交，可以特异识别Vero细胞DNA，其识别灵敏度为10pg。因此可以用于SARS灭活疫苗的质量控制，还可以检测其它以Vero细胞作为基质制备的疫苗残留DNA。可以有效监控残留DNA含量，为生产工艺提供指导。

本发明的另一个方面涉及本发明所述非洲绿猴Alu序列用于检测SARS疫苗残留DNA的用途。

附图说明

图1是PCR扩增Alu片段的琼脂糖电泳结果，其中，M：DGL 2000DNA Marker，从上至下分别为2kb，1.6kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp.1：PCR扩增的290bp Alu片段。

图2是T-Alu质粒的酶切鉴定的琼脂糖电泳结果。

M：DGL 2000DNA Marker，从上至下分别为2kb，1.6kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp.1-6：6个质粒的NcoI和SalI双酶切鉴定；

图3是pT-Alu结构示意图。

图4显示Alu序列探针的特异性和灵敏性。其中泳道1为阴性对照TE buffer，2-6：Vero细胞DNA浓度分别为1pg，10pg，100pg，1ng，10ng；

图5是SARS灭活疫苗制备过程中的点杂交结果。其中第一行是参比Vero细胞DNA标准，第二行是超滤液，第三行是纯化液。

实施例1非洲绿猴Alu序列的制备

PCR方法扩增Alu序列

以GeneBank中的非洲绿猴Alu序列X01476做为参考设计PCR引物。上游引物P1：5’-gct，ttg，agg，ccg，ggc，ggg，atg-3’(21bp，SEQ IDNO：3)，下游引物P2：5’-ctc，tct，ctt，aga，gtc，ttg，ctc，tg-3’(23bp，SEQID  NO：4)。PCR反应参数为：98℃变性5min，94℃ 25sec，68℃30sec，72℃30sec，30个循环，72℃延伸10min。PCR扩增后经电泳检查可见到290bp条带(图1)。

(2)Alu序列的克隆

将PCR产物克隆于Promega公司的pGEM-T上，转化E.coliJM109菌株，通过小量提取质粒，NcoI和SalI双酶切鉴定，得到若干个含有290bp插入片段的阳性克隆(图2)，挑选一个克隆命名为T-Alu，其结构如图3所示。

实施例2利用非洲绿猴Alu序列检测疫苗中残留DNA的方法

将300ng纯化回收的Alu序列NcoI和SalI酶切片段按照Roche公司地高辛DNA标记和检测试剂盒的说明书进行标记。SARS疫苗中残留DNA的检测采用点杂交法。

首先，裁取一块所需大小的尼龙膜，分别将10gn，1ng，100pg，10pg的Vero DNA参比标准分别点于膜上，再将待测样品按不同稀释度点于膜上。膜分别经过变性液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)，中和液(0.5M Tris pH7.0，1M NaCl)，2XSSC各5分钟，然后在紫外交联仪中45J交联5分钟。将膜于杂交袋中预杂交1小时后加入探针杂交过夜，洗膜之后加入抗地高辛的二抗孵育，经过洗膜后进行生色反应。样品DNA残留量通过与参比Vero细胞DNA杂交信号强度相比较以及样品的体积而确定。地高辛标记的Alu序列探针与点于尼龙膜上的Vero细胞DNA进行点杂交。

阴性对照无杂交信号，对于不同浓度的Vero DNA该探针能够特异性识别，杂交信号强度与DNA浓度成正比，对1pgVero细胞DNA检测不到杂交信号，可见此地高辛标记探针灵敏度是10pg(图4)。

本方法可以有效监控残留DNA含量，为生产工艺提供指导。图5显示某批疫苗制备的超滤液阶段，残留Vero DNA含量是50ng/ml，在纯化液阶段残留Vero DNA含量是5ng/ml，达到国家食品药品监督管理指标。

序列表

<110>北京科兴生物制品有限公司

<120>用于检测SARS疫苗中残留DNA的非洲绿猴Alu

<130>IDC030117

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>293

<212>DNA

<213>非洲绿猴

<400>1

gctttgaggc cgggcgggat ggctccagcc tgtaatccca gcactttggg aggccgagac    60

gggcggatca caaggtcagg agatcgagac catcctggct aacacggtga aaccccgtct    120

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tcgggaggct gaggcaggag aatggcataa acccgggagg cggagcttgc agtgagctga    240

gatccggcca ccgcactcca gcctgggcca cagagcaaga ctctaagaga gag           293

<210>2

<211>289

<212>DNA

<213>非洲绿猴

<400>2

gctttgaggc cgggcgggat ggctcagcct gtaatcccag cacgttggga ggctgaggcg    60

ggaggatcac gaggtcagga gttcaaaact agcccaacca aaatggtgaa accctgtctc    120

tactaaaaat acaaaaatta tctgggtgtg atggcgcgtg cctgtaatcc cagctactca    180

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cacgccactg cactccagcc tggggacaga gcaagactct aagagagag                289

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>引物

<400>3

gctttgaggc cgggcgggat g                              21

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>引物

<400>4

ctctctctta gagtcttgct ctg                            23