一种具有美容美颜作用的冲剂

摘要

本发明是一种具有美容养颜作用的冲剂，特别是一种由生物制剂和中药成分制成的具有美容养颜作用的冲剂，它的成分主要包括α－甘露聚糖肽10－40％、调节新陈代谢的中药60－90％。所述的成分包括有α－甘露聚糖肽10－40％、调节新陈代谢的中药10－50％、抗氧化清除自由基的中药10－60％。所述的成分包括有α－甘露聚糖肽10－35％、调节新陈代谢的中药10－40％、抗氧化清除自由基的中药10－50％、抑制黑色素形成的中药10－50％。这种具有美容养颜作用的冲剂，它将生物制剂于中药制成一种复方制剂，通过调节机体整体代谢功能，内分泌功能，及滋补五脏、调理气血精津、疏通经络等途径来延缓皮肤的衰老，起到美容养颜的作用。

说明书

                     所属技术领域

本发明属于一种具有美容养颜作用的冲剂，特别是关于一种生物制剂和中药成分的具有美容养颜作用的冲剂。

                      背景技术

衰老是所有生物体的生命活动过程中不可抗拒的自然规律。人体皮肤的衰老，特别是经常裸露的面部皮肤的衰老是整个机体最易察见的外部表现。祖国传统医学认为，在内的五脏与在外的形体官窍是一个有机的整体，五脏的生理功能和病理变化可通过人体外在的各种症状体征间接反映出来，人体皮肤的各种颜色、状态的改变也可以揭示体内五脏的功能状态，从而反映整个机体衰老的程度。根据这一医学原理研制出口服的美容产品，着力攻克影响容颜的内在病因，从而使气血充盈，皮肤得以滋养，为美容养颜开辟一条新的途径。

                      发明内容

人的皮肤和气血是身体内部的一面镜子，如面部的雀斑、黄褐斑、痤疮及皮肤粗糙等皆为内分泌紊乱，酪氨酸代谢异常，脏腑失调及经络不畅所致。正常情况下，五脏六腑功能正常，阴阳平衡，气血充盛，经络通畅，则使肌肤柔软细腻，红润光泽，毛发乌亮，容光焕发。肝肾不足，可发生多种皮肤病，其症状大多是慢性过程，皮肤干燥，肥厚粗糙，脱屑，或脱发，色素沉着，或伴生疣目、血痣、色素斑、面生黧黑等，且常伴有肝肾阴虚证候。

本发明的目的是制成一种具有美容养颜作用的冲剂，它将生物制剂与中药合成制成一种复方冲剂，通过调节机体整体代谢功能，内分泌功能，及滋补五脏、调理气血精津、疏通经络等途径来延缓皮肤的衰老，起到美容养颜的作用。

本发明的技术方案是设计一种具有美容养颜作用的冲剂，其特征是：它的成分主要包括α-甘露聚糖肽10-40％、调节新陈代谢的中药60-90％。

所述的成分包括有α-甘露聚糖肽10-40％、调节新陈代谢的中药10 50％、抗氧化清除自由基的中药10-60％。

所述的成分包括有α-甘露聚糖肽10-35％、调节新陈代谢的中药10-40％、抗氧化清除自由基的中药10-50％、抑制黑色素形成的中药10-50％。

所述的成分包括有α-甘露聚糖肽10-30％、调节新陈代谢的中药10-30％、抗氧化清除自由基的中药10-40％、抑制黑色素形成的中药10-50％、美白作用的中药10-60％。

所述的成分包括有α-甘露聚糖肽10-20％、调节新陈代谢的中药10-30％、抗氧化清除自由基的中药10-30％、抑制黑色素形成的中药10-40％、美白作用的中药10-50％、补气补血、滋养肝肾的中药10-40％。

所述的调节新陈代谢的中药有天然花粉、灵芝、桑叶、人参花、玫瑰；抗氧化清除自由基的中药有人参、五味子、当归、冬虫夏草、绿茶、银杏、丹参、厚朴、大枣、太子参、酸枣仁、地黄；抑制黑色素形成的中药有：川芎嗪、山茱萸、当归、芦荟；美白作用的中药有：槐米、田七、川芎、桃红、黄芩、白芷、珍珠；补气的中药有：人参、党参、黄芪、白术、茯苓；补血的中药有：当归、熟地、何首乌、枸杞子、阿胶、黄精、鸡血藤；滋养肝肾的中药有：冬虫草、霍山石斛、白芍、山茱萸、桑椹子、女贞子、旱莲草、熟地、怀牛膝、何首乌、菟丝子、补骨脂、云苓。

所述的冲剂每1000g中含α-甘露聚糖肽400g、天然花粉150g、灵芝100g、桑叶150g、人参花100g、玫瑰100g。

所述的冲剂每1000g中含α-甘露聚糖肽350g、天然花粉50g、灵芝50g、桑叶120g、人参花80g、玫瑰100g、人参30g、五味子20g、当归20g、冬虫夏草20g、绿茶25g、银杏30g、丹参10g、厚朴10g、大枣35g、太子参10g、酸枣仁20g、地黄20g。

所述的冲剂每1000g中含α-甘露聚糖肽300g、天然花粉50g、灵芝50g、桑叶50g、人参花50g、玫瑰100g、人参30g、五味子20g、冬虫夏草20g、绿茶25g、银杏30g、丹参10g、厚朴10g、大枣35g、太子参10g、酸枣仁20g、地黄20g、川芎嗪30g、山茱萸30g、当归50g、芦荟60g。

所述的冲剂每1000g中含α-甘露聚糖肽200g、天然花粉50g、灵芝50g、桑叶50g、人参花50g、玫瑰50g、人参30g、五味子20g、冬虫夏草20g、绿茶25g、银杏30g、丹参10g、厚朴10g、大枣35g、太子参10g、酸枣仁20g、地黄20g、川芎嗪30g、山茱萸30g、当归50g、芦荟60g、槐米20g、田七10g、川芎10g、桃红20g、黄芩20g、白芷20g、珍珠50g。

所述的冲剂每1000g中含α-甘露聚糖肽100g、天然花粉50g、灵芝30g、桑叶20g、人参花30g、玫瑰50g、五味子20g、冬虫夏草20g、绿茶25g、银杏30g、丹参10g、厚朴10g、大枣35g、太子参10g、酸枣仁20g、地黄20g、川芎嗪20g、当归30g、芦荟50g、槐米20g、田七10g、川芎10g、桃红20g、黄芩20g、白芷20g、珍珠50g、人参10g、党参10g、黄芪10g、白术10g、茯苓10g、当归10g、熟地10g、何首乌10g、枸杞子10g、阿胶10g、黄精10g、鸡血藤10g、冬虫草10g、霍山石斛10g、白芍10g、山茱萸20g、桑椹子10g、女贞子10g、旱莲草10g、熟地10g、怀牛膝10g、何首乌10g、菟丝子10g、补骨脂10g、云苓10g。

本发明特点是：α-甘露聚糖肽是一种生物反应调节剂，能调节机体各种生理功能使之处于平衡状态，同时能增强机体的抗病能力，使机体处于协调健康的状态；天然花粉具有增强和调节新陈代谢的作用，花粉中含有大量的营养全面平衡的人体所需的营养成分，并且都属于天然活性，易被人体消化吸收，有利于调节人体的新陈代谢，具有独特的增强体内调节功能。它对内分泌系统能起到双向调节作用，不仅促进新陈代谢，使皮肤表皮细胞更新加快，显得年轻、有活力，而且抑制促进黑色素形成的酪氨酸酶的活性，减淡已有的色素沉着，并且对于新色斑的产生有积极的预防作用。天然花粉还有多种维生素的作用、催眠作用及通便作用等；人参具有抑制脂质过氧化，清除自由基，推迟细胞衰老等作用；川芎嗪具有抑制黑素细胞增殖、黑素合成、酪氨酸酶活性的作用；槐米具有活血行气、祛瘀止痛的功效，是常用的美白药物；黄芪甘温益气，益卫固表，益气生血；制首乌滋补肝肾，益精血，与黄芪相辅相成，可增强补气补血，滋肾养颜之功；荆芥祛风止痒，理血止血；甘草补中益气，调和诸药；这四味药共行补气补血、滋养肝肾、驱风消斑之功效。

                     具体实施方式

由于本发明将α-溶血链球菌菌种搭载返回式太空飞行器(宇宙飞船或返回式卫星)，利用太空中微(零)重力、宇宙射线、交变磁场、高真空、高热深冷等因素的综合作用，使菌株的DNA双链结构断裂，基因组发生重排，从而产生新的菌株。返回地面后，对经过太空搭载的菌株进行培养和筛选，通过研究其形态特征、培养特征、生理生化反应、代谢产物、遗传性状及蛋白表达、遗传稳定性、中试生产指标等内容，优选出其中的正变异、遗传特性稳定的菌种，经培养发酵后得到治疗溃疡性结肠炎的药物。该菌种已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.1082。

特别是α-溶血链球菌D33菌株经太空搭载诱变，地面上的筛选、分离和纯化后，选育出发酵单位更高、所分泌的甘露聚糖肽含量更高的高产、优质菌株T33株。通过中国科学院微生物研究所对T33菌株及D33菌株的全细胞蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)分析和菌株的基因组DNA限制性酶切分析(RFLP/PFGE)比较，可以证明空间诱变及地面筛选出的T33菌株其基因有变异。该突变菌株在遗传上稳定，有较强的生产适应性，由其发酵产生的甘露聚糖肽含量提高，多肽含量比国家标准(80％)提高3至5倍，西安市药品检验所送样测定达到271.6％，发酵含量比对照组产物含量平均高出三倍以上。该菌种经过神舟系列飞船航天搭载太空诱变，由北京中科院微生物所和西北大学生物系对菌种进一步筛选培养育种形成遗传性质稳定，变异特征明显的高产高效菌种。该菌种每发酵单位中α-太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽含量提高了几倍以上。(见附件材料1：陕西省科学技术厅陕西省科学技术成果鉴定证书材料

附件材料2：太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽生产菌株经“神舟三号”飞船搭载公证书。

附件材料3：太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽生产菌株经“神舟三号”飞船搭载返回地面筛选报告

附件材料4：中国科学院微生物所关于“神舟三号”飞船搭载太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽生产菌株与地面对照菌的形态生理生化鉴定报告书

附件材料5：中国科学院微生物所关于“神舟三号”飞船搭载太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽生产菌株与地面对照菌的SDS-PAGE及RFLP/PFGE分析鉴定报告书

附件材料6：陕西省药品检验所“神舟三号”太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽口服液检测报告

附件材料7：科技查新报告复印件

附件材料8：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏菌种保藏受理通知书)

本发明菌种选育：在α-溶血链球菌生长规律的基础上，选定较合适生长时期的菌种，采用平皿生长的菌落、浸入其它物质中的菌悬液、带菌的砂土等方法，于2002年3月25日搭载“神舟三号”宇宙飞船。在太空轨道(近地点高度200公里、远地点高度350公里)进行了6天零18小时的在轨飞行。太空的特殊条件主要体现为微重力、高真空、高辐射、交变磁场等特殊环境。在外层空间飞行的菌种被置于一个与地球上的生态环境完全不同的环境中，主要包括来自磁场俘获的电子、质子及低能重粒子；来自银河系的宇宙射线如质子、粒子及更重的高能重粒子；来自太阳磁暴的质子及重粒子等。这些粒子作用于微生物细胞核中的DNA双链结构，可导致双链断裂。微重力、高真空环境可使DNA的碱基序列发生重组，即基因组的重组和变异。变异后产生的新菌株，其形态特征、培养特征、生理生化反应、代谢产物、遗传性状及蛋白表达、中试生产指标等均会发生不同程度的变化。在宇宙飞船返回地面后，经过进一步筛选，仅优选出其中0.2％的正变异且遗传特性稳定的菌株，经培育制成生产菌种。这种经航天搭载诱变后选育出的菌种已经在在2003年12月29日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.1082。

实验及中试生产结果表明，经空间诱变后的新型太空菌种在遗传特性上稳定，有较强的生产适应性，由其发酵产生的甘露聚糖肽含量提高，多肽含量比国家标准(80％)提高3至5倍，西安市药品检验所送样测定达到271.6％，发酵含量比对照组产物含量平均高出三倍以上，发酵周期大大缩短。

制备方法：

太空诱变菌种生产甘露聚糖肽的制备过程：

本发明所述的太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽是由以下方法制备：太空菌种制备---一级发酵---二级发酵-----发酵液提纯，最终生产出甘露聚糖肽。

①太空菌种制备：

以经过空间诱变育种精心选育的α-溶血链球菌作为生产菌种。

A.斜面种子培养基：牛肉膏0.5％，酵母膏0.6％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.4％，氯化钠0.5％，琼脂3％，绵羊血8％；pH7.4。

斜面种子培养基灭菌温度121℃，时间30分钟，蒸汽压力0.12Mpa。

启封菌种冷冻管，用无菌肉汤培养基稀释，在无菌条件下接入血斜面，接种后置38℃恒温培养30小时。

B.肉汤种子培养基：牛肉膏0.5％，酵母膏0.6％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.4％，氯化钠0.5％；pH7.4。

肉汤种子培养基灭菌温度121℃，时间30分钟，蒸汽压力0.12Mpa。

将培养好的斜面菌种在无菌条件下按9％接种量，接入肉汤种子培养基内，38℃恒温培养30小时。

②发酵过程：

发酵培养基：牛肉膏0.4％，酵母膏0.5％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.4％，氯化钠0.5％。

发酵培养基灭菌温度121℃，时间30分钟，蒸汽压力0.12Mpa。

A.一级发酵罐：将优良的肉汤菌种在无菌条件下按10％接种量，接入一级种子罐，在29℃恒温培养30小时，罐压不超过0.02Mpa，通气量以能翻动培养液为宜，连续充分搅拌。

B.二级发酵罐：将一级发酵培养液在无菌条件下按20％接种量，接入发酵罐，在29℃恒温培养70小时，罐压不0.02Mpa，灭活放罐。灭活采用加温使发酵液温度达到100℃，保温60分钟，冷却静置。

③提取过程：

a、发酵液进行浓缩，使浓缩液体积与发酵液体积比控制在1∶15-1∶20或酌情而定。

b、发酵液的浓缩液加入80-99％乙醇，体积量比控制在1∶1.5-1∶5.5或酌情而定。充分搅拌静置后，离心去除上清液，沉淀用蒸馏水溶解，调pH5.0，得到溶解液并将溶解液静置。

c、再将溶解液离心去除杂质得到上清液，准确量取清液体积，按上清液体积计算出所需乙醇量，调pH值，将乙醇缓慢加入到上清液中，并充分搅拌，静置后离心去除上清液得到沉淀物。

d、沉淀物再用蒸馏水溶解，调pH，离心，上清液再加乙醇沉淀。这样的工艺反复操作至中间检测合格为止，得到的沉淀物为太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽粗品。真空干燥3-8小时，即得到太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽产品。

上述方法得到的产品的检验：

[性状]本品为白色或微黄色无定形粉末；无臭、无味。

本品在水中易溶，在乙醇、氯仿及丙酮中不溶。

比旋度：取本品，精密称定，加水溶解并稀释成每1ml中约含10mg的溶液，依法测定(中国药典2000年版二部附录vIE)，比旋度为+70℃至+80℃。

[鉴别]1、取本品10mg，加水0.5ml使溶解，加a-萘酚乙醇溶液(5-100)1ml，摇匀，沿管壁缓缓加硫酸0.5ml，数分钟后，界面呈紫红色。

2、取本品，加水制成每1ml中含1mg的溶液，取约10μl点于滤纸上，晾干，用无水乙醇固定，置高硝酸溶液(取高碘酸1.2g，加水30ml溶解后。加0.2mol/L醋酸钠溶液1.5ml与乙醇100ml，混匀即得。置暗处保存，可使用数月)中浸泡5分钟，取出，用70％乙醇溶液冲洗，置还原液(取碘化钾5g，硫代硫酸钠5g，加水100ml使溶解，再加乙醇150ml、2mol/L盐酸液2.5ml，随加随搅拌，临用时配)中浸泡5分钟，取出，用70％乙醇溶液冲洗，置品红业硫酸试液中浸泡约30分钟，取出，用焦亚硫酸钠溶液(取焦亚硫酸钠0.4g，加盐酸1ml，加水溶解使成100ml，即得)，冲洗，晾干，在滤纸片点样处应呈紫红色。

3、取供试品和对照品适量，分别加氯化钠注射液制成每1ml中含1mg的溶液作为供试品溶液和对照品溶液，按甘露聚糖肽免疫原性测定法试验，供试品和对照品管应均无溶血发生。

[检查]1、酸度：取本品，加水制成每1ml中含10mg的溶液，依法测定(中国药典2000年版二部附录VIH)，pH值应为3.0-5.0。

2、吸收度：取本品，加水制成每1ml中含0.4mg的溶液，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录VIA)，在260nm的波长处，其吸收度不得大于0.25，在280mm的波长处，其吸收度不得大于0.20。

3、总氮量：取本品，照氮测定法(中国药典2000年版二部附录VIID第二法)测定。按干燥品计算，含总氮量应为0.8-2.0％。

4、免疫原性：取供试品和对照品适量，分别加氯化钠注射液制成每1ml中含10mg的溶液，再分别用磷酸盐缓冲液制成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256的稀释液作为供试品溶液和对照品溶液，依法检查(附甘露聚糖肽免疫原性测定法)，供试品不溶血管的最低浓度应不得高于对照品相应浓度的一倍以上。

5、干燥失重  取本品，在105℃干燥至恒重，减失重量不得过5.0％(中国药典2000年版二部附录VIIIL)。

6、重金属取本品，在1.0g，依法检查(中国药典2000年版VIIIH)含重金属不得过百万分之二十。

7、异常毒性  取本品，加氯化钠注射液制成每1ml中含0.5mg的溶液，依法检查(中国药典2000年版附录XIC)。按静脉注射法给药，应符合规定(供注射用)。

[含量测定]

1.对照品溶液的制备

精密称取经105℃干燥至恒重的D-甘露糖对照品0.1g置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。摇匀；精密量取5ml，置100ml的量瓶中，加水至刻度，摇匀。每1ml中含甘露糖50ug。

2.供试品溶液备

取本品适量，精密称定，加水溶解制成每1ml中含40ug的溶液。

3.标准曲线的制备

精密称取对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再加3％苯酚溶液1.0ml，摇匀，冲入硫酸4.5ml，摇匀，放置于室温，以0管为空白。照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IVA)在490nm的波长处测定吸收度。以甘露糖ug数对相应的吸收度，计算回归方程。

4.测定法

精密量取供试品溶液1.0ml，照标准曲线制备项下自“再加3％苯酚溶液1.0ml”起，依法操作，测定吸收度，由回归方程计算甘露糖的含量。

甘露聚糖肽免疫原性测定法(补体结合法)；

1、试液

A.酸盐缓冲液(pH7.2)

取氯化钠8.5g、磷酸氢二钠0.565g及磷酸二氢钾0.135g，加水至1000ml使其溶解，加10％硫酸镁溶液1ml，摇匀。

B.1％羊红细胞悬液

羊血红细胞的制备：由绵羊颈静脉无菌采血于盛有等量阿氏液(取葡萄糖20.5g、枸椽酸钠8.0g、氯化钠4.2g，枸椽酸5.5g，加水至1000ml使溶解，100℃灭菌30分钟)的无菌容器中，4℃保存。

1％羊血红细胞悬液的制备：取上述羊血红细胞适量，用氯化钠注射液洗涤三次，每次离心5分钟(2000转/分)，取压积羊血红细胞，用氯化钠注射液制成1％羊血红细胞悬液。取悬液，用氯化钠注射液稀释20倍制成供试品溶液，另取等量悬液加水稀释20倍作为空白溶液，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IVA)，在541nm的波长处测定，其吸收度应为0.65-0.70，如超出限度应调节1％羊红细胞悬液的浓度。

C.溶血素及致敏羊血红细胞

溶血素的制备：取上述压积羊血红细胞，用氯化钠注射液制成25％羊血红细胞悬液。取家兔1只，静脉注射上述羊血红细胞悬液，每日一次，共七次，前三次3ml，后三次5ml，末次注射后七日采血。分离血清，56℃。30分钟灭活，分装，0℃以下保存。

溶血素单位的测定：取溶血素适量，加磷酸盐缓冲液分别制成1∶1000、1∶2000、1∶3000、1∶4000、1∶5000、1∶6000、1∶7000、1∶8000、1∶9000、1∶10000的稀释液，各取0.1ml置试管中，加1％羊血细胞悬液0.1ml，摇匀，加稀释度为1∶30的豚鼠血清(补体)0.2ml及磷酸盐缓冲液0.2ml，摇匀，37℃保温30分钟，完全溶血管的最高稀释度为1单位溶血素。

致敏羊血红细胞的制备：临用前，将2％的羊血红细胞悬液与2单位溶血索等体积混合，37℃保温15分钟即得。

补体：取三只以上的豚鼠，心脏采血，离心分离血清，0℃以下保存。

补体单位的测定：取补体适量，加磷酸盐缓冲液，分别制成1∶40、1∶60、1∶80、1∶100、1∶120、1∶140、1∶160、1∶180的稀释液，各取0.2ml置试管中，加0.2ml磷酸盐缓冲液，摇匀，37℃保温30分钟后，分别加致敏羊血红细胞0.2ml，摇匀，37℃再保温30分钟。完全溶血管的最高稀释度为1单位的补体。

抗体：取甘露聚糖肽对照品适量，加氯化钠注射液制成每1ml中含10mg的对照品溶液免疫家兔，隔日采用耳静脉注射对照品溶液一次。第一次注射0.2ml，第二次至第五次各注射0.5ml，第六次至第十次各注射1.0ml，第十一次至第十五次各注射2.0ml，末次注射后三日采血，离心分离血清，56℃下30分钟灭活，分装，0℃以下保存(临用前，需56℃30分钟再次灭活)。

抗体单位的测定：取抗体适量，加磷酸盐缓冲液分别制成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128的稀释液，各取0.1ml置试管中，加甘露聚糖肽对照品溶液0.1ml及2单位补体0.2ml，摇匀，于4-8℃放置4小时以上，置37℃保温30分钟，不溶血管的最高稀释度为1单位抗体。同时设抗原(不加抗体，以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、抗体(不加抗原，以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、补体(不加抗原，抗体，以0.2ml磷酸盐缓冲液代替)对照管，以上三种对照管应全溶血；另设的致敏羊血红细胞(不加抗原、抗体和补体，以0.4ml磷酸盐缓冲液代替)对照管应不溶血。

2、免疫原性测定法

取甘露骤糖肽对照品与供试品适量，照药品项下的规定制成不同浓度的对照品溶液和供试品溶液，各取0.1ml置试管中，加入2单位抗体0.1ml及2单位补体0.2ml。摇匀，于4-8℃放置4小时以上，置37℃保温30分钟，加入致敏羊血红细胞0.2ml，摇匀，37℃再保温30分钟。观察各管的溶血情况，不溶血管的最低浓度代表甘露聚糖肽的免疫原性。同时设抗原(不加抗体，以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、抗体(不加抗原，以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、补体(不加抗原、抗体、以0.2ml磷酸盐缓冲液代替)对照管，以上三种对照管应全溶血：另设的致敏羊血红细胞(不加抗原、抗体和补体，以0.4ml磷酸盐缓冲液代替)对照管应不溶血。

实施例1：取上述α-甘露聚糖肽100mg，天然花粉50g，人参120g，川芎嗪120g，槐米100g，黄芪150g，何首乌100g，荆芥100g，甘草100g，共10袋量，每袋10g。制备过程：将以上后八味中药浓煎两次，煎液过滤，滤液浓缩至相对密度1.32-1.35(80℃)备用。粉末状天然花粉、α-甘露聚糖肽与浓缩液混匀，加糊精适量，再加乙醇适量，制成颗粒，烘干，质检合格后分装成品。具体生产过成和设备见《中华人民共和国药典2000版一部冲剂的制备工艺》(国家药典委员会编，化学工业出版社出版)

其它实施例与实施例1生产工艺相同，只是药的组分不同。

实施例2的药物组分每1000g中含α-甘露聚糖肽400g、天然花粉150g、灵芝100g、桑叶150g、人参花100g、玫瑰100g。

实施例3的药物组分每1000g中含α-甘露聚糖肽350g、天然花粉50g、灵芝50g、桑叶120g、人参花80g、玫瑰100g、人参30g、五味子20g、当归20g、冬虫夏草20g、绿茶25g、银杏30g、丹参10g、厚朴10g、大枣35g、太子参10g、酸枣仁20g、地黄20g。

实施例4的药物组分每1000g中含α-甘露聚糖肽300g、天然花粉50g、灵芝50g、桑叶50g、人参花50g、玫瑰100g、人参30g、五味子20g、冬虫夏草20g、绿茶25g、银杏30g、丹参10g、厚朴10g、大枣35g、太子参10g、酸枣仁20g、地黄20g、川芎嗪30g、山茱萸30g、当归50g、芦荟60g。

实施例5的药物组分每1000g中含α-甘露聚糖肽200g、天然花粉50g、灵芝50g、桑叶50g、人参花50g、玫瑰50g、人参30g、五味子20g、冬虫夏草20g、绿茶25g、银杏30g、丹参10g、厚朴10g、大枣35g、太子参10g、酸枣仁20g、地黄20g、川芎嗪30g、山茱萸30g、当归50g、芦荟60g、槐米20g、田七10g、川芎10g、桃红20g、黄芩20g、白芷20g、珍珠50g。

实施例6的药物组分每1000g中含α-甘露聚糖肽100g、天然花粉50g、灵芝30g、桑叶20g、人参花30g、玫瑰50g、五味子20g、冬虫夏草20g、绿茶25g、银杏30g、丹参10g、厚朴10g、大枣35g、太子参10g、酸枣仁20g、地黄20g、川芎嗪30g、当归30g、芦荟50g、槐米20g、田七10g、川芎10g、桃红20g、黄芩20g、白芷20g、珍珠50g、人参10g、党参10g、黄芪10g、白术10g、茯苓10g、当归10g、熟地10g、何首乌10g、枸杞子10g、阿胶10g、黄精10g、鸡血藤10g、冬虫草10g、霍山石斛10g、白芍10g、山茱萸20g、桑椹子10g、女贞子10g、旱莲草10g、熟地10g、怀牛膝10g、何首乌10g、菟丝子10g、补骨脂10g、云苓10g。

本发明所述美容养颜冲剂的毒理研究：①急性毒性试验：大鼠腹腔注射5ml∶100g浓缩液，未见有死亡及任何不良反应发生。②亚急性毒性试验：大鼠口服10g/100g/日，连续1个月；家兔口服10g/100g/日，连续1个月，检查肝、肾功能，血象及各脏器组织均无异常变化。③豚鼠过敏试验为阴性。④致畸致死试验均为阴性。

动物药效学研究

[摘要]目的：研究本发明所述五种复方冲剂对体外培养的黑素细胞的抑制作用。方法：采用MTT法测定细胞增殖情况；NaOH裂解法测定黑素合成；Takahashi法测定酪氨酸酶含量。结果：本发明所述五种复方冲剂对黑素细胞的增殖有抑制作用，能使细胞数明显减少(P＜0.05)，并能使黑素合成显著下降(P＜0.01)，使酪氨酸酶活性逐渐减弱(P＜0.01)。结论：本发明所述五种复方冲剂能抑制黑素细胞增殖、黑素合成、酪氨酸酶活性。因此，本发明所述五种复方冲剂具有美容养颜的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 本发明所述五种复方冲剂、α-甘露聚糖肽均由本公司提供，维生素C为市售商品，DMEMF12干粉培养基(美国GBCO公司)，12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯(TPA，美国GBCO公司)，霍乱霉素(CT，Sigma公司)，噻唑蓝(MTT，美国AMERSCO公司)，碱性成纤维细胞因子(bFGF，海南华康生物制品研究所)，左旋多巴(L-DOPA，美国Sigma公司)，753B1微机型紫外线可见光度计(上海)，酶联免疫分析仪(ELASA分析仪，美国)。

1.2 方法

1.2.1 正常人黑素细胞的培养 取包皮环切标本，反复多次冲洗，去除皮下组织，切成1mm×2mm的小条，DispaseII酶4℃冰箱过夜消化。分离表皮，真皮用0.25％胰酶消化，吹打成混浊状，离心后计数，以5×10⁶/ml接种于含DMEMF12培养基的培养瓶中，其成分为10％新生牛血清，氢化可的松0.5μg/ml，胰岛素0.5μg/ml，TPA10μg/ml，CT10 0.5μg/ml，bFGF 10μg/L，CT10μg/L。2-3周后传代备用。

1.2.2 多巴染色 将传代细胞接种于盖玻片上，贴壁48小时后，10％甲醛溶液固定2小时，按DOPA黑素反应法染色，在光镜下可见黑素细胞浆呈灰棕色或黑棕色，证实为黑素细胞。

1.2.3 黑素细胞增殖抑制的测定 取对数生长期细胞，常规消化，调节细胞浓度为5×10⁵/ml，每孔100μl加入96孔板，过夜后分别加入本发明所述的五种不同的复方冲剂(0.1g/L、0.1g/L、0.1g/L、0.1g/L、0.1g/L)α -甘露聚糖肽(0.1mg/L)及维生素C(0.5mg/L)条件培养液，培养48小时后，每孔加入5mg/ml的MTT(10μl)，继续培养3小时弃去上清液，加入二甲基亚砜(DM-SO)150μl，振荡10分钟，采用酶联免疫分析仪在490nm处测吸光值，同期在光镜下观察细胞的形态变化并进行细胞计数。

1.2.4 黑素合成的测定采用Hunt法测定本发明所述的五种复方冲剂对体外培养的黑素细胞黑素合成的影响。取对数生长期的细胞，将细胞浓度调节至2×10⁵/ml，25ml的培养瓶中加入2ml，共8瓶，12小时后随机分组加入不同的条件培养液(同上)，继续培养72小时，弃培养液，0.25％胰酶清化，以1000r/min离心10min，弃上清，加入1mol/L NaOH 100μl至37℃水浴中1小时，双蒸水400μl稀释，在475nm处测吸光值。

1.2.5 酪氨酸酶活性的测定采用Takahashi法测定本发明所述的五种复方冲剂对体外培养的黑素细胞酪氨酸酶活性的影响。细胞接种方法同上。

1.2.6 统计学处理本实验统计数据均以均数±标准差(X±S)表示。组间比较采用成组T检验。

2 结果

2.1 MTT测定结果见表1。

表1各种药物对体外培养的黑素细胞增殖的影响

         组别       10⁵/ml)   药物浓度  细胞数(× 空白对照组本发明所述第一种冲剂组本发明所述第二种冲剂组本发明所述第三种冲剂组本发明所述第四种冲剂组本发明所述第五种冲剂组α-甘露聚糖肽组维生素C组    ——        0.1g/L    0.1g/L    0.1g/L    0.1g/L    0.1g/L    0.1mg/L    0.5g/L    4.2    2.32*    2.07*    1.7**    1.68**    1.50**    3.53    3.01

注：与空白对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01。

表1的实验数据表明：本发明所述的五种复方冲剂均对体外培养的黑素细胞增殖显示出抑制作用倾向，且随着复方冲剂配方的不断全面，这种抑制作用更强。α-甘露聚糖肽和维生素C对体外培养的黑素细胞增殖也显示出一定程度的抑制作用，但效果不显著。由此可见本发明所述的五种复方冲剂对体外培养的黑素细胞增殖的抑制效果显著优于单用α-甘露聚糖肽和维生素C。

2.2 黑素合成测定结果加本发明所述五种复方冲剂的实验组合成黑素的能力均明显下降(P＜0.01)，黑素细胞对本发明所述五种复方冲剂有配方依赖性，随着本发明所述五种复方冲剂配方的全面，黑素合成逐渐下降。α-甘露聚糖肽和维生素C对黑素合成也显示出一定程度的抑制作用，但效果不显著。由此可见本发明所述的五种复方冲剂对黑素合成抑制效果显著优于单用α-甘露聚糖肽和维生素C。

2.3酪氨酸酶活性的测定结果加本发明所述五种复方冲剂的实验组酪氨酸酶的活性均明显下降(P＜0.01)，酪氨酸酶的活性对本发明所述五种复方冲剂有配方依赖性，随着本发明所述五种复方冲剂配方的全面，酪氨酸酶的活性逐渐下降。α-甘露聚糖肽和维生素C对酪氨酸酶的活性也显示出一定程度的抑制作用，但效果不显著。由此可见本发明所述的五种复方冲剂对酪氨酸酶的活性抑制效果显著优于单用α-甘露聚糖肽和维生素C。

本发明所述美容养颜冲剂疗效的验证：李某，女，32岁，3年前因妊娠脸部出现片状黄褐色斑，3年来一直使用各种去斑产品，但效果不佳。服用本发明冲剂10天(一个疗程)，面部色斑颜色变淡且自觉身体各方面机能较以前为好。再服用1个疗程面部色斑颜色由褐变黄到现在为淡黄，统计三处色斑直径分别从3cm缩小到2.1cm，2.3cm缩小到1cm，1.2cm缩小到0.7cm，并且面部红润，皮肤光滑柔软，富有弹性，头发色泽鲜亮柔顺，睡眠质量高，精神状态好。继续跟踪4个疗程后，面部色斑完全消失，皮肤红润白嫩，半年无复发。

本发明所述美容养颜冲剂大规模人群疗效统计：本发明所述美容养颜冲剂内服治疗了368例非遗传性色素增多症患者，取得较好疗效，报道如下：共368例参加试验者，男110例，女258例，男女之比为1∶2.4；年龄14岁以下30例，15-20岁60例，21-30岁101例，31-40岁99例，41-50岁50例，51岁以上28例，以15-40岁者最多。对这些患者进行病因分析，过敏62例，化妆品刺激58例，月经紊乱48例，沥青或煤焦油或煤气接触46例，口服避孕药29例，妊娠25例，绝经期内分泌紊乱24例，外用药、热刺激各20例，其它(包括维生素缺乏、过敏原、粉尘等)共56例。疗效标准：观察以日计，测定色素形状、大小、色泽以及周围皮肤白嫩、红润等转变，判断分4级。即治愈：色素斑完全消失，观察半年不复发，所伴有症状消失；显效：色素斑消失50％以上，观察半年无色素再增加现象，伴有症状消失；有效：色素斑消失在50％以下，或色素斑块颜色变淡，周围皮肤转白嫩或红润：无效：治疗前后色素沉着无好转变化。治疗两个疗程后，治愈51例，显效73例，有效108例，无效136例，总有效率为63.0％；治疗四个疗程后，治愈196例，显效24例，有效63例，无效85例，总有效率为76.9％。