一种抗婴幼儿腹泻病原菌免疫乳制品及其生产方法

摘要

本发明涉及生物制品领域，尤其是涉及一种抗婴幼儿腹泻病原菌免疫乳制品及其生产方法。本发明的技术方案是使乳制品中含有抗致病性大肠埃希氏杆菌、伤寒沙门氏菌和志贺氏菌的免疫球蛋白。所说的功能性免疫牛奶及乳制品通过以下方法得到：a.将致病菌毒种作为抗原，分别采用4％甲醛灭活24－48小时后，按1∶1的比例制备成含菌数为10

说明书

技术领域

本发明涉及生物制品领域，尤其是涉及一种抗婴幼儿腹泻病原菌免疫乳制品及其生产方法。

背景技术

婴幼儿腹泻病是指以腹泻为主要临床表现的一组肠道传染病，病因中多以细菌引起的感染性腹泻，危害严重，可导致儿童营养不良，生长发育障碍。尤其在6月龄以后的婴幼儿腹泻发病率较高。研究发现，母乳不仅为婴幼儿提供生长所必需的营养物质，同时也将乳中免疫活性物质，如：免疫球蛋白、免疫细胞及其细胞因子等传给了婴幼儿，使子代免受病原微生物的侵袭。然而，普通的母乳无显著特异性的抗婴幼儿腹泻病原菌功能。如：牛的常乳和初乳，虽其中初乳能够提高婴幼儿免疫力，但无显著特异性的抗腹泻病原菌活性。

从20世纪60年代起，研究者开始关注和开发，利用能够引起人体疾病的特定抗原(病原微生物)对动物进行免疫，然后将这种含有对人病原微生物具有特异性作用抗体的免疫乳收集加工，保留其中抗体的免疫活性，制成不同形式的功能性免疫乳制品。目前，已开发出针对一些疾病如关节炎、龋齿、心血管及肺部疾病、胃肠功能紊乱、降血脂作用、抗炎症因子作用等的功能性免疫乳制品，并获得了多项专利。这些不同的免疫乳分别在预防龋齿及牙周炎等口腔疾病的发生；改善肺功能，减少吸烟危害；改善心血管功能，消除主动脉壁上脂肪的沉积和血栓的形成；抗破伤风毒素；抗辐射作用等方面得到了广泛应用。但尚未有针对抗婴幼儿胃肠道细菌性腹泻病的功能性免疫乳制品。

发明内容

本发明的目的是提供一种含有抗婴幼儿腹泻病原菌抗体的功能性免疫乳制品。

本发明的另一个目的是提供一种制备所述功能性免疫乳制品的方法。

本发明的技术方案是使乳制品中含有抗病原性大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)和志贺氏菌(Shigella)的免疫球蛋白。

本发明中所说的病原性大肠埃希氏杆菌优选肠产毒素性大肠埃希氏杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)，肠致病性大肠埃希氏杆菌(enteropathogenic Escherichia coli，EPEC)和肠侵袭性大肠埃希氏杆菌(enteroinvasive Escherichia coli，EIEC)；所说的肠产毒素性大肠埃希氏杆菌优选大肠埃希氏杆菌44815、大肠埃希氏杆菌44561、大肠埃希氏杆菌44104和大肠埃希氏杆菌44439四株，所说的肠致病性大肠埃希氏杆菌优选大肠埃希氏杆菌44336、大肠埃希氏杆菌44338、大肠埃希氏杆菌44344、大肠埃希氏杆菌44351和大肠埃希氏杆菌44155五株；所说的肠侵袭性大肠埃希氏杆菌优选大肠埃希氏杆菌44825、大肠埃希氏杆菌44555和大肠埃希氏杆菌44553三株。

本发明中所说的病原性伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)优选伤寒沙门氏菌50071和伤寒沙门氏菌50402；

本发明中所说的病原性志贺氏菌优选痢疾志贺氏菌(Shigelladysenteriae)、宋内氏志贺氏菌(Shigella sonnei)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)。

本发明最佳的技术方案是使乳制品中含有抗下述17种病原菌的免疫球蛋白，

(1)大肠埃希氏杆菌44815，

(2)大肠埃希氏杆菌44561，

(3)大肠埃希氏杆菌44104，

(4)大肠埃希氏杆菌44439，

(5)大肠埃希氏杆菌44825，

(6)大肠埃希氏杆菌44555，

(7)大肠埃希氏杆菌44553，

(8)大肠埃希氏杆菌44336，

(9)大肠埃希氏杆菌44338，

(10)大肠埃希氏杆菌44344，

(11)大肠埃希氏杆菌44351，

(12)大肠埃希氏杆菌44155，

(13)伤寒沙门氏菌50071，

(14)伤寒沙门氏菌50402，

(15)痢疾志贺氏菌51570，

(16)福氏志贺氏菌51573，

(17)宋内氏志贺氏菌51334。

由于牛奶及乳制品中含有高活性和高效价的上述抗消化道病原菌抗体，则饮用该牛奶及乳制品将具有抗上述病菌的免疫功能。

本发明的抗婴幼儿腹泻病原菌抗体的功能性免疫牛奶及乳制品通过以下方法得到：

a.将病原性大肠埃希氏杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌毒株作为抗原，分别采用4％甲醛灭活24-48小时后，按1∶1的比例制备成含菌数为10⁶-10¹⁰/ml的混合菌液；

b.将混合菌液配以佐剂，制成联合多价疫苗；

c.用制得的联合多价疫苗对奶牛进行免疫，收集牛乳，即得到富含特异性抗体的免疫乳制品。

上述免疫奶牛的自然泌乳，即富含特异性抗体的免疫乳制品。所得到的免疫乳制品还可进一步加工，如分离纯化出特异性IgG，作为乳制品添加成分，也能得到本发明所说的特异性抗体的免疫乳制品。

上述方法步骤b制备联合多价疫苗的工艺，是本领域普通技术人员所熟知的，本发明不再做具体限定和描述。

本发明的功能性免疫乳制品，其特异性抗体活性及效价均极明显高于普通乳，能明显抗腹泻病原菌感染、有效降低发病率，兼具营养和保健功能。用本发明提供的方法生产功能性免疫乳制品，工艺简单、适于规模化生产。

附图说明

图1是本发明免疫牛奶中特异性抗体活性水平动态变化示意图；

图2是本发明免疫牛奶中特异性抗体效价动态变化示意图；

图3是大鼠的血清白细胞介素-2水平变化示意图。

具体实施方式

实施例1：从中国药品生物制品检定所购得17种菌毒株，包括大肠埃希氏杆菌12株、伤寒沙门氏菌2株、以及3株痢疾、福氏和宋内氏志贺氏菌；具体如表1：

表1.

  菌号    菌种名称  菌号    菌种名称  44815    大肠埃希氏杆菌  44344    大肠埃希氏杆菌  44561    大肠埃希氏杆菌  44351    大肠埃希氏杆菌  44104    大肠埃希氏杆菌  44155    大肠埃希氏杆菌  44439    大肠埃希氏杆菌  50071    伤寒沙门氏菌  44825    大肠埃希氏杆菌  50402    伤寒沙门氏菌  44555    大肠埃希氏杆菌  51570    痢疾志贺氏菌  44553    大肠埃希氏杆菌  51573    福氏志贺氏菌

  44336    大肠埃希氏杆菌  51334    宋内氏志贺氏菌  44338    大肠埃希氏杆菌

将上述17种致病菌毒株分别在37℃下培养扩增，使其菌数达10⁶-10¹⁰/ml，用4％甲醛溶液灭活24-48小时后离心、洗涤，然后将各菌毒种液按1∶1比例混合制备成混合菌液，并配以佐剂制成联合多价疫苗。将疫苗对泌乳高峰期乳牛进行免疫接种，2周一次，3次免疫后改为3周一次，直到泌乳结束；收集免疫牛奶，即为富含特异性抗体的功能性免疫乳制品。

在奶牛免疫期间采血样和牛奶样分析，对奶牛的免疫状况进行动态观察，方法如下：

酶联免疫吸附试验分析免疫乳特异性抗体活性和效价

(1)包被活的病原菌抗原  用磷酸盐缓冲液洗涤17种病原菌，用包被液制成10⁷/ml悬浮液，酶联板各孔分别加150μl，置37℃2小时，然后离心，4℃过夜；

(2)封闭  用含吐温磷酸盐缓冲液(PBST)洗板3次，每孔分别加入200μl明胶-PBS封闭液，置37℃1小时；

(3)加免疫乳样品和酶标二抗PBST洗板3次，加入稀释的免疫乳样品，阴性对照只加样品稀释液，置37℃1小时；然后，PBST洗板3次，加入PBS稀释的酶标兔抗牛IgG，再置37℃1小时；

(4)显色和终止反应  洗板后，加入含OPD底物反应液，37℃闭光20分钟显色；然后加50μl2mol/mL硫酸终止反应，

(5)比色测定用酶联仪在490nm波长下比色测定。效价定义为：在490nm波长下吸光值大于阴性对照0.1时，样品的最高稀释度。

结果如图1和图2所示，免疫乳特异性抗体活性和效价经统计学分析，显著或极显著高于普通乳(^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001)。

实施例2：联合多价疫苗制备同实施例1；将疫苗对预产期6-8周的奶牛进行免疫，从奶牛分娩后开始收集免疫牛乳包括初乳和常乳，即为富含特异性抗体的功能性免疫乳。

实施例3：抗腹泻病原菌感染动物试验

将32只4周龄健康SD大鼠随机分对照组、普通乳组和免疫乳组，每组10只(雌雄对半)，分别灌胃1ml/100g体重的生理盐水、普通初乳和免疫初乳，连续12天。在灌胃第5天和第10天，分别给对照组、普通乳组和免疫乳组大鼠口服感染1ml/100g体重的大肠埃希氏菌44825和伤寒沙门氏菌50402混合病原菌液(浓度0.2×10⁹个/ml，比例1∶1)。动物自由采食和饮水。观察动物发病情况，并在试验结束后宰杀大鼠取血样分离血清，测定血清白介素-2水平。

试验结果显示：

第一次感染染病原菌后，对照组大鼠全部有严重腹泻症状，粪便不干燥呈长条状，甚至有的为水样状，且粘连显著，颜色淡黄；普通乳组全部发病，腹泻症状同对照组；免疫乳组7只大鼠无明显症状变化，1只大鼠粪便不成椭圆形。

第二次感染病原菌后，对照组和普通乳组均表现为轻微腹泻症状，且毛色暗淡，精神抑郁不活跃；免疫乳组表现正常，无明显变化。

检测各组血清免疫功能指标白细胞介素-2(IL-2)显示，免疫乳组大鼠血清IL-2水平分别高于普通乳组和极显著高于对照组(^**P＜0.01)，而普通乳组虽高于对照组但没有显著差异(见图3)，说明口服免疫乳感染腹泻病原菌的大鼠细胞免疫功能明显加强。试验表明，本发明免疫乳具有明显抗婴幼儿腹泻病原菌感染、有效降低发病率，提高机体免疫功能，具有保健治疗作用。