一种促进脂质体淋巴吸收和减少正常淋巴结蓄积的方法

摘要

本发明属制药领域，涉及促进局部注射脂质体淋巴吸收和减少脂质体在注射部位残留量及减少脂质体在正常淋巴结中蓄积量的方法，本发明采用“压力补偿”策略，通过大粒径空白脂质体、中性或荷电高分子物质以维持注射部位的静压力，显著促进脂质体淋巴吸收和减少局部残留量。本发明还采用“饱和巨噬细胞”策略，通过中性或荷电高分子物质与脂质体按一定比例混合后给药，显著降低正常淋巴结对脂质体的摄取量，且具有明显减少巨噬细胞摄取脂质体的作用。

说明书

技术领域

本发明属制药和临床药学领域，具体涉及一种促进局部注射的脂质体淋巴吸收而减少局部残留量问题的方法，同时也涉及饱和淋巴结中巨噬细胞摄取而减少正常淋巴结蓄积脂质体的方法。

背景技术

恶性肿瘤是威胁人类生命的严重疾病，目前在我国发病率也越来越高，除脑肿瘤外，任何系统的肿瘤几乎均可发生淋巴转移。肿瘤转移是恶性肿瘤患者死亡的主要原因之一，据统计，60％初诊患者就诊时已发生转移。淋巴系统全身分布广泛，并且具有其特殊性，淋巴转移肿瘤的治疗始终是一个难题。由于淋巴转移肿瘤的特殊性，使得手术治疗的效果往往较差，静注化疗药物的淋巴聚集量少而全身毒副作用较大。因此，将抗肿瘤药物导向到淋巴系统、靶向肿瘤细胞，对恶性肿瘤淋巴转移的治疗具有极为重要的意义。

毛细淋巴管与毛细血管并行于全身各个部位，但两者在微结构上存有差异。毛细血管壁由紧密排列的内皮细胞构成，细胞间隙较小，一般只有8～10nm左右。毛细淋巴管壁很薄，由一层连续的扁平内皮细胞构成，从超微结构看，相邻内皮细胞呈叠瓦状连接，彼此可重叠几个微米，在重叠的细胞间可出现约30～120nm的孔隙。细胞边缘游离内垂形成瓣状结构，只允许液体从组织间隙单方向流入毛细淋巴管。因此，在组织间隙注射具有一定粒径的粒子，当其粒径小于毛细淋巴管壁孔隙而大于毛细血管壁孔径时，粒子将会被动导向毛细淋巴管而进入淋巴系统。此外，在组织间隙中，由粘多糖胶原作为基质构成的凝聚态亲水性通道在生理pH条件下带负电，其可使带正电物质较长时间滞留在组织间隙内[The physiology of the lymphatic system.AdvancedDrug Delivery Reviews.2001.50：3-20；Targeting of colloids to lymph nodes：influence oflymphatic physiology and colloidal characteristics.Advanced Drug Delivery Reviews.1995，17：129-148]。

脂质体是一种磷脂类化合物在水溶液中形成的具有双层封闭结构的泡囊，由于其具有较大的载药空间，加之脂质体的制备工艺逐步完善，体内易降解、无毒、无免疫原性，已广泛用作包载各类药物尤其是抗肿瘤药物的载体。采用一定的技术将脂质体的粒径控制在一定的范围内，局部注射(如肌肉或皮下注射)后，可以使其具有淋巴趋向性。

早在上世纪80年代就有学者开始了脂质体作为淋巴系统靶向载体的研究[Lymphatic targeting with nanoparticulate system.Advanced Drug Delivery Reviews.2001，47：55-64；Liposomes to target the lymphatics by subcutaneous administration.AdvancedDrug Delivery Reviews.2001，50：143-156；Targeting of colloids to lymph nodes：influenceof lymphatic physiology and colloidal characteristics.Advanced Drug Delivery Reviews.1995，17：129-148；Lymphatic uptake and biodistribution of liposomes after subcutaneousinjection.II.Influence of liposomal size，lipid composition and lipid dose.Biochim.Biophys.Acta 1997，1328：261-272]，但鉴于存在如下两个主要问题未获得解决，至今在脂质体局部给药的淋巴转移性肿瘤治疗方面未见突破[The influence of the route ofadministration and liposome composition on the potential of liposomes to protect tissueagainst local toxicity of two antitumor drugs.Biochim.Biophys.Acta.1998，1369：159-172；Role of macrophages in the localization of liposomes in lymph nodes after subcutaneousadministration.International Journal of Pharmaceutics.1999，183：37-41]。其一，脂质体在注射部位的残留问题。组织间隙中脂质体淋巴吸收的动力来自于组织间隙液体与淋巴液之间的静压力差。注射初期，注射部位的静压力较大，脂质体被动吸收进入毛细淋巴管。随着组织间隙脂质体量的减少，注射部位与淋巴液之间的静压力差逐渐减小，导致在吸收后相有一定量脂质体残留在组织间隙。由于导向淋巴系统的脂质体包载的抗肿瘤药物毒性很大，因此较多残留药物将会造成给药部位的组织坏死。其二，脂质体进入淋巴循环系统后，由于淋巴引流方向上的前级淋巴结中巨噬细胞吞噬作用，造成对正常淋巴结的毒副作用，同时也使药物不能完全靶向至携带有肿瘤细胞的后级淋巴结中，从而影响淋巴转移性或原发性肿瘤的疗效。

因此，提高脂质体在注射部位的吸收效率、减少其残留，同时降低正常淋巴结对脂质体在正常淋巴系统中的蓄积，将有利于更好地实现载抗肿瘤药物的脂质体对转移性和原发性淋巴系统肿瘤的治疗。

某些大颗粒的物质，例如脂质体、纳米粒、胶束等，其混悬液具有一定的胶体渗透压，在注射局部可以形成一定的渗透压。如果注射的脂质体、纳米粒、胶束等的粒径足够大(如大于毛细淋巴管壁的孔径)，则其很少被淋巴系统吸收[Preparation ofbiodegradsble，surface engineered PLGA nanospheres with enhanced lymphatic drainageand Lymph Node Uptake.Pharmaceutical Research.1997，14：5；Lymphatic targeting withnanoparticulate system.Advanced Drug Delivery Reviews.2001，47：55-64；Liposomes totarget the lymphatics by subcutaneous administration.Advanced Drug Delivery Reviews.2001，50：143-156；Targeting of colloids to lymph nodes：influence of lymphaticphysiology and colloidal characteristics.Advanced Drug Delivery Reviews.1995.17：129-148；Lymphatic uptake and biodistribution of liposomes after subcutaneous injection.II.Influence of liposomal size，lipid composition and lipid dose.Biochim.Biophys.Acta1997，1328：261-272]，使毛细血管和组织间隙中的组织液向注射部位渗透，有利于在注射部位维持一定的静压力。

某些高分子物质，如右旋糖酐、壳多糖、海藻酸、透明质酸和聚乙二醇等及其衍生物，其一定浓度水溶液或生理盐水溶液在注射局部也可以形成一定的渗透压，并在一定时间内维持注射部位的静压力，同时自身还可以导向淋巴系统并被淋巴结摄取[^99m锝-葡聚糖淋巴系统显像剂研制及其初步临床应用.上海医科大学学报1991，18(4)：246-251；^99mTc-右旋糖酐-105在家兔淋巴系统的导向和定位作用.上海医科大学学报1996，23(suppl)：3-5；Interstitial MR and CT lymphography withGd-dTPA-co-alpha，omega-diaminoPEG(1450)and Gd-dTPA-co-1，6-diaminohexanepolymers：preliminary experience.Academic Radiology.1999，6(2)：112-118]。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种局部注射后促进脂质体淋巴吸收的方法，以减少脂质体在给药部位的残留量；本发明的目的还在于，提供一种饱和淋巴结摄取的方法，以降低正常淋巴结蓄积脂质体量。本方法可以显著减少局部注射脂质体在给药部位的残留量，并降低脂质体在正常淋巴系统的蓄积。

本方法的技术方案特征在于，采用相关物质维持注射部位静压力，加速脂质体淋巴吸收、减少脂质体局部残留。包括：选用一类脂质体及其粒径范围、脂质体膜材料及其配比，选择维持注射部位静压力的物质及其与脂质体的浓度比，以及给药方法。

本发明所述的维持注射部位静压力相关物质是空白颗粒性物质或高分子物质。

本发明所述的脂质体为胶体性混悬液，其粒径范围在10～100纳米之间。

本发明所述脂质体所用的膜材料主要包括下述三种成分：a、天然大豆卵磷脂、合成的不饱和磷脂和饱和磷脂；b、胆固醇；c、合成的带有长链单甲氧基聚乙二醇分子(分子量范围2000～6000)的磷脂类衍生物。其中三种成分之间的摩尔比分别为：a∶b为5∶1～1∶2，a∶e为100∶1～100∶10。

本发明选用的维持注射部位静压力物质包括下述两大类：(1)空白脂质体的粒径范围为100～300纳米。空白脂质体所用的脂质材料主要包括三种成分：a、天然大豆卵磷脂、合成的不饱和磷脂和饱和磷脂；b、胆固醇；c、合成的带有长链单甲氧基聚乙二醇分子(分子量范围2000～6000)的磷脂类衍生物。其中三种成分之间的摩尔比分别为：a∶b在5∶1～1∶2，a∶c在100∶1～100∶10。(2)高分子物质，其包括：右旋糖酐、羧甲基右旋糖酐、DEAE-右旋糖酐和右旋糖酐硫酸酯，壳多糖和脱乙酰壳多糖，海藻酸及其钠盐，透明质酸及其钠盐，聚乙二醇和单甲氧基聚乙二醇、单氨基聚乙二醇和双氨基聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇单氨等，除聚乙二醇及其衍生物分子量下限可达0.2万外，其余高分子分子量范围为4～100万。

本发明选用的维持注射部位静压力的物质与脂质体的浓度比为：(1)对于空白脂质体而言，单位体积内脂质体与空白脂质体的摩尔比为1∶1～3∶1。(2)对于高分子物质而言，单位体积内脂质体中磷脂与高分子的摩尔比为2∶1～200∶1。

本发明的具体给药方法是，将给药前单独制备好的脂质体混悬液、空白脂质体混悬液或高分子溶液，以单位体积内脂质体与后者按上述摩尔比混合后进行局部给药(如肌肉注射或皮下注射)。

本发明针对局部注射脂质体在给药部位的残留问题，采用“渗透压补偿”策略，其包括：(1)多粒径压力补偿：将小粒径脂质体与空白大粒径脂质体混合给药。所述小粒径脂质体既可进入淋巴系统又规避淋巴结窦状网络组织机械截留，所述空白大粒径脂质体其粒径大于毛细淋巴管壁孔隙，不能或很少进入淋巴循环而为组织间隙提供胶体渗透压。由于粒径的差异，小粒径脂质体将先期进入毛细淋巴管，大粒径空白脂质体则通过其固有的胶体渗透压吸引毛细血管内的液体进入组织间隙，从而有利于维持吸收后期的组织间隙静压力，继续促使小粒径脂质体进入淋巴系统。(2)高分子压力补偿：将高分子物质与小粒径脂质体混合给药。在组织间隙中，高分子物质在一定时间内的较高渗透性，使毛细血管内的液体较快进入组织间隙而促进局部脂质体的淋巴吸收。通过局部注射脂质体的同时给予大粒径空白脂质体或高分子物质，增加吸收后期给药部位的静压力，达到促进脂质体淋巴导向和减少注射部位残留的目的。所述高分子物质包括右旋糖酐、羧甲基右旋糖酐、DEAE-右旋糖酐和右旋糖酐硫酸酯，壳多糖和脱乙酰壳多糖，海藻酸及其钠盐，透明质酸及其钠盐，聚乙二醇和单甲氧基聚乙二醇、单氨基聚乙二醇和双氨基聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇单氨。

本发明针对正常淋巴结蓄积脂质体问题，采用“饱和巨噬细胞”策略，利用巨噬细胞对多糖类高分子物质具有较强吞噬作用的特点，在脂质体中加入多糖高分子以饱和巨噬细胞的吞噬作用。

动物体内和体外细胞试验结果表明：在给予脂质体的同时给予空白脂质体或高分子物质，脂质体在注射部位的残留量显著少于单独注射脂质体组；在正常淋巴结和巨噬细胞摄取量显著低于单独注射脂质体组。

1、在注射脂质体的同时给予空白脂质体

以^99mTc标记脂质体而不标记空白脂质体。SD大鼠(体重200～220g)随机分成两组，一组在大鼠足背部注射脂质体，另一组注射按一定比例混合的脂质体与空白脂质体的混合物。分别于注射后0.5、4和24小时处死大鼠，检测注射部位放射性计数，计算各时间点脂质体在给药部位的残留百分率。表1是空白脂质体对脂质体在注射部位残留率的影响结果(X±SD％，n＝6注射部位)。

表1

时间             0.5小时        4小时          24小时

单独脂质体组     88.95±5.64    37.48±9.16    11.40±1.61

脂质体与空白脂质体

                 81.34±5.17    21.07±4.51    9.74±1.38

混合物组

P值(与单独组比较)p＜0.05        p＜0.01        p＜0.01

其中脂质体粒径50nm，空白脂质体粒径100nm，脂质体与空白脂质体摩尔比例2∶1

2、在注射脂质体的同时给予高分子物质

以^99mTc标记脂质体。SD大鼠(体重200～220g)随机分成两组，一组大鼠在足背部注射脂质体，另一组注射按一定比例混合的脂质体与高分子溶液的混合物。分别于注射后0.5、4和、24小时处死大鼠，检测注射部位放射性计数，计算各时间点脂质体在给药部位的残留百分率。表2是高分子物质对脂质体在注射部位残留率的影响结果(X±SD％，n＝6注射部位)。

表2

时间                        0.5小时        4小时          24小时

单独脂质体组                89.43±5.06    37.68±8.23    18.43±2.78

脂质体与右旋糖酐溶液

                            66.35±6.07    26.02±3.75    13.66±2.13

混合物组

脂质体与羧甲基右旋糖酐溶液

                            77.03±2.24    24.45±1.90    11.56±1.78

混合物组

脂质体与DEAE-右旋糖酐溶液

                            61.00±7.60    17.26±1.93    3.13±0.56

混合物组

P值(与单独组比较)           p＜0.01        p＜0.01        p＜0.01

其中脂质体粒径50nm，高分子浓度25mg/ml，脂质体与高分子摩尔比例1∶50

3、饱和巨噬细胞策略

以^99mTc标记脂质体的体内外试验。

(1)体内淋巴结摄取试验

SD大鼠(体重200～220g)随机分成两组，一组大鼠在足背部注射脂质体，另一组注射按一定比例混合的脂质体与高分子溶液的混合物。分别于注射后0.5、4和、24小时处死大鼠，检测腘淋巴结中放射性计数，计算各时间点脂质体在腘淋巴结的蓄积量。表3是多糖类高分子物质对脂质体在腘淋巴结中蓄积量的影响结果(X±SD％/g，n＝6腘淋巴结)。

表3

时间                      0.5小时        4小时          24小时

单独脂质体组

                          29.14±2.52    41.62±8.22    47.38±8.83

脂质体与右旋糖酐溶液

                          8.62±1.82     13.26±3.75    33.33±7.99

混合物组

脂质体与羧甲基右旋糖酐溶液

                          12.77±5.69    39.42±5.69    44.99±7.42

混合物组

脂质体与DEAE-右旋糖酐溶液

                          6.164±2.38    10.23±2.26    12.68±3.02

混合物组

P值(与单独组比较)         p＜0.01        p＜0.01        p＜0.01

其中脂质体粒径50nm，多糖类高分子浓度25mg/ml，脂质体与多糖类高分子摩尔比例1∶50

(2)体外巨噬细胞试验

RAW-264.7细胞(一种巨噬细胞)分成两组，一组只给脂质体，另一组在给予高分子物质5分钟后再加脂质体。分别于时间点检测RAW-264.7细胞摄取放射性的计数，并计算各时间点脂质体被RAW-264.7细胞吞噬量。表4是多聚糖物质DEAE-右旋糖酐对巨噬细胞摄取脂质体的影响结果(脂质体总量80μmol；X±SD％/，n＝3复孔)。

表4

加入DEAE-右旋糖酐量(mg/ml)  0     0.25       0.50        0.75        1.00        1.25        1.50

RAW-264.7细胞吞噬量(％)     100   88.0±5.1  74.9±6.5   69.5±4.8   61.0±3.0   52.8±6.0   46.0±10.5

附图说明

图1是右旋糖酐(◇Mw＝110,000；+Mw＝500,000)、羧甲基右旋糖酐(×Mw＝110,000)和DEAE-右旋糖酐(△Mw＝500,000)对脂质体粒径的影响。

图2是右旋糖酐(◇Mw＝110,000；+Mw＝500,000)、羧甲基右旋糖酐(×Mw＝110,000)和DEAE-右旋糖酐(△Mw＝500,000)对脂质体包封率的影响。

图3是右旋糖酐及其衍生物与脂质体(含DTPA)竞争^99mTc的曲线。(A)脂质体加入标记有^99mTc的右旋糖酐溶液中；(B)右旋糖酐加入^99mTc标记的脂质体混悬液中；(C)羧甲基右旋糖酐加入^99mTc标记的脂质体混悬液中；(D)DEAE-右旋糖酐加入^99mTc标记的脂质体混悬液中。

图4是高分子分子量和荷电性对脂质体在大鼠给药部位残留量的影响。

图5是高分子分子量和荷电性对脂质体在大鼠腘淋巴结蓄积量的影响。

图6是5×10⁵个RAW-264.7细胞摄取脂质体量随温育时间的变化(脂质体总量160μmol)。

图7是在DEAE-右旋糖酐存在下5×10⁵个RAW-264.7细胞摄取脂质体量随温育时间的变化(DEAE-右旋糖酐浓度0.5mg/ml，脂质体总量160μmol)。

图8是温育2小时后5×10⁵个RAW-264.7细胞摄取脂质体量随加入脂质体量的变化。

图9是温育2小时后5×10⁵个RAW-264.7细胞摄取脂质体量随加入DEAE-右旋糖酐量的变化(脂质体总量80μmol)。

具体实施方式

以下结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明并不仅限制于下述实施例范围。

实施例1  脂质体的制备

阿霉素脂质体的制备  分别称取氢化磷脂100mg、胆固醇50mg、单甲氧基聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺15mg于500ml圆底烧瓶中，加入氯仿50ml，在水浴30℃下旋转蒸发至干，真空干燥24小时。于圆底烧瓶中加入0.155mM硫酸铵水溶液10ml，水浴60℃下振摇1小时获脂质体粗混悬液。在N₂气压下，将脂质体粗混悬液挤过50nm微孔滤膜，反复挤压6次后得50nm脂质体。将空白脂质体通过Sepherose CL-4B凝胶柱，以0.9％NaCl洗脱更换外水相，并将过柱后脂质体稀释到20mM。加入4mM的阿霉素水溶液，60℃水浴震荡15分钟，通过Sepherose CL-4B凝胶柱，以0.9％NaCl洗脱除去游离药物，即得50nm的阿霉素脂质体。

空白脂质体的制备  分别称取氢化磷脂100mg、胆固醇50mg、单甲氧基聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺15mg于500ml圆底烧瓶中，加入氯仿50ml，在水浴30℃下旋转蒸发至干，真空干燥24小时。于圆底烧瓶中加入10ml 0.9％NaCl溶液10ml，水浴60℃下振摇1小时后得脂质体粗混悬液。在N₂气压下，将脂质体粗混悬液挤过100nm微孔滤膜，反复挤压6次，即得100nm的空白脂质体。

实施例2  空白脂质体和高分子物质对脂质体稳定性的影响

空白脂质体对脂质体稳定性的影响  由于空白脂质体和脂质体的粒径存在差异，将两者混合后，有可能引起脂质体膜之间的融合或者脂质体中药物泄漏，为此，采用荧光分析法考察粒径为100nm大粒径空白脂质体与粒径为50nm小粒径脂质体混合后的稳定性。分别将荧光染料DPA和TbCl₃包封于100nm和50nm的脂质体中，若大小粒径脂质体在混合后发生脂质体膜融合或脂质体内容物均泄漏，两种荧光染料分子接触将会导致强荧光的产生。表5是脂质体膜材料对不同粒径脂质体混合物的稳定性影响，其中列出了不同脂质体膜材料和粒径的脂质体相互混合后荧光强度的变化。结果表明，加入稳定材料的100nm脂质体与50nm脂质体混合后稳定性好。

表5

    脂质体粒径          100nm          50nm脂质体粒径    脂质膜组成             含甲氧基聚乙  脂质体     二醇磷脂酰乙  (包Tbcl₃)  醇胺的脂质体             (包Tbcl₃)              含甲氧基聚乙  脂质体      二醇磷脂酰乙  (包Tbcl₃)   醇胺的脂质体              (包Tbcl₃)     100nm脂质体(包DPA)含甲氧基聚乙二醇磷脂酰乙醇胺的脂质体    (包裹DPA)    -         +     +         -    +           +     +           -     50nm脂质体(包DPA)含甲氧基聚乙二醇磷脂酰乙醇胺的脂质体    (包DPA)    +         +     +         -    -           +     +           -

+荧光强度增大(表明脂质体之间不稳定)；-荧光强度不变化(表明脂质体之间稳定)

高分子物质对脂质体稳定性的影响  用高分子物质促进脂质体在给药部位的淋巴吸收和减少淋巴引流方向上正常淋巴结脂质体蓄积的前提条件是，脂质体在高分子溶液中稳定，其主要表现为粒径不增大、药物不泄漏。将50nm脂质体分别与25mg/ml右旋糖酐(Mw＝40,000～500,000)、羧甲基化右旋糖酐(Mw＝110,000)和DEAE-化右旋糖酐(Mw＝500,000)溶液混合，水浴37℃放置，在一定时间点取样检测包封率和粒径。图1、图2分别表示粒径及包封率的变化。结果表明，在25mg/ml的右旋糖酐和DEAE-右旋糖酐溶液中脂质体可以稳定存在，在25mg/ml羧甲基化右旋糖酐溶液中脂质体在12小时内可以稳定存在。

实施例3  脂质体的^99mTc标记及其稳定性

脂质体在体内的行为是通过^99mTc标记来反映的，由于多糖类高分子化合物为多羟基化合物，其对^99mTc有一定的争夺能力，为此对脂质体^99mTc标记的稳定性进行了检测。

DTPA-HSPE的合成  在三颈瓶中加入二乙基三胺五醋酸(DTPA)14g、吡啶27ml、醋酐37ml、油浴65℃搅拌反应24小时后，抽滤，滤饼用30ml醋酐洗涤，30ml无水乙醚洗涤，干燥后得DTPA酸酐。将DTPA酸酐200mg溶于8ml吡啶中，另取磷脂酰乙醇胺(如HSPE)50mg溶于8ml吡啶中，60℃时将磷脂酰乙醇胺溶液加入到DTPA酸酐溶液中，反应2小时。结束后蒸干溶剂，沉淀以硅胶柱分离并收集DTPA-磷脂酰乙醇胺的流分。

脂质体^99mTc标记  分别称取氢化磷脂100mg、胆固醇50mg、聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺15mg，DTPA-磷脂酰乙醇胺36mg于500ml圆底烧瓶中，加入氯仿50ml，在水浴30℃下旋转蒸发至干，真空干燥24小时。于圆底烧瓶中加入0.9％NaCl溶液10ml，水浴60℃下振摇1小时获脂质体粗混悬液。在N2气压下，将脂质体粗混悬液挤过50nm微孔滤膜，反复挤压6次后得50nm脂质体混悬液。脂质体混悬液中加入氯化亚锡100μg，再加入Na99mTcO4 0.9％NaCl淋洗液(20mCi/ml)0.1ml，混匀后，室温放置10分钟，即得99mTc标记的脂质体[^99m锝-葡聚糖淋巴系统显像剂研制及其初步临床应用。

右旋糖酐^99mTc标记  称取右旋糖酐250mg，加入0.9％NaCl溶液10ml，配成浓度为25mg/ml的溶液。右旋糖酐溶液中加入氯化亚锡100μg，再加入Na^99mTcO₄0.9％NaCl淋洗液(20mCi/ml)0.1ml，混匀后，室温放置10分钟，即得^99mTc标记的右旋糖酐溶液[^99m锝-葡聚糖淋巴系统显像剂研制及其初步临床应用。

^99mTc标记脂质体的稳定性  在^99mTc标记的脂质体混悬液中加入右旋糖酐，分别于0.5、4和24小时将混合样品点样展开，并对展开条带进行放射性检测，结果表明放射性均处在脂质体上；在^99mTc标记的右旋糖酐溶液中加入脂质体混悬液，分别在0.5、4和24小时将混合样品点样展开，并对展开条带进行放射性检测，结果发现随时间延长放射性逐渐向脂质体上转移；在^99mTc标记的脂质体混悬液中加入羧甲基右旋糖酐、DEAE-右旋糖酐，分别于0.5、4和24小时将混合样品点样展开，并对展开条带进行放射性检测，放射性仍处在脂质体上。上述结果均提示，标记在脂质体上的^99mTc有良好的稳定性。

实施例4  动物体内试验

(1)空白脂质体策略

按实施1和3分别制备100nm空白脂质体和50nm脂质体，并只对后者进行^99mTc标记。50nm脂质体与100nm空白脂质体按摩尔比2∶1混合。取SD大鼠18只(体重200～220g)，随机分成两组，一组在大鼠足背部只注射50nm脂质体，另一组注射50nm脂质体与100nm空白脂质体按摩尔比2∶1混合物。分别于注射后0.5、4和24小时各处死3只大鼠，检测注射部位放射性计数，计算各时间点50nm脂质体在给药部位的残留百分率，结果见表1。

(2)高分子策略

按实施例1和3制备并用^99mTc标记50nm脂质体，备用。

高分子溶液配置  分别称取右旋糖酐(Mw＝40,000～500,000)、羧甲基右旋糖酐(Mw＝110,000)和DEAE-右旋糖酐(Mw＝500,000)或脱乙酰壳多糖(Mw＝40,000～500,000)各1g，各以0.9％NaCl配制成浓度为75mg/ml的溶液。

混合方法  临给药前将脂质体分别与右旋糖酐、羧甲基右旋糖酐和DEAE-右旋糖酐或脱乙酰壳多糖溶液按体积比2∶1混合。

动物试验  取SD大鼠(体重200～220g)45只，随机分成五组。一组大鼠在足背部只注射脂质体，其余四组分别注射脂质体与不同高分子溶液的混合物。分别于注射后0.5、4和、24小时每组各处死3只大鼠，检测注射部位和腘淋巴结的放射性计数，计算各时间点脂质体在腘淋巴结的蓄积量和注射部位残留量(结果见图4、表2和图5、表3)。由图表可见，在注射脂质体的同时给予高分子后，不同分子量和不同荷电性高分子可以显著将少脂质体在注射部位的残留量；除荷负电高分子外，荷正电和中性高分子均能显著减少脂质体在正常淋巴结的蓄积。

实施例5  体外巨噬细胞试验

RAW-264.7细胞培养及处理

用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液，在二氧化碳培养箱内(37℃、5％CO₂、饱和湿度)连续培养RAW-264.7细胞(巨噬细胞)。用前将处于对数生长期贴壁细胞用RPMI1640培养液洗涤3次，将贴壁细胞消化呈悬浮状态，收集细胞、计数、调整细胞悬液的浓度至所需浓度，备用。

RAW-264.7细胞吞噬试验

每个5ml样品管中加入0.5ml RAW-264.7细胞悬液(5×10⁵个)，37℃温育。不加或加入DEAE-右旋糖酐或脱乙酰壳多糖或右旋糖酐5min后，将^99mTc标记的脂质体加入继续温育一定时间，4000rpm离心弃去上清液，加入0.9％NaCl溶液2ml洗涤，再离心弃去上清液，重复操作3次。检测细胞沉淀中放射性计数，计算占加入总放射性计数的百分数，考察多糖类高分子物质对巨噬细胞吞噬脂质体的影响。结果表明，无论有无多糖类物质存在，37℃温育2小时后，RAW-264.7细胞吞噬脂质体基本达到平衡(图6、图7)，且吞噬量随加入脂质体量增加而呈线性增加(图8)，随加入多糖类物质量增加而呈线性下降(图9和表4)。