可可茶提取物用于制备抗动脉硬化、抗老化药物、食品及化妆品的应用

摘要

本发明提供了一种以gallocatechin－gallate(GCG)、1，3，4，6－tetragalloyl－glucose(1，3，4，6－GA－glc)和gllogatechin－3，5－digallate(GC－3，5－diGA)为活性成分的可可茶(Camellia ptilophylla Chang)提取物为原料，用于制备抗动脉硬化、抗老化药物、食品及化妆品的应用。本发明所述的可可茶提取物可用于制备预防、治疗或改善动脉硬化、缺血性心脏病、缺血性脑病、皮肤老化、老年性白内障及老年性痴呆及上述疾病引起的各种临床症状的药物，也可用于用于制备改善动脉硬化、缺血性心脏病、缺血性脑病、皮肤老化、老年性白内障及老年性痴呆的食品和食品添加剂，以及用于制备减轻和预防皮肤老化的化妆品。

说明书

技术领域

本发明涉及天然植物提取及应用，具体是涉及可可茶(Camellia ptilophyllaChang)提取物用于制备抗动脉硬化、抗老化药物、食品及化妆品的应用。

背景技术

近年来，随着人类生存年龄的提高，饮食生活的改变，运动不足及生活环境变化引起的精神压力及应激反应增加，致使患动脉硬化、老年性白内障、老年性痴呆等生活习惯病的人数大幅增多，已成为一种亟待解决的社会问题。其中，动脉硬化是一种肥胖、嗜烟、高血压、糖尿病及高脂血症患者最易患，并且以动脉管壁增厚、变硬，失去弹性和管腔狭小为主要症状的生活习惯病。近年来，我国的高血压患者逐渐增多，动脉硬化已成为老年人死亡的主要原因之一。动脉粥样硬化的发病机制是多种因素综合作用的结果，流行病学调查证明血浆低密度脂蛋白(LDL)水平持续升高与动脉硬化的发病率呈正相关。近年来的研究结果提示人体内存在的氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL)被认为是最具危险的因素之一。

人们知道体内新陈代谢的过程中，每时每刻都有超氧自由基产生。特别是在运动、过度精神活动等应激反应致使机体对氧的消耗和细胞的代谢产生增加的状态下，自由基形成明显增多。活性自由基的强氧化能力在具有杀死有害细菌、防止感染、维持内环境效果的同时，活性氧在机体内大量蓄积也会造成DNA链的损伤，损害细胞膜，促进早衰过程，引起动脉硬化。活性氧诱发动脉硬化的机理是LDL脂质过氧化生成的mm-LDL能诱导内皮细胞表达单核细胞粘附因子，单核细胞分泌化学趋化蛋白及巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，使单核细胞粘附于内皮，进而移植内膜下，M-CSF使其分化成组织巨噬细胞。Mm-LDL还能促使血小板聚集和内皮细胞合成纤溶酶原激活抑制因子-1的增高，对凝血系统产生不良影响。近年来，实验研究得到许多分子生物学和病理学的证据，证明动脉粥样硬化病变是一种动脉壁细胞增生的结果。巨噬细胞释放细胞生长因子，还可激活血小板使其凝集性增强并释放血小板源性的生长因子，促成了动脉壁细胞这种病理性增生。再有，体内的巨噬细胞表面上具有OX-LDL特异性受体，识别并摄取OX-LDL。但是，巨噬细胞处理OX-LDL能力有限，大量吞食OX-LDL的巨噬细胞游走能力低下，形成泡沫巨噬细胞。膨胀的泡沫巨噬细胞聚集、变形，残骸堆积在血管壁上形成动脉粥样斑块，引起动脉粥样硬化，进一步钙化形成血栓，引起其所供应的器官供血障碍。血液无法在脑血管流通引起大脑的缺氧状态时，就是一般所说的中风。运送血液至心脏肌肉的冠状动脉出现缺氧状况时，则会造成心绞痛或心肌梗塞。脑动脉粥样硬化可引起脑血管意外、脑萎缩；肾动脉粥样硬化可引起顽固性高血压。

随着人年龄的增加，机体内对活性氧的防御功能下降，若不及时除去体内过多的活性氧，就很容易诱发动脉硬化。鉴于LDL氧化修饰在动脉粥样硬化中的作用，用适当抗氧化剂抑制其氧化可延缓病变的进展。迄今为止，人们在对动脉硬化的病理生理进行分析的同时，也注重对其治疗药物的研制和开发。现代社会带来的生活方式及环境上的变化，使得动脉硬化逐年显示出增加的趋势。从身体健康及生活习惯角度出发，一种可以长期服用而且安全性高的用于改善或治疗动脉硬化的健康食品或药物的研制为人们所期待。当然，从预防观点出发，可作为日常饮料的抗动脉硬化健康食品更为理想。

茶的故乡在中国南部，其根据之一是因为中国南部自然分布生长着茶的多种变种及野生种。可可茶(Camellia ptilophylla Chang)是一种野生茶，在植物分类学上是传统茶叶(Camellia sinensis)的近缘种植物，被人们发现后又称为新种茶。根据近年的调查结果，野生可可茶主要自然分布在广东省龙门地区的狭窄范围，长期以来被当地人们通过杀青、半发酵、发酵等不同方法制成绿茶、乌龙茶及红茶等茶叶日常饮用。可可茶是一种饮用安全的日常饮料，长期以来被当地人们用作健康茶饮用，迄今为止没有发现任何副作用及不安全的现象。与传统茶叶中的甲基黄嘌呤(methyxanthine)类物质代谢途径不同，可可茶中不含有咖啡因(caffeine)，而含有可可豆碱(theobromine)(为巧克力的原料——可可豆的主要活性成分)，因此被称为可可茶(cocoa tea)。与咖啡因的化学结构不同，可可豆碱在咖啡因化学结构的1位上没有甲基取代，因而表现出与咖啡因不同的生理作用，不仅不显示咖啡因特有的中枢兴奋作用，相反显示出镇静等功能。因此，可可茶又被称作睡前可以饮用的休息茶，适用于老年、妊妇、儿童、胃肠功能低下或心脏不健康等人的饮用。近年来有关可可茶的研究动向受到来自国外，特别是发达国家研究者及企业们的关注。

近年来，人们非常关心天然物质生理活性的研究，对茶类所具有生物功能更是特别关注。茶和咖啡、可可被并称为世界三大嗜好饮料，为世界绝大多数人所嗜好。人类饮茶已有数千年的历史。茶叶对健康的种种调节功能自古以来早已为人所知，例如茶叶的抗氧化剂作用(antioxidant)、抗菌作用、对血中胆固醇的调节作用等更是令人注目。传统茶叶的提取物及所含主要活性成分多元酚类(polyphenols)物质对糖的吸收抑制作用等已有报导。基于可可茶是传统茶叶的近缘种植物，我们对可可茶的生物活性及其中主要活性成分GCG、1，3，4，6-GA-glc和GC-3，5-diGA对可可茶及可可茶中的多酚类化合物捕捉自由基，防止自由基对LDL的氧化作用进行了探讨。

发明内容

本发明的发明目的在于提供以GCG、1，3，4，6-GA-glc和GC-3，5-diGA为有效成份的可可茶提取物的新用途。

本发明所述的以GCG、1，3，4，6-GA-glc和GC-3，5-diGA为有效成份的可可茶提取物可用于制备预防、治疗或改善动脉硬化、缺血性心脏病、缺血性脑病、皮肤老化、老年性白内障及老年性痴呆及上述疾病引起的各种临床症状的药物。所制备的药物可以长期服用的、安全性高、无毒副作用。

本发明所述的以GCG、1，3，4，6-GA-glc和GC-3，5-diGA为有效成份的可可茶提取物可用于制备改善动脉硬化、缺血性心脏病、缺血性脑病、皮肤老化、老年性白内障及老年性痴呆的食品和食品添加剂。所制备的食品和食品添加剂可以长期服用的、安全性高、无毒副作用。

本发明所述的以GCG、1，3，4，6-GA-glc和GC-3，5-diGA为有效成份的可可茶提取物可用于制备减轻和预防皮肤老化的化妆品。

所述的可可茶提取物含有活性成分gallocatechin-gallate，即GCG，每克可可茶提取物中GCG的含量至少为40毫克。

所述的可可茶提取物含有活性成分1，3，4，6-tetragalloyl-glucose，即1，3，4，6-GA-glc，每克可可茶提取物中1，3，4，6-GA-glc的含量至少为25毫克。

所述的可可茶提取物含有活性成分gallocatechin-3，5-digallate，即GC-3，5-diGA，每克可可茶提取物中GC-3，5-diGA的含量至少为100毫克。

在其应用产品中，所述的以GCG、1，3，4，6-GA-glc和GC-3，5-diGA为有效成份的可可茶提取物的使用量按重量比为0.01％至50％。

本发明所述的可可茶提取物是采用热水或水与甲醇、乙醇等低级醇类、丙酮等极性溶剂的一种或二种以上的任意混合溶剂进行提取。

因为可可茶中的生物碱和儿茶酚类，当然也包含前述的三种有效成分，都属于小分子化合物，一般用水提取即可，也可用不同浓度的低级醇类、丙酮等极性溶剂或任意混合溶剂来提取。在提取时，随着醇的添加，可可茶中活性成分的回收率会有所增加。尽管用水提取效果不如用醇添加提取，但随着水温增加，以及提取时间的延长，也可以达到与醇提取法相当的结果。因此，对可可茶中活性成分的提取而言，上述提取方法及其任意组合都可得到本发明所述的提取物。

鉴于可可茶提取物是以药物或食品作为最终产品开发，故从安全性角度考虑提取溶剂应尽量选择乙醇为宜。提取时可可茶与溶剂的比率没有特定限制，但一般可可茶与溶剂的比例以5∶1～50范围为宜。本发明对提取温度没有特定限制，从室温到溶剂沸点范围都可适用。当然室温、常压及在溶剂沸点范围内提取最为理想。提取时间从10秒到24小时范围都可以。在提取可可茶提取物时，根据需要也可以在溶剂中添加碳酸氢钠、抗坏血酸钠盐(sodium ascorbate)等物质。这些提取方法不会影响可可茶本来具有的生物活性。

本发明提供的可可茶提取物固形剂使用量一般在0.1％至50％(W/W)，因为通常饮料添加浓度一般在0.1％至50％(W/W)范围较为适宜。在这个浓度范围内，可可茶提取物适于直接服用，容易被消费者接受。当然，作为添加物的可可茶提取物随着加入量的增大，可能会出现苦涩的感觉。其解决办法可以根据市场需要及消费者的心理要求改换剂型，例如使用片剂、颗粒剂、胶囊剂等剂型。低浓度可可茶提取物溶液可以作为日常饮料提供给消费者。

本发明提供的可可茶及可可茶活性成分，可以用于各种口服剂型投放市场，用于预防、改善或治疗动脉硬化症、血栓症、缺血性心疾患、缺血性脑病，及因上述疾病引起的各种临床症状。当然，可可茶提取物也可以与常用的赋形剂等医药用载体结合做成制剂。必要时，还可以加入一些防腐剂、抗氧化剂、色素、甜味剂等制剂添加物。

比较适宜的可可茶赋形剂，一般考虑有乳糖、白糖、甘露醇(D-mannitol)、淀粉、结晶纤维素等。润滑剂一般应采用硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石粉等。溶剂通常使用精制水、乙醇、丙二醇等。防腐剂一般采用氯丁醇(chlorobutanol)、苄醇(benzyl alcohol)、二羟基乙酸(dehydroacetic acid)等。抗氧化剂通常以亚硫酸盐、抗坏血酸等比较适宜。

本发明提供的可可茶提取物，可以其原型、提取物或粉末添加到制品中用于口服。可可茶提取物也可与其它饮料原料结合制成一定的饮料制品，如可可茶饮料、碳酸饮料、果汁饮料、乳酸菌饮料、运动饮料、豆乳等。可可茶提取物食品还可以考虑制成饼干、巧克力类、糖果类、口香糖类、快餐点心类、果冻点心类、面包、豆腐、酸奶酪等日常食品。

本发明提供的可可茶及其所含活性成分可以作为药物、健康食品、食品或食品添加剂，用于预防、改善或治疗动脉硬化症、血栓症、缺血性心疾患、缺血性脑病，用于减轻和预防皮肤老化，老年性白内障及老年性痴呆等老化症状。本发明中，可可茶提取物的给药量，可以根据使用者的相对健康状态、年龄、性别及体重等条件适当选择。成人平均体重以60公斤计算，一天口服可可茶提取物一般可以考虑在3g至10g范围内，分次服用。当然10g以上也不存在副作用等问题。

本发明以拘束应激(restraint stress)负荷小鼠作为氧化应激试验模型，评价可可茶提取物对小鼠血浆中oxygen radical absorbance capacity(ORAC)活性的影响。结果显示，可可茶提取物对应激负荷诱发的小鼠抗氧化能力低下表现出统计学上有意义的改善效果。在体外捕捉自由基实验中，可可茶提取物其所含活性成分也显示出较强的抗氧化作用。此外，本发明也发现可可茶提取物可以有效的延长氧化剂2-2’-azobis 4-methoxy-2，4-dimethyvaleronitrile(V70)诱发的LDL氧化延迟时间，具有一定的改善效果。基于上述结果，确认本发明所述的以GCG、1，3，4，6-GA-glc和GC-3，5-diGA为有效成份的可可茶提取物的新用途的成立。

根据上述实验可以证明本发明提供以GCG、1，3，4，6-GA-glc和C-3，5-diGA为活性成分的可可茶提取物是一种安全性高，来自天然的通过抗氧化，从而达到预防、改善和治疗动脉硬化症、血栓症、缺血性心脏病、缺血性脑病，用于制备可以长期服用的、安全无毒副作用的药物、食品添加剂、健康食品、化妆品及其组成物。

此外，本发明也提示以GCG、1，3，4，6-GA-glc和C-3，5-diGA为活性成分的可可茶提取物也可以作为抗氧化剂或抗氧化组成物原料，用于减轻和预防皮肤老化，老年性白内障及老年性痴呆等老化症状。由于本发明提供可可茶提取物是天然来源的物质，且民间有长期作为饮料饮用的经验，不含有咖啡因，因此不仅适用于一般成年人，而且作为一种作用缓和的健康茶也适用于老年人、儿童及体力低下者。因此，以GCG、1，3，4，6-GA-glc和C-3，5-diGA为活性成分的可可茶提取物可以作为健康食品、食品添加剂、健康茶，提供多种用途。再有，尽管1，3，4，6-GA-glc、C-3，5-diGA是已知化合物，但是这些化合物对LDL氧化实验的抑制活性是通过本发明所初次证实的。

附图说明

图1为可可茶提取物的HPLC分析图谱；

图2为可可茶提取物的小鼠应激负荷ORAC实验的结果分析图(starvedcontrol为禁食空白组，即正常对照组；stress control为应激模型空白组，即应激对照组；stress+cocoa tea为应激+可可茶提取物组，即实验组)

图3为可可茶提取物的体外ORAC测定结果分析图(纵坐标为相对荧光强度；横坐标为荧光衰减时间；)

图4为可可茶三种有效成份的体外ORAC测定结果分析图(纵坐标为相对荧光强度；横坐标为荧光衰减时间；)

图5为可可茶提取物对LDL氧化抑制实验结果分析图(纵坐标为吸收强度；横坐标为氧化时间)

具体实施方式

实施例一：可可茶提取物的制备

取可可茶干燥叶100g，加入90℃热水2000ml浸提4分钟。提取液经纱布滤过后，再经离心(1000rpm，5分钟)分离，回收上清液冷冻干燥即得可可茶提取物。

实施例二：可可茶提取物的制备

取可可茶干燥叶200g加入60％乙醇-水溶液2000ml加热回流提取30分钟。提取液经纱布滤过后，再经离心(1000rpm，3分钟)分离，回收上清液冷冻干燥即得可可茶提取物。

实施例三：可可茶提取物的制备

取可可茶干燥叶50g，加入丙酮250ml超声提取10分钟。提取液经过滤后，再经离心(800rpm，3分钟)分离，回收上清液冷冻干燥即得可可茶提取物。

实施例四：可可茶提取物的制备

取可可茶干燥叶150g，加入蒸馏水1000ml超声提取20分钟。提取液经过滤后，再经离心(1200rpm，3分钟)分离，回收上清液冷冻干燥即得可可茶提取物。

实施例一至四所得的可可茶的冷冻干燥提取物用于下列实验，验证其作用。

实施例五：可可茶活性成分的分离及分析

将上述可可茶提取物配制成1％水溶液后，经Sep-Pakt C18 Cartridge(5ml，Waters制)吸附过滤，水洗净后，用乙腈洗脱分离。随后，将250mg所得分离组分在Develosil C30-UG-5(20mm×250mm，野村化学制)柱上，在0.05％三氟乙酸(TFA)存在条件下，用5-30％乙腈按线性梯度洗脱方式(5ml/mim，180min，220nm紫外检测)洗脱分离。回收得到的分离组分，再用YMC-Pak ODS(20×250mm、YMC制)柱，在0.1％TFA存在下，用20-25％乙腈按线性梯度洗脱方式(6ml/mim、60min，280nm紫外检测)洗脱精制。从中分离得到组分经核磁共振(NMR)等波谱学方法测定化学结构，确认为以下三种在传统茶叶品种中含量很少或很难检测出的已知化合物。

1)gallocatechin-gallate(GCG)

2)1，3，4，6-tetragalloyl-glucose(1，3，4，6-GA-glc)

3)gallocatechin-3，5-digallate(GC-35diGA)

图1为可可茶提取物的HPLC分析图谱。可可茶提取物的HPLC分析条件为：

层析柱：资生堂capcell pak C18，4.6mmφ×150mm；

流动相：A＝0.05％TFA/水；B＝90％CH3CN/0.05％TFA/水。B5→B35％(13min)，B35→B70％(7min)，B70％(5min)。

检测：A280nm area定量。PDA220～500nm测定。

此外，可可茶提取物中分离得到了两种黄酮苷类成分。通过盐酸水解，采用HPLC分析方法[层析条件：Shimpak-SPR-Pb柱，7.8mm×250mm，80℃；水为流动相，流速1ml/min；示差检测器(simadzu RID-10A)]检测水解液中的糖类物质，与标准品对照确认该两种黄酮苷类化合物为已知化合物，即kaempferol3-rhamnosyl-rutinoside与kaempferol 3-rutinoside(Natural product Letters，14：233-238，2000)。

由于用水提取、用醇提取、用其他极性溶剂提取，或者混合法提取，每克可可茶提取物中，上述活性成分GCG、1，3，4，6-GA-glc及GC-3，5-diGA的含量有差别，但发明人的不同实验多次表明，活性成分GCG、1，3，4，6-GA-glc及GC-3，5-diGA的含量至少为40mg、25mg及100mg。

实施例六：可可茶提取物对应激负荷小鼠ORAC水平的影响

应激负荷实验使用动物为7周龄雄性ICR小鼠，由日本CLEA Inc.购入。饲养温度23±1～2℃，湿度55±5％，换气次数12～15次/时，照明时间12小时/日(午前7时开灯，晚7时关灯)。饲育条件：固形饲料CE-2(CLEA Inc.)，自由饮水。经1周饲养后进行实验。在拘束实验中，按250mg/kg或125mg/kg剂量经口给药方式给与可可茶提取物水溶液(1g/ml)。对照组给与等体积蒸馏水。小鼠每组5只，每只小鼠禁食强制放入拘束装置，对照组仅禁食。拘束20小时后在乙醚麻醉下由心脏采血并放入肝素处理过的试管中，经5000rpm离心5分钟后分离血浆。再经终浓度为3％的perchloric acid(PCA)除蛋白后，通过15000rpm离心15分钟回收非蛋白上清液用于ORAC分析。血浆ORAC分析使用多功能荧光分析仪(Labsystems Fluoroskan Ascent plate reader，Helsinki，Finland)，激发和发射波长分别为485nm和527nm，攻击荧光素(disodium fluorescein)的氧化剂使用2，2′-azobis-2-amidinopropane-dihydrochloride(AAPH；Wako PureChemical Industries，Ltd.Osaka，Japan)。效价单位参照水溶性维生素E(6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid；Trolox，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)，详细方法参照论文(J Agric Food Chem.，51：3273-3279，2003)。实验结果以T检验作统计学处理，结果如图2所示。图2中，starved control为禁食空白组，即正常对照组；stresscontrol为应激模型空白组，即应激对照组；stress+cocoa tea为应激+可可茶提取物组，即实验组。实验结果表明：与应激空白组(蒸馏水对照组)相比，给与可可茶提取物的小鼠的血浆ORAC活性即抗活性氧自由基的能力明显增强，接近于正常对照组，并且具有统计学意义(^*p＜0.05)。

实施例七：可可茶提取物及其有效成分的体外ORAC活性

体外抗氧化实验，是将可可茶提取物直接添加在96孔酶标板中，观察可可茶提取物抑制氧化剂AAPH对荧光素disodium fluorescein的荧光衰减的延迟作用。如图3所示，可可茶提取物在体外均能明显的延缓荧光物质被活性氧自由基淬灭的速度，并且不同浓度的可可茶提取物之间具有量效关系。如图4所示，可可茶的有效成份也具有相应活性，即在体外均能明显的延缓荧光物质被活性氧自由基淬灭的速度，并且不同浓度的可可茶提取物之间具有量效关系。因此可以得出结论：可可茶提取物和三种有效成分在体外具有较强的抗活性氧自由基作用。

此外，当将可可茶中含有的小分子多酚类化合物GCG、1，3，4，6-GA-glc和GC-35diGA添加到96孔酶标板中，这些小分子多酚类化合物同样具有非常强的抗活性氧自由基作用。说明可可茶提取物这些抗活性氧自由基作用是来自可可茶中含有的小分子多酚类化合物。

实施例八：可可茶提取物对LDL氧化的抑制活性

血液来自空腹一夜后的健康、不吸烟的人。采血后加入到含有5mM EDTA的试管内，3000rpm离心10分钟回收血浆。然后将0.3575g固体溴化钾加到1.1ml血浆中，调整血浆密度至1.21kg/l，加到含0.1％EDTA的2.8ml盐溶液(d＝1.006-1.063g/ml)封闭型分离试管中。此后，4℃条件下100,000rpm离心40分钟(使用Beckman optima^TM TL model ultracentrifuge离心机(BeckmanInstruments Inc，Palo Alto，CA)，TCA-100.4转子)。LDL蛋白浓度测定使用伯乐产蛋白分析试剂(BioRad，San Franscico，CA)。

LDL氧化实验是将LDL用含有1mg/ml EDTA的10mM PBS稀释至70μg protein/ml，然后加可可茶提取物到LDL溶液中37℃下作用，进而加入10μl的40mM 2-2′-azobis 4-methoxy-2，4-dimethyvaleronitrile(V70)乙腈溶液。LDL氧化测定在234nm条件下连续130分钟记录。结果如图5所示，在同样记录了130分钟的情况下，加入可可茶提取物组的吸收强度明显较空白组低，即LDL若达到同样的氧化程度，加入可可茶提取物组所需的时间较长。因此，实验结果表示可可茶提取物延长了LDL被氧化所需的时间，具有抑制LDL氧化作用。

根据上述实验可以证明本发明提供以GCG、1，3，4，6-GA-glc和C-3，5-diGA为活性成分的可可茶提取物是一种安全性高，来自天然的通过抗氧化，从而达到预防、改善和治疗动脉硬化症、血栓症、缺血性心脏病、缺血性脑病，用于制备可以长期服用的、安全无毒副作用的药物、食品添加剂、健康食品、化妆品及其组成物。

此外，本发明也提示以GCG、1，3，4，6-GA-glc和C-3，5-diGA为活性成分的可可茶提取物也可以作为抗氧化剂或抗氧化组成物原料，用于减轻和预防皮肤老化，老年性白内障及老年性痴呆等老化症状。由于本发明提供可可茶提取物是天然来源的物质，且民间有长期作为饮料饮用的经验，不含有咖啡因，因此不仅适用于一般成年人，而且作为一种作用缓和的健康茶也适用于老年人、儿童及体力低下者。因此，以GCG、1，3，4，6-GA-glc和C-3，5-diGA为活性成分的可可茶提取物可以作为健康食品、食品添加剂、健康茶，提供多种用途。再有，尽管1，3，4，6-GA-glc、C-3，5-diGA是已知化合物，但是这些化合物对LDL氧化实验的抑制活性是通过本发明所初次证实的。