一种提高微藻生物量及其生理活性产物产量的方法

摘要

本发明涉及采用超声波处理提高微藻生物量及其生理活性产物产量的方法。本发明参照均匀设计表实验方案，通过均匀设计优化，运用DPS软件进行回归分析并建立相应的模型，确定在微藻生长过程不同的时间段所采用的超声波处理微藻时的电流、处理时间和脉冲时间的剂量，具体是：将微藻培养液装于250mL三角瓶中培养，于培养周期中的1－6天内某一时间段，用电流为21－39％、脉冲5.0－9.5s和处理时间45－205s的某一因素值进行超声波处理，其生物量、胞外多糖、藻胆蛋白、不饱和脂肪酸的含量分别有较大的提高。本发明所采用的超声波处理处理方法，具有设备简单、方法易行、操作安全，可使微藻生物量、胞外多糖、藻胆蛋白、不饱和脂肪酸等生理活性产物产量提高10％－60％，有较大推广价值。

说明书

技术领域

本发明涉及采用超声波处理提高微藻生物量及其生理活性产物产量的方法。

背景技术

超声波在物质介质中的相互作用机制可分为加热作用、空化作用及机械传质作用，其作用的强弱与超声波的频率和强度有关。低强度超声波依靠机械振动和稳态空化效应使传质边界层减薄，溶质粒子运动加速，提高生物反应速度；适宜的低强度超声波作用于动植物细胞会产生胞内微流、胞内物质的旋转及涡流运动，提高细胞膜和细胞壁穿透性，这些效应可以提高细胞的新陈代谢功能。低频率、低功率的超声波处理，可在细胞表面造成微伤，使细胞壁局部破裂，从而改变细胞质膜的通透性，使胞内物质释放或使胞外物质进入细胞内(ChistiY等，Trends Biotechnol，2003；王武等，无锡轻工大学学报，2002)。用超声波处理生产ATP的啤酒酵母后，细胞膜的通透性比其他方法处理得更高(段学辉等，华东理工大学学报，2000)。废纸发酵生产酒精过程中，用超声处理可使酒精产量提高近20％。青霉素发酵过程经超声波处理，青霉素产量可提高10％以上(王武等，无锡轻工大学学报，2002)。超声波用于提高污泥厌氧消化处理效果(Hogan F等，Water Sci Technol，2004)，用超声波辅助的方法提高污水污泥消化中可溶性化合物的氧需求(Gronroos A等，Ultrason Sonochem，2005)。超声波强度和反应器规模对连续光照搅拌罐中各种废纸的酶糖化作用动力学产生影响(Li C等，Ultrason Sonochem，2005)。超声波用于微藻代谢产物的代谢调控方面的报道少见，它对湛江等鞭金藻的生物学效应显著，使藻生长速率常数、脂肪酸不饱和度提高(李文权等，海洋学报，2002)。用于控制富营养化湖水的蓝藻水华(Lee TJ等，Water Sci Technol，200；Ahn CY等，Environ Sci Technol，2003)，用于分裂螺旋藻细胞进行大规模快速和选择性的提取藻蓝蛋白(Furuki T等，J Appl Phycol，2003)，生物净化水质(Mason TJ等，Ultrason Sonochem，2003)，收获微藻(BosmaR等，J Appl Phycol，2003)。高频率(1.7MHz)、低强度(0.6Wcm^-2)的超声波能有效抑制蓝藻细胞的快速增殖，经过超声辐照过的细胞生长速率降低为对照组的38.9％(Tang JW等，J Appl Phycol，2003)。利用超声波能促进微生物细胞生长、加强生物催化能力，已研制或有概念性的超声波生物反应器面世(Chisti Y等，Trends Biotechnol，2003)。

紫球藻(Porphyridium cruentum)属红藻门的单细胞藻，富含多种生物活性物质，其蛋白质含量为32.1％，氨基酸含量为29.54％；碳水化合物39.4％，总膳食纤维21.7％；灰份17.6％，水分7.8％，每千克干藻粉钙、镁、钾和锌含量分别为20000mg、4100mg、9500mg和92mg；每千克干藻粉β-胡萝卜素240mg、维生素B618mg；有毒重金属铅、砷和汞含量符合有关规定(黄键等，食品与发酵工业，2005)。近年来的研究表明紫球藻及其胞外多糖具有(1)抗病毒作用；(2)调血脂作用(陈必链等，应用与环境生物学报，2004)；(3)抗炎作用或抗肿瘤细胞作用；(5)抗辐射作用；(6)降血糖作用(刘丽平等，中国海洋药物，2005)。由于紫球藻及其胞外多糖药效学的研究已取得明显进展，因此提高紫球藻生物量和生理活性产物产量，降低生产成本成为当今研究的热点和难点。

蔷薇藻(Rhodella reticulata)是与紫球藻同属红藻门的单细胞藻，细胞外包被着一层粘质鞘，由细胞生长进入稳定期后产生胞外水溶性粘多糖形成。蔷薇藻含丰富的藻胆蛋白、胞外多糖和不饱和脂肪酸等天然产物。尤其胞外多糖的物化性质与紫球藻极为相似(Geresh S等，J Biochem Biophys Methods，2002)，因此，可能具有类似紫球藻及其胞外多糖的抗病毒、降血糖以及降血脂等功能，国外许多学者围绕蔷薇藻的胞外多糖、藻胆蛋白、光合系统等方面进行了研究(Mihova SG等，J Biotechnol，1996)，取得了良好的进展。

微绿球藻(Nannochloropsis sp)是金藻门的一种海洋单细胞微藻，具有易培养、繁殖迅速、营养丰富的特点，在水产养殖中应用较为广泛，近年来在泥蚶、蟹(沈和定等，上海水产大学学报，1999)、虾(成文靖等，水利渔业，2002)等育苗及轮虫(刘新富等，海洋科学，2002；Lubzens E等，Aquaculture，1995；Chebil L等，Aquacultural Eng，1998)培养中应用较佳的优良饵料。藻粉含有37.6％可利用碳水化合物，28.8％粗蛋白质和18.4％总脂肪，还含有Ca、K、Na、Mg、Zn、Fe、Mn、Cu、Ni，脂肪酸含量：5.0％16∶0，4.7％16∶1ω7，3.8％18∶1ω9，0.4％18∶2ω6，0.7％20∶4ω6和2.2％20∶5ω3(Rebolloso-Fuentes MM等，AgricFood Chem，2001)。在富含氮、磷的培养基中，该藻EPA含量可达到总脂肪酸的35％(魏东等，海洋科学，2000)。目前，国际市场上密度为12×10⁹cells/mL藻液售价76欧元/L(http：//www.bluebiotech.de)。因此，如何提高微绿球藻培养密度和脂肪酸含量，成为国际上藻类学研究的热点之一。

发明内容

本发明的目的就是参照均匀设计表中的“3因素7水平7组”实验方案，通过均匀设计优化，运用DPS软件对均匀设计结果进行回归分析并建立相应的模型，确定在微藻生长过程不同的时间段所采用的超声波处理微藻时的电流、处理时间和脉冲时间的“3因素7水平”的剂量，实现提高微藻生物量和生理活性产物量(胞外多糖、藻胆蛋白或不饱和脂肪酸)的目的。

本发明所述的3因素7水平的取值分别为电流：21％～39％，处理时间：5s～245s，脉冲：0.5s～9.5s。

本发明所述的在微藻生长过程中超声波进行处理的时间段为：每天处理1次、每天处理2次、隔天处理1次、第4天处理1次或第6天处理1次。

本发明所述的薇藻是指红藻门的单细胞类群的紫球藻、蔷薇藻和金藻门的微绿球藻。

为实现本发明的目的所采用的技术方案如下：

将微藻培养液装于250mL三角瓶中培养，于培养周期中的1-6天内某一时间段，用电流为21-39％、脉冲5.0-9.5s和处理时间45-205s的某一因素值进行超声波处理，其生物量、胞外多糖、藻胆蛋白、不饱和脂肪酸的含量分别有较大的提高。

1、当用超声波处理微藻培养液以提高生长生物量时，将微藻培养液装于250mL三角瓶中于培养的第一天，采用剂量为电流27-39％、脉冲6.5-9.5s和处理时间125-165s对微藻培养液第4天处理1次。培养周期结束后，以收获时的生物量与未经处理的微藻相比，提高了13-31.5％。

2、当用超声波处理微藻培养液以提高胞外多糖含量时，将微藻培养液装于250mL三角瓶中培养，采用剂量为电流21-30％、脉冲5.0-9.5s和处理时间125-205s对微藻培养液进行隔天处理1次或第6天处理1次。培养周期结束后，以收获时的生物量与未经处理的微藻相比，胞外多糖提高了38-46.5％。

3、当用超声波处理微藻培养液以提高藻胆蛋白含量时，将微藻培养液装于250mL三角瓶中培养，采用剂量为电流21-36％、脉冲5.0-8.0s和处理时间45-165s对微藻培养液培养至第4天处理1次或第6天处理1次。培养周期结束后，以收获时的生物量与未经处理的微藻相比，藻胆蛋白提高了13-18.5％。

4、当用超声波处理微藻培养液以提高不饱和脂肪酸时，将微藻培养液装于250mL三角瓶中培养，采用剂量为电流21-36％、脉冲5.0-6.5s和处理时间85-125s对第1天微藻培养液处理1次。培养周期结束后，以收获时的生物量与未经处理的微藻相比，不饱和脂肪酸提高了13-18.5％。

本发明所采用的超声波处理处理方法，具有设备简单、方法易行、操作安全，可使微藻的生物量、胞外多糖、藻胆蛋白、不饱和脂肪酸等生理活性产物产量提高10％-60％，有较大的推广价值。

具体实施方案

下面结合具体的实施实例对本发明做进一步的说明。

实施例1

将紫球藻(Porphyridium cruentum)培养液装于250mL三角瓶中培养，于培养的第一天，按照剂量为电流39％、脉冲9.5s和处理时间125s因素指标，将超声波仪(VC750，Sonics and materials，Inc，USA)调整好后，对微藻培养液第4天处理1次。培养周期结束后，以收获时的生物量与未经处理的紫球藻相比，提高了25.5％。同时，胞外多糖、藻胆蛋白、不饱和脂肪酸的含量也相应有所提高。

实施例2

将蔷薇藻(Rhodella reticulata)培养液装于250mL三角瓶中培养，于培养的第一天，按照剂量为电流27％、脉冲8.0s和处理时间165s因素指标，将超声波仪(VC750，Sonics and materials，Inc，USA)调整好后，对微藻培养液第4天处理1次。培养周期结束后，以收获时的生物量与未经处理的蔷薇藻相比，提高了28.5％。同时，胞外多糖、藻胆蛋白、不饱和脂肪酸的含量也相应有所提高。

实施例3

将微绿球藻(Nannochloropsis sp)培养液装于250mL三角瓶中培养，于培养的第一天起，按照剂量为电流27％、脉冲6.5s和处理时间165s因素指标，超声波仪(VC750，Sonics and materials，Inc，USA)调整好后，对微藻培养液进行隔天处理1次。培养周期结束后，以收获时的生物量与未经处理的微绿球藻相比，生物量提高了32.5％。同时，不饱和脂肪酸和藻胆蛋白的含量也相应有所提高。

实施例4

将紫球藻(Porphyridium cruentum)培养液装于250mL三角瓶中培养，按照剂量为电流24％、脉冲9.5s和处理时间205s因素指标，将超声波仪(VC750，Sonics and materials，Inc，USA)调整好后，对微藻培养液隔天处理1次。培养周期结束后，以收获时的胞外多糖含量与未经处理的紫球藻相比，胞外多糖提高了45.5％。同时，生物量、藻胆蛋白、不饱和脂肪酸的含量也相应有所提高。

实施例5

将蔷薇藻(Rhodella reticulata)培养液装于250mL三角瓶中培养，按照剂量为电流30％、脉冲5.5s和处理时间135s因素指标，将超声波仪(VC750，Sonicsand materials，Inc，USA)调整好后，对培养至第6天的微藻培养液处理1次。培养周期结束后，以收获时的胞外多糖含量与未经处理的蔷薇藻相比，胞外多糖提高了42.5％。同时，生物量、藻胆蛋白、不饱和脂肪酸的含量也相应有所提高。

实施例6

将紫球藻(Porphyridium cruentum)培养液装于250mL三角瓶中培养，按照剂量为电流33％、脉冲6.5s和处理时间45s因素指标，将超声波仪(VC750，Sonicsand materials，Inc，USA)调整好后，对培养至第6天的微藻培养液处理1次。培养周期结束后，以收获时的藻胆蛋白含量与未经处理的紫球藻相比，藻胆蛋白提高了18.5％。同时，生物量、胞外多糖、不饱和脂肪酸的含量也相应有所提高。

实施例7

将蔷薇藻(Rhodella reticulata)培养液装于250mL三角瓶中培养，按照剂量为电流21％、脉冲7.5s和处理时间165s因素指标，将超声波仪(VC750，Sonics andmaterials，Inc，USA)调整好后，对培养至至第4天的微藻培养液处理1次；培养周期结束后，以收获时的藻胆蛋白含量与未经处理的蔷薇藻相比，藻胆蛋白提高了14.5％。同时，生物量、胞外多糖、不饱和脂肪酸的含量也相应有所提高。

实施例8

将紫球藻(Porphyridium cruentum)培养液装于250mL三角瓶中培养，于培养的第一天，按照剂量为电流30％、脉冲6.5s和处理时间85s因素指标，将超声波仪(VC750，Sonics and materials，Inc，USA)调整好后，对微藻培养液处理1次。培养周期结束后，以收获时的不饱和脂肪酸含量与未经处理的紫球藻相比，不饱和脂肪酸提高了13.5％。同时，生物量、胞外多糖、藻胆蛋白的含量也相应有所提高。

实施例9

将蔷薇藻(Rhodella reticulata)培养液装于250mL三角瓶中培养，于培养的第一天，按照剂量为电流33％、脉冲5.0s和处理时间100s因素指标，将超声波仪(VC750，Sonics and materials，Inc，USA)调整好后，对微藻培养液处理1次。培养周期结束后，以收获时的不饱和脂肪酸含量与未经处理的蔷薇藻相比，不饱和脂肪酸提高了18.5％。同时，生物量、胞外多糖、藻胆蛋白的含量也相应有所提高。

实施例10

将微绿球藻(Nannochloropsis sp)培养液装于250mL三角瓶中培养，于培养的第一天，按照剂量为电流21％、脉冲6.5s和处理时间125s因素指标，将超声波仪(VC750，Sonics and materials，Inc，USA)调整好后，对微藻培养液处理1次。培养周期结束后，以收获时的微绿球藻中不饱和脂肪酸含量与未经处理的微绿球藻相比，不饱和脂肪酸提高了18.5％。同时，生物量和藻胆蛋白也相应有所提高。