具有神经保护作用的银杏总内酯组合物

摘要

本发明涉及从银杏叶中提取分离得到的含有活性化合物银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和白果内酯的银杏总内酯组合物。本组合物中银杏内酯A、B、C和白果内酯的含量之和大于80％。该组合物适用于制成各种单方药物制剂，可制成缓释或控释药物制剂；可制成腔肠给药、喷雾给药、透皮吸收或口服的药物制剂；可制成注射制剂或输液制剂；也可与其它药物(含中药提取物或有效成分)组成复方药物制剂。以上药物制剂有明确的神经保护作用，可用于制成治疗各种神经退化或损伤性疾病的药物制剂，例如用于中风性脑损伤、老年痴呆和多种硬化症等的治疗。

说明书

技术领域：

本发明涉及医药技术领域，确切地说它是一种具有神经保护作用的银杏总内酯组合物。

背景技术：

银杏为银杏科银杏属植物。银杏属植物出现于一亿七千万年前的侏罗纪时代，银杏是银杏属植物家族中目前唯一存活的树种，素有“活化石”之称。银杏作为药用在我国至少有5000年的历史，其最早记载于《神农百草经》中。在《本草纲目》中记载银杏“其性味甘苦而涩，入肺、肾二经，有定喘止咳、止带浊、缩小便之功效”，《本草品汇精要》中记载银杏叶“味甘苦、涩、性平，归肺经，能敛肺平喘、益心止痛、化湿止泄”(《中国药房》1997，8(2)：85-86)。

银杏叶提取物为《中华人民共和国药典》2000年版一部增补版项下收录的药材。其有效成份主要有黄酮甙和银杏萜内酯两类。银杏叶黄酮甙主要含有懈皮素甙、山奈酚甙及双黄酮类化合物。银杏内酯A、B、C和白果内酯是从银杏叶提取物中共提得4个主要萜类化合物。此外银杏外种皮还含有银杏酸、氢化亚白果酸、白果二酚、白果醇、天门冬酰胺、鞣质、黄酮类、糖类等成分(《中国野生植物资源》1995(1)：25盛苏，银杏外种皮的化学成分和用[J]《中草药》1995，26(6)：29王杰，银杏外种皮化学成分的分离和鉴定[J])。

近年来随着研究的不断深入，现代研究证明，银杏叶的活性成分银杏总内酯和银杏黄酮苷类这两类化合物的药理作用不同：

黄酮类化合物是在植物中普遍存在的一类天然产物，银杏黄酮能够明显调节血管张力，扩张动脉血管、降低血管壁通透性，增加冠状动脉血液量；减少心肌耗氧量、增强心肌细胞对缺血缺氧的耐受性，改善微循环。同时银杏黄酮是一种自由基清除剂，故有抗衰老、抗癌作用(《中国药理通讯》2003，20(2)：68)。

银杏总内酯组合物主要包括：银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和白果内酯，这是一类仅在银杏中存在、具有特殊结构和显著药理活性的独一无二的天然产物，至今尚未发现存在于其它植物中(《世界科学技术-中医药现代化》2003，5(1)：33-38银杏内酯的研究概况)。更重要的是它们具有独特的药理作用和治疗价值。银杏总内酯的药理作用非常广泛，相关报道已有很多。大量银杏提取物(24％总黄酮苷、6％总内酯)制剂在临床上显示出对心脑血管疾病具有良好的治疗效果的同时对神经系统也具有一定的疗效，提示具有独特结构的银杏总内酯很可能对神经保护作用起着主要的贡献。鉴于此，以高纯度银杏总内酯组合物(银杏内酯A、B、C和白果内酯含量为90％)为研究对象，从整体到分子水平研究了其神经保护作用。实验结果证明，银杏总内酯组合物可保护大鼠皮质神经细胞免受谷氨酸兴奋性毒性的损害，保护神经细胞免受过氧化氢诱导的氧化应激性损害，对细胞缺糖缺氧性损害同样具有保护作用，此外银杏总内酯组合物还可增强被氧自由基减弱了的bcl-2在大鼠胎鼠皮质神经细胞中的表达，减弱被氧自由基增加了的bax及P⁵³的表达，从而发挥其抗活性氧自由基诱导的细胞凋亡作用。

发明内容：

本发明的目的是提供一种具有神经保护作用的银杏总内酯组合物。所指银杏总内酯组合物主要含有银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和白果内酯。组合物中银杏内酯A、B、C和白果内酯的含量之和大于80％，小于99％。所述的组合物中白果内酯所占比例为20％-80％。所述的组合物可用于制备治疗各种神经退化或损伤性疾病的药物制剂。所述的组合物制剂包括特别注射剂或输液制剂、包括缓释或控释药物制剂、包括腔肠给药、喷雾给药、透皮吸收或口服的药物制剂、包括各种单方和复方药物制剂。

本发明银杏总内酯组合物的制备方法，其具体特征步骤如下：

(1)绿色干燥银杏叶粗粉经含水醇回流提取后得提取液。

(2)浓缩或回收溶剂并过滤，滤液经有机溶剂萃取除去水溶性杂质。

(3)萃取液经浓缩后溶于含水醇中，有机溶剂萃取除去脂溶性杂质。

(4)通过聚酰胺柱层析，用水醇洗脱，浓缩后真空干燥。

(5)含水醇溶解，过滤，滤液减压浓缩，喷雾或真空干燥，粉碎得上述银杏总内酯组合物。

本发明的优点是：通过实验结果证明，银杏总内酯组合物可保护大鼠皮质神经细胞免受谷氨酸兴奋性毒性的损害，保护神经细胞免受过氧化氢诱导的氧化应激性损害，对细胞缺糖缺氧性损害同样具有保护作用，此外银杏总内酯组合物还可增强被氧自由基减弱了的bcl-2在大鼠胎鼠皮质神经细胞中的表达，减弱被氧自由基增加了的bax及P⁵³的表达，从而发挥其抗活性氧自由基诱导的细胞凋亡作用。该组合物适用于制成各种单方药物制剂，可制成缓释或控释药物制剂；可制成腔肠给药、喷雾给药、透皮吸收或口服的药物制剂；可制成注射制剂或输液制剂；也可与其它药物(含中药提取物或有效成分)组成复方药物制剂。以上药物制剂有明确的神经保护作用，可用于制成治疗各种神经退化或损伤性疾病的药物制剂，例如用于中风性脑损伤、老年痴呆和多种硬化症等的治疗。

附图说明：

图1为组合物通过HPLC检测结果图。

图2为银杏总内酯组合物对皮质神经细胞的bcl-2表达的RT-PCR检测结果图。

图3为银杏总内酯组合物对皮质神经细胞bax mRNA表达的RT-PCR的检测结果图。

图4为银杏总内酯组合物对皮质神经细胞p53 mRNA表达的RT-PCR的检测结果图。

图1中1.(8.058min)白果内酯，2.(9.308min)银杏内酯，3.(17.692min)银杏内酯A，4.(20.092min)银杏内酯B。

图2中1未加任何药物的对照组；2.经H₂O₂ 0.05mM和0.1mM FeSO₄损伤性处理后的对照组3.只加入银杏总内酯组合物10^-2g·L^-1的对照组4经8小时H₂O₂ 0.05mM和0.1mM FeSO₄损伤性处理后的细胞加入银杏总内酯组合物10^-3g·L^-15经8小时H₂O₂ 0.05mM和0.1mM FeSO₄损伤性处理后的细胞加入银杏总内酯组合物10^-2g·L^-1.6.经8小时H₂O₂ 0.05mM和0.1mM FeSO₄损伤性处理后的细胞加入银杏叶提取物EGb76110^-2g·L^-1。

图3中1.未加任何药物的对照组；2.经H₂O₂ 0.05mM和0.1mM FeSO₄损伤性处理后的对照组；3..只加入银杏总内酯组合物10^-2g·L^-1的对照组4.经8小时H₂O₂ 0.05mM和0.1mM FeSO₄损伤性处理后的细胞加入银杏总内酯组合物10^-3g·L^-1 5经8小时H₂O₂ 0.05mM和0.1mM FeSO₄损伤性处理后的细胞加入银杏总内酯组合物10^-2g·L^-1.6.经8小时H₂O₂ 0.05mM和0.1mM FeSO₄损伤性处理后的细胞加入银杏叶提取物EGb76110^-2g·L^-16.经8小时H₂O₂ 0.05mM和0.1mM FeSO₄损伤性处理后的细胞加入银杏叶提取物EGb761 10^-2g·L^-1。

图4中1经8小时H₂O₂ 0.05mM和0.1mM FeSO₄损伤性处理后的细胞加入银杏叶提取物EGb761 10^-2g·L^-1.2..经8小时H₂O₂ 0.05mM和0.1mM FeSO₄损伤性处理后的细胞加入银杏总内酯组合物10^-2g·L^-13.经8小时H₂O₂ 0.05mM和0.1mM FeSO₄损伤性处理后的细胞加入银杏总内酯组合物10^-3g·L^-14只加入银杏总内酯组合物10^-2g·L^-1的对照组5.经8小时H₂O₂ 0.05mM和0.1mM FeSO₄损伤性处理后的对照组6.未加任何药物的对照组。

具体实施方式：

1组合物的定量分析

1.1所述组合物通过HPLC检测(柱：ODS；示差折光检测器；流动相：甲醇∶水(35∶65)给出四个峰(见附图1)，峰1(8.058min)为白果内酯(bilobalide)，峰2(9.308min)为银杏内酯C(ginkgolide C)，峰3(17.692min)为银杏内酯A(ginkgolide A)峰4(20.092min)为银杏内酯B(ginkgolide B)1.2对照品分别绘制液相工作标准曲线(以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标)(见表1)

                          表1银杏总内酯组合物标准曲线

    银杏内酯    线性范围(mg/ml)  回归方程    相关系数r    白果内酯    银杏内酯C    银杏内酯A    银杏内酯B    0.206～2.060    0.056～0.560    0.150～1.500    0.102～1.020  Y＝1.622×10⁵X-0.2021×10⁴  Y＝1.558×10⁵X-0.66×10²  Y＝1.681×10⁵X+3.461×10³  Y＝1.7225×10⁵X+7.22×10²    0.9999    0.9998    0.9997    0.9996

白果内酯和银杏内酯ABC为银杏叶提取物中的主要萜类有效成分，可以通过特定的工艺过程，标化只含有白果内酯和银杏内酯ABC的组合物，该组合物中银杏总内酯含量不低于80％。

2本组合物成分的结构鉴定

白果内酯

样  品：白果内酯

英文名：Bilobalide

分子量：326

分子式：C₁₅H₁₈O₈

结构确认：

IR：3467.3，2962.6，1790.7，1364.3，865.4，792.0

MS：325.3(M-1)

¹H-NMR：7.25(1H，d)，6.26(1H，s)，5.40(1H，s)，5.14(1H，d)，4.90(1H，t)，2.89(1H，d)，2.74(1H，d)，2.54(1H，m)，2.06(1H，m)，1.02(9H，s)

¹³C-NMR：176.9，173.2，172.7，98.9，85.2，82.4，67.8，64.9，57.3，41.1，36.7，35.3，26.1

银杏内酯A

样  品：银杏  酯A

英文名：Ginkgolide A

分子量：408

分子式：C₂₀H₂₄O₉

结构确认：

IR：3251.9，2962.6，1758.9，1137.9，963.0，798.2

MS：408(M)

¹H-NMR：见表2

                            表2.银杏内酯氢谱数据

氢核编号    银杏内酯A    银杏内酯B    银杏内酯C H-1 alpha H-1 beta H-2 H-6 H-7 alpha H-7 beta H-8 H-10 alpha H-12 H-14 t-Bu H-16    1.78(1H.dd)    2.74(1H，q)    4.82(1H，t)    4.94(1H)    2.03(1H，d)    2.03(1H，d)    1.70(1H，dd)    4.92(1H)    6.01(1H，s)    2.92(1H，d)    1.00(9H，s)    1.09(3H，t)    -    4.03(1H，q)    4.63(1H，d)    5.29(1H，d)    1.91(1H，m)    2.13(1H，q)    1.70(1H，q)    4.91(1H，t)    6.04(1H，d)    2.83(1H，q)    1.02(9H，s)    1.09(3H，d)    -    3.69(1H，dd)    4.33(1H，d)    4.97(1H，d)    3.76(1H，dddd)    -    1.25(1H，d)    4.70(1H，d)    5.80(1H，s)    2.51(1H，q)    0.80(9H，s)    0.80(3H，t)

¹³C-NMR：见表3

            表3.银杏内酯碳谱数据

银杏内酯    A    B    C    C1    C2    C3    C4    36.2    85.2    68.2    100.3    73.3    91.4    82.3    98.0    74.6    92.6    83.5    98.9    C5    C6    C7    C8    C9    C10    C11    C12    C13    C14    C15    C16    C17    C18，19，20    86.2    87.8    36.4    48.6    66.9    68.8    174.5    109.6    170.9    40.6    176.7    8.3    32.1    29.0    71.2    78.2    36.1    48.1    67.0    68.6    173.6    109.2    169.9    41.1    176.0    7.4    31.5    28.4    67.0    79.7    74.3    49.6    64.3    69.6    174.6    110.2    171.2    42.2    177.1    8.6    32.5    29.5

银杏内酯B

样  品：银杏内酯B

英文名：Ginkgolide B

分子量：424

分子式：C₂₀H₂₄O₁₀

结构确认：

IR：3451.9，2970.3，1780.4，1622.1，946.1，884.1

MS：424(M)

¹H-NMR：见表2

¹³C-NMR：见表3

银杏内酯C

样  品：银杏内酯C

英文名：Ginkgolide C

分子量：440

分子式：C₂₀H₂₄O₁₁

结构确认：

IR：3430.3，2989.3，1785.4，1635.3，935.8，890.9

MS：440(M)

¹H-NMR：见表2

¹³C-NMR：见表3

结论：基于以上分析，并对照文献，与文献值基本一致，可以判定本组合物中的四种主要成分分别为白果内酯(Bilobalide)、银杏内酯A(Ginkgolide A)、银杏内酯B(Ginkgolide B)、银杏内酯C(Ginkgolide C).

3.本组合物的神经保护作用

3.1银杏总内酯组合物对体外培养的大鼠皮质神经细胞不同损伤模型的影响

3.2银杏总内酯组合物对培养的大鼠皮质神经细胞的影响

(1)动物模型：体外培养的大鼠皮质神经细胞

(2)检测指标：A₅₇₀，乳酸脱氢酶(LDH)活性的测定。

(3)检测部分结果见表4，表5所示：

表4在大鼠正常的皮质神经细胞中银杏总内酯组合物对A₅₇₀的影响

    A₅₇₀  6小时  12小时  24小时    对照组    TG 10^-1    TG 10^-2    TG 10^-3    TG 10^-4  0.179±0.013  0.182±0.019  0.186±0.018  0.185±0.019  0.181±0.014  0.158±0.015^△    0.161±0.012  0.168±0.020  0.163±0.017  0.160±0.015  0.143±0.013^△    0.157±0.011^**  0.153±0.016^*  0.150±0.014  0.148±0.013

.注：X±s，n＝6，和对照组(6h)相比^△p＜0.05；和对照组(24h).相比^*p＜0.05 or^**p＜0.01

表5银杏总内酯组合物对由于低血清造成的受损神经细胞的保护作用

  LDH(U L^-1)    6小时  12小时    24小时    对照组    TG 10^-1    TG 10^-2    TG 10^-3    TG 10^-4    38.5±1.76    37.3±1.75    38.3±1.21    39.0±4.82    38.0±1.79 43.8±1.64^△△  39.6±2.02^★★  40.8±1.87^★  41.2±1.98^★  43.8±1.60    46.6±2.17^△△        38.1±1.00^**    40.0±1.26^**    45.2±2.93    47.0±5.08

.注：X±s，n＝6，和对照组(6h)相比^△△p＜0.01；与对照组(12h).相比^★p＜0.05，^**p＜0.01；和对照组(2 4h).相比^★★p＜0.01。

当细胞换成低血清培养液时，A₅₇₀随时间的延长而逐渐有所下降，表明活细胞数有所减少，因为只有活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶才能使黄色的MTT还原成紫色的甲颗粒，但当加入银杏总内酯组合物后，这种细胞活力的下降明显有所改善，在24h时，银杏总内酯组合物对细胞活力的增加作用，在一定范围内，随其浓度的增加而作用加强，银杏总内酯组合物10^-1和10^-2g·L^-1的改善作用尤为明显，此结果与MTT的测定结果是一致的，结果见表4。

由表5可见，细胞随着用低血清培养液培养时间的延长，释放至培养液中的LDH增多，12h和24h对照组与6h对照组比较，LDH活性有显著的增加趋势，在同一时间点内，随着加入银杏总内酯组合物浓度的增加，可显著地降低LDH的释放，表示银杏总内酯组合物对细胞的损伤有剂量依赖地改善作用，尤以银杏总内酯组合物10^-1和10^-2g·L^-1的作用更为明显。

4.1银杏总内酯组合物对谷氨酸所致皮质神经细胞损伤的保护作用

(1)动物模型：体外培养的用谷氨酸处理的大鼠皮质神经细胞。

(2)检测指标：细胞活力，乳酸脱氢酶(LDH)活性的测定。

(4)检测部分结果见表6所示：

表6银杏总内酯组合物对谷氨酸所致皮质神经细胞损伤的保护作用

    细胞活力    LDH(U·L^-1)  细胞用1mM谷氨酸处理12h  对照组  谷氨酸(1mM)^a(1)  谷氨酸(1mM)^a+  银杏总内酯组合物(10^-5g·L^-1)^b  银杏总内酯组合物(10^-4g·L^-1)^b  银杏总内酯组合物(10^-3g·L^-1)^b  银杏总内酯组合物(10^-2g·L^-1)^b  银杏总内酯组合物(10^-1g·L^-1)^b  尼莫地平(24μM)^b  尼莫地平(48μM)^b    100.0±0.78    83.6±0.3##     91.9±1.9*    94.7±2.1*    9 7.4±4.5**    99.9±1.5**    102.2±1.0**    9 6.8±3.9**    99.2±1.3**    38.11±1.25    41.96±2.44##    40.75±1.70    40.19±1.23    39.70±1.02    38.42±1.94*    38.09±1.57**    38.62±1.86*    38.05±1.17**

预处理(12h)

对照组                             100.0±2.9     34.84±1.79

谷氨酸(1mM)^c(2)                   87.6±3.3##    38.18±2.16#

谷氨酸(1mM)^c+

银杏总内酯组合物(10^-5g·L^-1)^d   84.7±1.5      38.04±1.84

银杏总内酯组合物(10^-4g·L^-1)^d   90.8±4.5      37.80±2.02

银杏总内酯组合物(10^-3g·L^-1)^d   97.6±2.0*      37.27±2.46

银杏总内酯组合物(10^-2g·L^-1)^d   99.7±0.3**     35.37±1.41

银杏总内酯组合物(10^-1g·L^-1)^d   103.7±1.3**    33.64±1.24**

尼莫地平(24μM)^d                  100.1±2.2**    34.62±1.59*

尼莫地平(48μM)^d                  103.8±1.2**    33.94±1.35**

注：X±s(n＝6).对照组##p＜0.01  *谷氨酸处理的两组分别为p＜0.05，**p＜0.01表明对照组和谷氨酸组之间存在差异

由表6可见，细胞用1mM谷氨酸处理12h，同时施用银杏总内酯组合物可明显改善谷氨酸所致的这种损害。此外，在用谷氨酸处理细胞之前，用银杏总内酯组合物与细胞预先温育12h，也可见药物有明显的保护作用，且呈浓度依赖关系。

4.2银杏总内酯组合物对过氧化氢所致皮质神经细胞损伤的保护作用

(1)动物模型：体外培养的用过氧化氢处理的大鼠皮质神经细胞。

(2)检测指标：细胞活力，乳酸脱氢酶(LDH)活性的测定。

(3)检测部分结果见表7所示：

表7银杏总内酯组合物对过氧化氢所致皮质神经细胞损伤的保护作用

                                 细胞活力          LDH(U·L^-1)

同时加入H₂O₂

对照组                           100±1.2          35.12±2.26

H₂O₂(0.2mM)^a(1)              81.4±1.1##       38.90±2.53#

H₂O₂(0.2mM)^a+

银杏总内酯组合物(10^-5g·L^-1)^b 86.0±1.4         38.85±1.70

银杏总内酯组合物(10^-4g·L^-1)^b 83.9±0.8         38.77±1.23

银杏总内酯组合物(10^-3g·L^-1)^b 85.8±1.0         37.06±1.57

银杏总内酯组合物(10^-2g  L^-1)^b 86.1±2.5         37.78±2.03

银杏总内酯组合物(10^-1g·L^-1)^b 82.6±1.6         36.68±1.71

尼莫地平(24μM)^b                89.7±1.6         38.69±1.82

尼莫地平(48μM)^b                92.1±2.0*        35.73±1.47*

预处理(12h)

对照组                                100.0±3.1     35.87±2.72

H₂O₂(0.2mM)^c(2)                   80.7±1.4##    47.19±2.37##

H₂O₂(0.2mM)^c+

银杏总内酯组合物(10^-5g·L^-1)^d      80.3±0.7      48.26±2.15

银杏总内酯组合物(10^-4g·L^-1)^d      78.8±1.2      46.31±2.45

银杏总内酯组合物(10^-3g·L^-1)^d      82.6±0.5      45.45±1.64

银杏总内酯组合物(10^-2g·L^-1)^d      90.3±1.2*     43.10±2.72*

银杏总内酯组合物(10^-1g·L^-1)^d      95.4±0.5**    38.20±1.54**

尼莫地平(24μM)^d                     91.8±1.9*     42.64±2.91*

尼莫地平(48μM)^d                     98.2±1.7**    37.86±1.97**

注X±s(n＝6)对照组#p＜0.05##p＜0.01*H₂O₂处理的两组分别为p＜0.05，**p＜0.01

由表7可见，0.2mM的过氧化氢可明显降低细胞活力，且可增加培养介质中的LDH的释放，表现出对细胞的明显损伤作用。将银杏总内酯组合物预先与细胞温育12h，药物可明显改善过氧化氢对细胞的损伤作用，其有效浓度为10^-1和10^-2g·L^-1，而将银杏总内酯组合物与过氧化氢同时与细胞温育，则未见明显影响，提示银杏总内酯组合物预服可有效地保护过氧化氢对神经细胞的氧化应激性损伤。

4.3银杏总内酯组合物对细胞缺糖缺氧性损害的保护作用

(1)动物模型：体外培养的缺糖及缺氧处理的大鼠皮质神经细胞。

(2)检测指标：细胞活力，乳酸脱氢酶(LDH)活性的测定。

(3)检测部分结果见表8所示：

表8银杏总内酯组合物对细胞缺糖缺氧性损害的保护作用

                                 细胞活力       LDH(U·L^-1)

对照组                           100.0±0.5     38.98±1.61

缺氧&缺糖^a                      79.5±0.6##    41.81±1.9#

缺氧&缺糖^a+⁺

银杏总内酯组合物(10^-5g·L^-1)^b 79.0±0.6      41.39±2.66

银杏总内酯组合物(10^-4g·L^-1)^b 80.4±1.1      40.50±1.77

银杏总内酯组合物(10^-3g·L^-1)^b  81.2±2.2    39.29±2.24

银杏总内酯组合物(10^-2g·L^-1)^b  81.4±0.3    39.76±1.98

银杏总内酯组合物(10^-1g·L^-1)^b  82.1±1.3    39.24±2.81

尼莫地平(24μM)^b                 80.6±1.8    40.38±2.65

尼莫地平(48μM)^b                 83.6±2.4    40.61±1.93

注：X±s(n＝6)对照组#p＜0.05，##p＜0.011表明对照组和H₂O₂组之间存在差异

当神经细胞的培养液中缺乏必要的营养物质时，如缺糖及缺氧，可认为是一种类似于整体实验的细胞“缺血”的体外模型。本实验结果表明，当细胞“缺血”4h后，细胞活力显著降低，可由对照组的100.0±0.5减少为79.5±0.6。当用银杏总内酯组合物在“缺血”处理前预先处理细胞12h，发现对细胞活力无明显影响。LDH的测定结果也表明，“缺血”时，细胞培养液中的LDH经细胞膜泄露至其中而升高，但经银杏总内酯组合物预处理的细胞培养液中的LDH无明显减少，结果见表8。

总之，实验结果证明，银杏总内酯组合物可保护大鼠皮质神经细胞免受谷氨酸兴奋性毒性的损害，保护神经细胞免受过氧化氢诱导的氧化应激性损害，对细胞缺糖缺氧性损害同样具有保护作用。

5.银杏总内酯组合物对培养大鼠皮质细胞bcl-2，bax和p53mRNA表达的影响

5.1银杏总内酯组合物对大鼠皮质细胞bcl-2 mRNA表达的影响

(1)动物模型：体外培养的经H₂O₂和FeSO₄损伤性处理的大鼠皮质细胞。

(2)检测指标：1％琼酯糖凝胶电泳上待检基因条带与内标基因(β-actin)条带的灰度比值的测定。

(3)检测部分结果见附图2所示：

PCR结果表明，对照组bcl-2 mRNA含量较高，而模型组的细胞经H₂O₂0.05mM和0.1mM FeSO₄损伤性处理后，其bcl-2 mRNA的表达与对照组比较明显减少，而经银杏总内酯组合物处理后可见不同浓度的银杏总内酯组合物均可增加该基因在皮质细胞中的表达，且呈剂量依赖关系(见附图2)，EGb761也有类似的作用。此外，还可见银杏总内酯组合物本身对正常细胞的bcl-2表达基本上没有影响。

5.2不同浓度的银杏总内酯组合物对皮质细胞内bax mRNA表达的影响

(1)动物模型：体外培养的经H₂O₂和FeSO₄损伤性处理的大鼠皮质细胞。

(2)检测指标：1％琼酯糖凝胶电泳上待检基因条带与内标基因(β-actin)条带的灰度比值的测定。

(3)检测部分结果见附图3所示

PCR实验结果表明，模型组细胞经H₂O₂ 0.05mM和0.1mM FeSO₄损伤性处理后，其bax mRNA的表达明显高于对照组，而在H₂O₂ 0.05mM和0.1mM FeSO₄损伤性处理之前经银杏总内酯组合物处理的细胞中，该基因的表达不再表现出这种异常升高，给药剂量的增加而逐渐减弱(见附图3)。大剂量银杏总内酯组合物处理细胞的bax条带非常弱，仅微微可见。EGb761也有降低由氧自由基造成的bax升高的作用。银杏总内酯组合物本身对正常细胞的bax表达没有改变。

5.3不同浓度的银杏总内酯组合物对细胞内p53 mRNA表达的影响

(1)动物模型：体外培养的经H₂O₂和FeSO₄损伤性处理的大鼠皮质细胞。

(2)检测指标：1％琼酯糖凝胶电泳上待检基因条带与内标基因(β-actin)条带的灰度比值的测定。

(3)检测部分结果见附图4所示

PCR实验结果表明，模型组细胞经H₂O₂ 0.05mM和0.1mM FeSO₄损伤处理后，其p53 mRNA的表达明显高于对照组，而在H₂O₂ 0.05mM和0.1mM FeSO₄损伤性处理之前经银杏总内酯组合物处理的细胞中，该基因的表达不再表现出这种异常升高，随给药剂量的增加而渐渐恢复(见附图4)，大剂量银杏总内酯组合物对H₂O₂ 0.05mM和0.1mM FeSO₄损伤性处理细胞的p53表达明显降低，与模型组细胞比较P＜0.05，而EGb761未表现出明显的这一作用。银杏总内酯组合物对正常细胞的P53表达无显著影响。

总之，bcl-2、bax和P⁵³均参与细胞的凋亡调控过程。结果表明，银杏总内酯组合物可增强被氧自由基减弱了的bcl-2在大鼠胎鼠皮质神经细胞中的表达，减弱被氧自由基增加了的bax及P⁵³的表达，从而发挥其抗活性氧自由基诱导的细胞凋亡作用。

实施例：

1.绿色干燥银杏叶粗粉10Kg，经含水醇回流提取后得提取液。浓缩或回收溶剂并过滤，滤液经有机溶剂萃取除去水溶性杂质。萃取液经浓缩后溶于含水醇中，有机溶剂萃取除去脂溶性杂质。弃去有机层，将醇水层浓缩，真空干燥。含水醇溶解，过滤，滤液减压浓缩，喷雾或真空干燥，粉碎得权利要求1所述的银杏总内酯组合物50g。

2.取银杏总内酯原料11g，加入50％丙二醇溶液500ml及45g氯化钠，补注射用水至5000ml，通过注射剂的通用操作过程。每支5ml，含本组合物10mg。结合症状，每次用2-4支，每日1次或遵医嘱。

3.本组合物2g，与右旋糖苷-40或山犁醇20g及磷酸缓冲适量混合，用于注射用水溶解，通过注射剂的通用操作过程，灌装，冻干，制成冻干注射剂每支含本组合物0.02g。结合症状，每次用1-3支，与注射氯化钠等输液混合使用，每日1次。

4.组合物10g，与微晶纤维素45g及硬脂酸镁5g混合，混合物用于打片，每片重0.2g，每片含本组合物0.02g。结合症状，每次服1-2片，每日2-3次。

5.本组合物10g，与玉米淀粉50g，加水制成软材，过12目筛造粒，干燥，制得颗粒，装入胶囊，每粒胶囊内容物重0.2g，含本组合物0.02g。结合症状，每次服1-2片，每日2-3次或遵医嘱。