一种建立冬枣多倍体诱导体系的方法

摘要

本发明公开了一种建立冬枣多倍体诱导体系的方法，包括①冬枣细胞旺盛分裂的茎尖和叶片培养；②以冬枣茎尖生长点和叶片为处理材料，用秋水仙素处理进行染色体加倍；③小苗生根和移栽；④四倍体植株的嫁接；⑤四倍体植株的特征和应用等步骤。本发明以细胞分裂旺盛的茎尖和叶片为处理材料，能有效地克服基因型制约，获得同质多倍体植株的效率高，对具有重要经济价值的枣的遗传改良有重要价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种建立冬枣多倍体诱导体系的方法，属于农业生物技术领域或植物细胞工程领域。

背景技术

我国是枣树的起源地和栽培中心，种质资源非常丰富。冬枣(Ziziphus jujuba Mill。)是鼠李科枣属植物，因果实成熟在寒露节后而得名。冬枣风味独特，产量高，是品质优良的一个鲜食栽培品种，在果树生产、贸易上具有重要的经济价值。沾化冬枣是冬枣中鲜食品质最好的品种之一，主产于山东省渤海湾地区，适合在中低度盐地生长，经济价值很高。然而，沾化冬枣存在果实偏小、果核大、果皮薄及耐贮性差等缺点，而且农户为追求产量，使用激素处理增大果实，极大的降低了沾化冬枣的优良品质。由于冬枣花小，雌雄蕊分离困难，落花落果严重，胚容易退化，到目前为止，冬枣育种工作基本上停留在田间品种选优，周期长和效率低下。

多倍化是植物进化变异的自然现象，也是促进植物发生进化改变的重要力量(杨继，2001)。被子植物中，约70％的种类在进化过程中发生过一次或多次多倍化(Masterson，1994)，这表明多倍化可以增强植物的适应性和竞争力。多倍体植株在形态上多表现营养器官和生殖器官的巨大性，适应性、抗逆性较强，此外次生代谢产物也因倍性变化而产生变化。对以收获营养器官为目的的果树来说多倍体果实在果实大小、品质、环境的适应性及抗逆性方面具有更大的优势，而且还可能表现无核或少核的优异性状，在生产和育种上具有重要经济价值(Stanford，1983)。二倍体玫瑰香葡萄利用秋水仙素得到的四倍体植株，不仅保持了二倍体的优良品种，而且增强了抗逆性，果实也显著增大，获得了极好的经济性状(罗耀武，1995)。秋水仙素诱导的同源四倍体金柑表现大果、无或少核的多倍体性状(李传生和张美珍，1988)。

有性多倍化是多倍体形成的主要路线，2n配子在多倍性形成中起着极其重要的作用。对于不能产生2n配子或仅能产生SDR(second division restitution)或PMD(Post-meitotic doubling)型配子的作物，体细胞染色体加倍是进行多倍化的理想途径(Stanford，1983)。前人研究认为适合染色体加倍的作物应具备染色体数目少、收获营养体为主、异花授粉及多年生和营养繁殖的特性(Dewey，1981)。自1937年Blakeslee和Avery利用秋水仙素诱导曼陀罗四倍体植株获得成功以后，秋水仙素在果树多倍体诱导方面的得到广泛应用，用来改良果实性状或诱导杂交亲本(Preieri，2001)。沾化冬枣多倍体诱导技术难度较大，主要是由于目前冬枣的组培体系效率较低，植株在培养基上生长缓慢。目前关于冬枣的离体培养体系报道较少，王玉珍(1999)和徐华陵(2003)以冬枣的茎尖和茎段为外植体培养，获得了再生植株，但繁殖效率不高。陈宗礼等(2002)以沾化冬枣叶片为外植体，诱导愈伤组织的产生，但愈伤组织分化率仅为40％。

枣利用秋水仙素处理进行染色体加倍的研究报道较少，严仁玲等(1996)用不同浓度的秋水仙素处理金丝小枣试管苗单芽茎段，促使不定芽染色体加倍，获得了同源四倍体株系。蒋洪恩等(2004)以冬枣、临猗梨枣和辣椒枣一年生嫁接苗为试材，以秋水仙碱为诱变剂诱导多倍体，但仅在临猗梨枣中获得一株纯化的四倍体植株。

目前报道获得的四倍体枣为金丝小枣和临猗梨枣，是与冬枣基因型完全不同的栽培品种，而且在所用处理材料类型、秋水仙素处理程序，培养基种类以及激素方面都有显著差异。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是，以冬枣茎尖和叶片为处理材料，利用离体培养体系，用秋水仙素诱导染色体加倍手段，建立一种冬枣多倍体诱导体系的方法，以选择获得同质四倍体植株。

本发明涉及的建立冬枣多倍体诱导体系的方法，包括①冬枣细胞旺盛分裂的茎尖和叶片培养；②以冬枣茎尖生长点和叶片为处理材料，用秋水仙素处理进行染色体加倍；③小苗生根和移栽；④四倍体植株的嫁接；⑤四倍体植株的特征和应用；其中，所述的冬枣细胞旺盛分裂的茎尖和叶片培养是指：将茎尖转入茎延伸培养基生长，将叶片转入叶片诱导丛生芽培养基生长；所述秋水仙素处理冬枣茎尖生长点或叶片的方法是：将长至5mm-6mm的冬枣细胞分裂旺盛的茎尖或叶片，放于含有质量体积百分比为0.01％-0.2％的秋水仙素的MS液体培养基中，在25℃±2℃黑暗条件下，100rmp摇动24-72小时，之后，无菌水冲洗2-3次，茎尖转入茎延伸培养基中培养，叶片转入叶片诱导丛生芽培养基中培养，30-35天继代一次；所述小苗生根和移栽方法是指：将秋水仙素处理诱导后的四倍体冬枣组织培养苗，接种在生根培养基中，进行生根；当根长2cm-3cm时，移入砂∶蛭石的重量比为1∶1的基质中，前6-7天盖好封口膜，保持湿度为90％，20℃～25℃环境下，生长15-20天，之后移至室外土壤中生长，其间每2-3天浇一次1/2 MS培养基无机盐溶液，隔天浇水一次。

上述茎延伸培养基是指：添加有1-3mg L^-1赤霉素(GA₃)、0.1-0.5mg L^-1 6-苄基嘌呤(6-BA)和100-500mg L^-1酪蛋白水解物的MS固体培养基；

上述叶片诱导丛生芽培养基是指：添加有0.5-2mg L^-1噻二唑苯基脲(TDZ)、0.3-1mg L^-1吲哚乙酸(IAA)和100-500mg L^-1酪蛋白水解物的WPM固体培养基；

上述生根培养基是指：添加有0.1-0.5mg L^-1吲哚乙酸(IAA)，0.2-1mg L^-1吲哚丁酸(IBA)的Nitsh固体培养基；

在上述培养基中涉及的激素浓度的优选量，因培养材料的基因型不同，可在所述用量范围内变动。

上述MS固体培养基(Murashige and Skoog)的配方是：KNO₃1900mg L^-1，NH₄NO₃1650mgL^-1，CaCl₂·2H₂O 440mg L^-1，MgSO₄·7H₂O 370mgL^-1，KH₂PO₄·H2O 170mg L^-1，FeSO₄·7H₂O27.8mg L^-1，EDTA·Na₂37.3mg L^-1，ZnSO₄·7H₂O 10mg L^-1，MnSO₄·4H₂O 22.3mg L^-1，H₃BO₃10mg L^-1，KI 0.83mg L^-1，Na₂MoO₄·2H₂O 0.5mg L^-1，CuSO₄·5H₂O 0.025mg L^-1，CoCl₂·6H₂O0.025mg L^-1，盐酸硫胺素10.0mg L^-1，盐酸吡哆醇1.0mg L^-1，烟酸1.0mg L^-1，甘氨酸2.0mg L^-1，肌醇100.0mg L^-1，生物素0.05mg L^-1，蔗糖30g L^-1，琼脂粉6g L^-1，pH 6.0；该培养基主要用于冬枣茎尖培养和继代。

上述WPM固体培养基(Woody plant medium)的配方是：NH₄NO₃400mg L^-1，CaCl₂·H₂O96mg L^-1，Ca(NO₃)₂ 556mg L^-1，MgSO₄·7H₂O 370mgL^-1，K₂SO₄9900mg L^-1，KH₂PO₄·H2O 170mgL^-1，FeSO₄·7H₂O 27.8mg L^-1，EDTA·Na₂37.3mg L^-1，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg L^-1，MnSO₄·H₂O22.3mg L^-1，H₃BO₃ 6.2mg L^-1，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg L^-1，CuSO₄·5H₂O 0.25mg L^-1，盐酸硫胺素1.6mg L^-1，烟酸0.5mg L^-1，肌醇100.0mg L^-1，蔗糖30g L^-1，琼脂粉6g L^-1，pH 6.0；该培养基主要用于冬枣叶片离体培养。

上述Nithsh固体培养基的配方是：KNO₃950mg L^-1，NH₄NO₃720mg L^-1，CaCl₂·2H₂O166mg L^-1，MgSO₄·7H₂O 185mgL^-1，KH₂PO₄·H₂O 68mg L^-1，FeSO₄·7H₂O 27.85mg L^-1，EDTA·Na₂ 37.3mg L^-1，ZnSO₄·7H₂O 10mg L^-1，MnSO₄·4H₂O 25mg L^-1，KI 10mg L^-1，CoCl₂·6H₂O 0.025mg L^-1，MoO₃0.25mg L^-1，肌醇5000mg L^-1，蔗糖30g L^-1，琼脂粉6g L^-1，pH 6.0；该培养基主要用于栽培苗的生根。

其中，MS液体培养基、WPM液体培养基、Nithsh液体培养基的配方是指：不添加所述的琼脂粉的配方；

上述1/2 MS基本培养基无机盐溶液是指：MS液体培养基无机盐成分含量的一半。

本发明中所述培养基及植物生长调节物质均热压灭菌；秋水仙素过滤灭菌，在培养基灭菌后加入。

本发明涉及的建立冬枣多倍体诱导体系的方法中，所述冬枣是指鼠李科枣属植物的晚熟栽培枣品种(Zizyphus jujuba Mill)。

上述冬枣优选是沾化冬枣。

上述冬枣因在寒露节后成熟而得名，丰产稳产，适应性强，是鲜食优良枣品种。沾化冬枣是其中鲜食品质最好的品种之一，主产于我省渤海湾地区。

本发明涉及的建立冬枣多倍体诱导体系的方法中，所述秋水仙素处理冬枣茎尖生长点或叶片的方法优选是：将长至5mm-6mm的冬枣细胞分裂旺盛的茎尖或叶片，放于含有质量体积百分比为0.05％-0.1％的秋水仙素的MS液体培养基中，在25℃黑暗条件下，100rmp摇动48-72小时，之后，无菌水冲洗2-3次，茎尖转入茎延伸培养基中培养，叶片转入叶片诱导丛生芽培养基中培养，30天继代一次。

上述秋水仙素处理冬枣茎尖生长点或叶片的方法最优选是：将长至5mm-6mm的冬枣细胞分裂旺盛的茎尖或叶片，放于含有质量体积百分比为0.1％的秋水仙素的MS液体培养基中，在25℃黑暗条件下，100rmp摇动48小时，之后，无菌水冲洗2-3次，茎尖转入茎延伸培养基中培养，叶片转入叶片诱导丛生芽培养基中培养，30天继代一次。

本发明涉及的建立冬枣多倍体诱导体系的方法中，所述茎延伸培养基优选是指：添加有1-2mg L^-1赤霉素(GA₃)、0.2-0.4mg L^-1 6-苄基嘌呤(6-BA)和300mg L^-1酪蛋白水解物的MS固体培养基；所述叶片诱导丛生芽培养基是指：添加有1-2mg L^-1噻二唑苯基脲(TDZ)、0.5-1mg L^-1吲哚乙酸(IAA)和300mg L^-1酪蛋白水解物的WPM固体培养基；所述生根培养基是指：添加有0.2-0.3mg L^-1吲哚乙酸(IAA)，0.3-0.6mg L^-1吲哚丁酸(IBA)的Nitsh固体培养基。

上述茎延伸培养基最优选添加有2mg L^-1赤霉素(GA₃)、0.2mg L^-1 6-苄基嘌呤(6-BA)和300mg L^-1酪蛋白水解物的MS固体培养基。

上述叶片诱导丛生芽培养基最优选添加有1.3mg L^-1噻二唑苯基脲(TDZ)、0.7mgL^-1吲哚乙酸(IAA)和300mg L^-1酪蛋白水解物的WPM固体培养基。

在上述的秋水仙素处理冬枣茎尖生长点或叶片的方法中，处理后植株的倍性鉴定采用流式细胞仪测定叶片DNA含量的方式，DNA含量是二倍体植株两倍的即为四倍体植株(见图1)。细胞学观察结果验证了流式细胞仪的分析结果，对照二倍体的沾化冬枣根尖染色体数为2n＝2x＝24，而四倍体沾化冬枣植株的根尖染色体数目为2n＝4x＝48(见图2)。

本发明涉及的建立冬枣多倍体诱导体系的方法中，所述生根培养基最优选添加有0.2mg L^-1吲哚乙酸(IAA)，0.3mg L^-1吲哚丁酸(IBA)的Nitsh固体培养基。

本发明涉及的建立冬枣多倍体诱导体系的方法中，所述四倍体植株的嫁接方法优选是，选取生长健壮的四倍体组培苗和移栽苗，在5-6月份嫁接在沾化冬枣大树或枣砧木上。处理中，按常规嫁接方式处理砧木和接穗的切口，嫁接口用塑料薄膜缠绕，上部用塑料袋罩住保湿，并注意遮阴。

本发明涉及的建立冬枣多倍体诱导体系的方法中，所述四倍体植株的特征表现为植株生长缓慢，茎粗壮，节间较短，叶形变圆，气孔密度和大小均与二倍体植株有显著性差异(见图3)。

利用本发明涉及的建立冬枣多倍体诱导体系的方法，以冬枣茎尖生长点和叶片为受体材料，采用秋水仙素处理诱导染色体加倍，建立了多倍体诱导体系，经选择获得同质四倍体植株，将在冬枣生产和育种上起重要作用。冬枣生长点不经脱分化过程直接出芽，具有基因型依赖性小、体细胞无性系变异小等优点，是合适的多倍体诱导材料。

本发明能获得大量的具有很强植株再生能力的组培苗，再生植株体细胞无性系变异小。本发明的特点在于：1)大幅度减少基因型障碍，可诱导绝大多数基因型的冬枣快速产生大量离体茎尖；2)培养的冬枣茎尖生长点分裂旺盛，生长速度快，适于细胞学和分子生物学实验；3)取材不受季节限制；4)可以较高频率的诱导同质多倍体植株。

附图说明 

图1冬枣二倍体及四倍体植株的DNA含量

其中：A二倍体植株叶片的DNA含量，B四倍体植株叶片的DNA含量

图2冬枣二倍体及四倍体植株的染色体数目

其中：A二倍体植株根尖染色体数目(2n＝2x＝24)，B四倍体植株叶片的DNA含量测定(2n＝4x＝48)

图3冬枣二倍体及四倍体植株的气孔密度和大小

其中：A二倍体植株叶片气孔密度和大小；B四倍体植株叶片气孔密度和大小

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明：

实施例1

沾化冬枣茎尖培养

沾化冬枣是鲜食品质最好的冬枣品种之一，主产于我省渤海湾地区。沾化冬枣休眠芽在28℃，70％湿度的恒温培养箱中水培萌发。萌发的幼枝剪成单芽茎段，70％酒精杀菌30s，0.1％的升汞消毒8min，无菌水冲洗3-4次，然后接种在添加1mg L^-1 GA₃和0.2mg L^-1 6-BA的MS固体培养基上，35天继代一次。组织培养苗10-15天可生长2cm以上，生长点细胞处于旺盛分裂状态。

秋水仙素(Sigma，USA)添加在含有1mg L^-1GA₃和0.2mg L^-1BA的MS液体培养基中，终浓度为0.1％。将细胞分裂旺盛的茎尖放于含有0.1％浓度秋水仙素的MS液体培养基中，25℃黑暗条件下，100rmp摇动48h。秋水仙素处理后的茎尖，无菌水冲洗2-3次，转入添加1mg L^-1 GA₃和0.2mg L^-1 6-BA的MS培养基中培养。

上述MS固体培养基(Murashige and Skoog)的配方是：KNO₃1900mg L^-1，NH₄NO₃1650mgL^-1，CaCl₂·2H₂O 440mg L^-1，MgSO₄·7H₂O 370mgL^-1，KH₂PO₄·H2O 170mg L^-1，FeSO₄·7H₂O27.8mg L^-1，EDTA·Na₂37.3mg L^-1，ZnSO₄·7H₂O 10mg L^-1，MnSO₄·4H₂O 22.3mg L^-1，H₃BO₃10mg L^-1，KI 0.83mg L^-1，Na₂MoO₄·2 H₂O 0.5mg L^-1，CuSO₄·5H₂O 0.025mg L^-1，CoCl₂·6H₂O0.025mg L^-1，盐酸硫胺素10.0mg L^-1，盐酸吡哆醇1.0mg L^-1，烟酸1.0mg L^-1，甘氨酸2.0mg L^-1，肌醇100.0mg L^-1，生物素0.05mg L^-1，蔗糖30g L^-1，琼脂粉6g L^-1，pH 6.0。

上述Nithsh固体培养基的配方是：KNO₃950mg L^-1，NH₄NO₃720mg L^-1，CaCl₂·2H₂O166mg L^-1，MgSO₄·7H₂O 185mgL^-1，KH₂PO₄·H₂O 68mg L^-1，FeSO₄·7H₂O 27.85mg L^-1，EDTA·Na₂ 37.3mg L^-1，ZnSO₄·7H₂O 10mg L^-1，MnSO₄·4H₂O 25mg L^-1，KI 10mg L^-1，CoCl₂·6H₂O 0.025mg L^-1，MoO₃0.25mg L^-1，肌醇5000mg L^-1，蔗糖30g L^-1，琼脂粉6g L^-1，pH 6.0。

处理植株的倍性鉴定

秋水仙素处理茎尖通过流式细胞仪测定叶片DNA含量，四倍体植株的DNA含量是二倍体植株的两倍(见图1)。细胞学观察结果验证了流式细胞仪的分析结果，对照二倍体的沾化冬枣根尖染色体数为2n＝2x＝24，  而四倍体沾化冬枣植株的根尖染色体数目为2n＝4x＝48(见图2)。

四倍体植株的生根和移栽

对诱导的四倍体沾化冬枣组培苗接种在添加0.2mg L^-1IAA和0.3mg L^-1IBA的生根培养基中，进行生根。当根长2-3cm时，移入砂与蛭石1∶1的基质中，开始一周盖好封口膜，保持湿度在90％，温度为25℃。温室环境下生长15-16天后移至土壤中，每2-3天浇一次1/2MS培养基无机盐溶液，隔天浇水一次。

四倍体植株的嫁接

选取生长健壮的四倍体组培苗和移栽苗，在5-6月份嫁接在树龄10-15的沾化冬枣大树或枣砧木上，按常规嫁接方式处理砧木和接穗的切口，嫁接口用塑料薄膜缠绕，上部用塑料袋罩住保湿，并注意遮阴。

四倍体植株特征和应用

四倍体植株生长缓慢，茎粗壮，节间较短，叶形变圆，二倍体与四倍体植株的气孔密度和大小均有显著性差异(见图3)。

实施例2

具体方法如实施例1，其中，茎延伸培养基激素浓度为1.5mg L^-1GA₃和0.3mg L^-16-BA，秋水仙素浓度为0.1％，处理时间为72小时，诱导获得了同质四倍体植株，生根培养基激素浓度为0.3mg L^-1IAA和0.4mg L^-1IBA。

实施例3

具体方法如实施例1，其中，茎延伸培养基激素浓度为2mg L^-1GA₃和0.4mg L^-16-BA，秋水仙素浓度为0.1％，处理时间为48小时，诱导获得了同质四倍体植株，生根培养基激素浓度为0.3mg L^-1IAA和0.6mg L^-1IBA。

实施例4

具体方法如实施例1，茎延伸培养基激素浓度为1.5mg L^-1GA₃和0.3mg L^-1 6-BA，秋水仙素浓度为0.1％，处理时间为24h，诱导获得了同质四倍体植株，生根培养基激素浓度为0.3mg L^-1IAA和0.4mg L^-1IBA。

实施例5

具体方法如实施例1，其中，所处理材料为冬枣叶片，叶片WPM培养基激素浓度为1.3mg L^-1噻二唑苯基脲(TDZ)、0.7mg L^-1吲哚乙酸(IAA)。秋水仙素浓度为0.1％，处理时间为24小时，诱导获得了同质四倍体植株，生根培养基激素浓度为0.3mg L^-1IAA和0.4mg L^-1IBA。

上述WPM固体培养基(Woody plant medium)的配方是：NH₄NO₃ 400mg L^-1，CaCl₂·H₂O96mg L^-1，Ca(NO₃)₂ 556mg L^-1，MgSO₄·7H₂O 370mgL^-1，K₂SO₄9900mg L^-1，KH₂PO₄·H2O 170mgL^-1，FeSO₄·7H₂O 27.8mg L^-1，EDTA·Na₂37.3mg L^-1，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg L^-1，MnSO₄·H₂O22.3mg L^-1，H₃BO₃6.2mg L^-1，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg L^-1，CuSO₄·5H₂O 0.25mg L^-1，盐酸硫胺素1.6mg L^-1，烟酸0.5mg L^-1，肌醇100.0mg L^-1，蔗糖30g L^-1，琼脂粉6g L^-1，pH 6.0。