毛橘红总黄酮及其提取方法和用途

摘要

本发明属于医药卫生、食品化工行业。主要是毛橘红总黄酮、毛橘红总黄酮分散片、柚皮苷、野漆树苷的制法和用途。化橘红是芸香科植物化州柚或柚的未成熟或近成熟干燥外层果皮，为镇咳化痰的道地药材。毛橘红中的黄酮类成分是其主要有效成分。毛橘红总黄酮中，柚皮苷与野漆树苷含量较高，两者合计占总黄酮的85％以上。本发明提供一种以溶剂法提取，经浓缩、沉淀及重结晶后得总黄酮、柚皮苷、野漆树苷以及一种毛橘红总黄酮制剂的方法，所得产品能够显著提高传统中药的疗效和科技含量。

说明书

技术领域

本发明属于医药卫生、食品化工等行业。主要是提供一种毛橘红总黄酮、及其简便经济的提取分离方法和用途。

背景技术

化橘红是芸香科植物化州柚Citrus grandis‘tomentosa’或柚Citrusgrandis(L.)Osbeck的未成熟或近成熟干燥外层果皮。前者习称“毛橘红”，后者习称“光橘红”，有散寒、燥湿、利气、消痰的功能。主要用于风寒咳嗽、喉痒痰多、食积伤酒、呕吐痞闷等疾病。其中毛橘红产于广东化州，为镇咳化痰的道地药材。

毛橘红中的黄酮类成分有抗炎、镇痛、解热的作用，是其主要有效成分。其中，柚皮苷与野漆树苷含量较高，两者合计占毛橘红总黄酮的85％以上。经文献检索，柚皮苷有抗菌、抗病毒作用、有抗变态反应作用、有抗氧化作用以及抗癌作用；野漆树苷有抗氧化作用、有明显的肾细胞膜保护作用以及具有明显的降压作用等。

目前，贾冬英等曾报道了光橘红总黄酮的提取工艺，但繁琐，不适合工业化生产，且成本较高，得率较低；毛橘红总黄酮的详细提取工艺，尚未见报道。另外，由于柚皮苷与野漆树苷结构相似，难以分开，目前尚未见用普通溶剂法将两者分离的研究报道。

发明内容

本发明的目的主要是通过采用简单的醇-水处理方法得到毛橘红总黄酮，以便于工业化生产及其制剂的开发利用。同时通过采用简单的溶剂法，将其中结构相似的柚皮苷与野漆树苷相分离，从而获取高纯度的柚皮苷与野漆树苷单体。

本发明所叙述的毛橘红总黄酮的主要成份是从中药毛橘红中提取分离得到的化学部位，它是毛橘红中一类性质结构相似的化学成分，它是化学成分(主要是黄酮和二氢黄酮)的总称，外观为黄色固体粉末，易溶于水，可溶于甲醇，柚皮苷和野漆树苷是毛橘红总黄酮中的两个主要有效成分，柚皮苷和野漆树苷的分子式、分子量、结构式如表1：

                                  表1柚皮苷和野漆树苷

本发明所叙述的毛橘红总黄酮、及毛橘红总黄酮的有效成份柚皮苷、野漆树苷的提取分离方法包括：

1、毛橘红总黄酮的提取工艺：取毛橘红适量，水煎煮，经浓缩、醇沉、水沉等步骤得到毛橘红总黄酮。

2、从毛橘红总黄酮中分离柚皮苷与野漆树苷的技术：取毛橘红总黄酮适量，用70％甲醇溶液重结晶1～2次，先获得野漆树苷结晶，母液回收甲醇后室温放置48h，分取沉淀，丙酮重结晶1～2次，即得柚皮苷结晶，分别用高效液相色谱法检测其含量。

制备方法包括以下具体步骤：

(1)毛橘红总黄酮的提取工艺：毛橘红药材→水提取→浓缩至药材1g/ml→加乙醇至80％→滤过→滤液浓缩至药材2g/ml→加水至生药浓度为0.4g/ml→调pH值至1.5→冷藏72h→分取沉淀→蒸馏水洗涤沉淀→60℃烘干即可。

(2)毛橘红总黄酮中野漆树苷与柚皮苷的分离：取毛橘红总黄酮适量→70％重量浓度甲醇溶解使成饱和溶液(80℃)→室温放置48h→分取沉淀→70％重量浓度甲醇重结晶1～2次，即得到野漆树苷(其纯度不得低于98％)，分取野漆树苷后的甲醇液(母液)回收甲醇后室温放置48h，分取沉淀，丙酮重结晶1～2次，即得柚皮苷结晶(纯度不得低于95％)。

本发明所提供的毛橘红总黄酮的用途可用于毛橘红总黄酮制剂的制备：

制剂(分散片)处方组成：毛橘红总黄酮，MCC，CMS-Na，PVPP，硬脂酸镁，十二烷基硫酸钠，微粉硅胶。毛橘红总黄酮分散片制法及组成为：毛橘红总黄酮34.25％，MCC 34.25％，CMS-Na 20.55％，PVPP 8.22％，硬脂酸镁0.68％，十二烷基硫酸钠0.68％，微粉硅胶1.37％。制法：各原辅料分别过100目筛后，将毛橘红总黄酮粉末与MCC，CMC-Na混匀，加入0.5％PVP水溶液制成软材，30目制粒，70℃干燥，30目整粒后，加入其他辅料，压制成片剂，控制片剂硬度在4.5kg力左右。

毛橘红总黄酮及总黄酮制剂具有化痰、止咳、抗炎等作用，在医药工业方面主要可用于医药中间原料、功能产品的原料或添加剂在医疗卫生方面主要可用于咳嗽、痰多、支气管炎、肺炎等的治疗和预防以及心血管疾病的治疗和预防。

附图说明：

图1：重结晶前毛橘红总黄酮HPLC图谱

图2：一次重结晶后野漆树苷甲醇溶液指纹图谱

图3：一次重结晶后柚皮苷甲醇溶液的HPLC图谱

具体实施方式：

实施例1：

取毛橘红药材500g，加水12500ml，浸泡0.5小时后，煮沸2小时，滤过，药渣用水10000再煮沸1.5小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至500ml，缓缓加入乙醇，边加边搅拌，使含醇量达到80％，滤过，滤渣用适量80％乙醇分次洗涤，并入滤液，回收乙醇，浓缩至2g/ml，加入适量蒸馏水使其浓度为0.4g/ml，5mol/L盐酸调pH值至1.5，冷藏，72小时后取出，滤过，沉淀用适量蒸馏水洗涤，60℃干燥，粉碎，过筛，得毛橘红总黄酮，总黄酮的含量以柚皮苷计不得低于80％。

实施例2：取毛橘红总黄酮粉末10.0g，加入70％甲醇35ml，80℃水浴回流，待全部溶解后，趁热滤过，滤液至50ml具塞三角烧瓶，密闭。室温放置48h，分取粗晶，粗晶再用70％甲醇重结晶1～2次，即得野漆树苷结晶(其纯度达到98.53％)。分取野漆树苷后的甲醇液(母液)回收甲醇后室温放置48h，分取沉淀，丙酮重结晶1～2次，即得柚皮苷结晶(其纯度达到96.85％)

实施例3：毛橘红总黄酮对小鼠气管段酚红分泌量的影响

NIH小鼠44只，随机分成4组，即毛橘红总黄酮高、中、低剂量组(分别为；和生理盐水组。按20ml/kg灌胃给药，每天一次，连续四天，于末次给药后30min，腹腔注射5g/dl酚红0.1ml/10g，30min后处死动物，分离气管段，放入盛有生理盐水的试管中，加入1mol/L氢氧化钠0.1ml，用721型分光光度计，检测波长为546nm，测OD值，并由酚红标准曲线计算酚红含量，q检验比较给药组与空白对照组之间差异的显著性。结果见表2

    表2  毛橘红总黄酮对小鼠气管段酚红分泌量的影响(x±s)

    组别  剂量(mg/kg)  动物数  气管酚红排泄量  高剂量组  中剂量组  低剂量组  生理盐水组    160    80    40    --    11    11    11    11    1.146±0.1219**    0.972±0.1318**    1.028±0.1456**    0.756±0.0964

与生理盐水组比较，**表示P＜0.01

结果显示毛橘红总黄酮可明显促进小鼠气管段酚红排出量，与对照组比较有显著性差异，表明毛橘红总黄酮有一定的化痰作用。

实施例4：毛橘红总黄酮对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响

取NIH小鼠44只，随机分为4组，既毛橘红总黄酮高、中、低剂量组和生理盐水组。每组11只，按20ml/kg体重灌胃给药，每天一次，连续四天，于末次给药后60min，在小鼠右耳涂上二甲苯(正、反面各涂20μl)，60min后处死动物，用直径为0.6cm的打孔器在左、右耳相同位置上取相同的面积，称重，计算左右耳重量的差异，结果见表3。

   表3  毛橘红总黄酮对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响(x±s)

    组别  剂量(mg/kg)    动物数  气管酚红排泄量  高剂量组  中剂量组  低剂量组  生理盐水组    160    80    40    --    11    11    11    11    3.2±0.3**    3.3±0.3**    4.0±0.4**    6.0±0.5

与生理盐水组比较，**表示P＜0.01

结果显示毛橘红总黄酮高、中、低三个剂量组与生理盐水组比较有显著性差异，表明毛橘红总黄酮有较好的抗炎作用。

实施例5：毛橘红总黄酮对氨水致咳的影响

取NIH小鼠48只，雌雄各半，随机分成毛橘红总黄酮高、中、低剂量组和生理盐水组，按20ml/kg体重灌胃给药，每天一次，连续4d，于末次给药后1h，按小鼠氨水引咳实验法测定各组小鼠咳嗽次数，以给药前后咳嗽次数的差值为指标。q检验比较给药组与空白对照组之间差异的显著性，结果见表4。

      表4  毛橘红总黄酮对氨水致咳的影响(x±s)

    组别    剂量    (mg/kg)                             咳嗽次数    给药前    给药后    差值  高剂量组  中剂量组  低剂量组  生理盐水组    160    80    40    --  60.83±12.10  62.08±16.98  68.50±11.99  58.75±12.65 60.00±22.10 45.98±17.92 46.50±13.24 68.25±12.793.33±18.6516.17±11.55***22.00±14.18***6.90±15.25

与对照组比较，***表示P＜0.001

结果显示毛橘红总黄酮中、低剂量组和生理盐水组比较有极显著性差异，表明毛橘红总黄酮有明显的止咳作用。

实施例6：毛橘红总黄酮对人脐静脉血管内皮细胞的影响

取无菌获取新生儿脐带，常规原代和传代培养人脐静脉血管内皮细胞，不同浓度毛橘红总黄酮作用于96孔板中单层培养的人脐静脉血管内皮细胞(1×10⁵个/ml)12-72h后，加入5μg/ml MIT20μl/孔，继续培养4h，弃上清液后加入二甲基亚矾200μl/孔，测吸光度(OD)值。结果见表5。

表5不同浓度毛橘红总黄酮对人脐静脉血管内皮细胞的影响(x±s)

    组别    剂量    (mg/ml)    吸光度(OD值)    正常组    黄酮组1    黄酮组2    黄酮组3    黄酮组4    -    10    3    2.5    1.25    2.70±0.05    2.87±0.09*    3.00±0.15*    2.90±0.04*    2.83±0.11*

与正常组比较，*表示P＜0.05

结果表明，毛橘红总黄酮各剂量组对人脐血管内皮细胞均有显著性差异。实施例7：应用毛橘红总黄酮制备的分散片

配方：毛橘红总黄酮34.25％，MCC 34.25％，CMS-Na 20.55％，PVPP 8.22％，硬脂酸镁0.68％，十二烷基硫酸钠0.68％，微粉硅胶1.37％。

制法：上述处方湿法制粒、压片即得淡黄色分散片。

功能与主治：散寒，燥湿，利气，消痰。用于风寒咳嗽，喉痒痰多，食积伤酒，呕恶痞闷。也可用于心血管系统疾病的预防和治疗。

用法与用量：口服，一次2片，一日三次。