农杆菌介导大豆胚尖再生系统的高效遗传转化方法

摘要

本发明公开了高效的农杆菌介导转化的系统和产生遗传转化的豆科植物的方法。该方法包括步骤：(a)将豆科植物胚尖与根瘤农杆菌在28±2℃接触0.5－30小时；(b)选出携带标记基因的豆科植物胚尖、其组织、或细胞；(c)将步骤(b)所述的豆科植物胚尖、其组织、或细胞再生成植株。本发明方法可低成本、简便地、快速地获得高的转化率，用于大豆基因工程的基本操作系统，将使周期大大缩减，转化率有所提高，取材也更加方便。

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域。更具体地涉及在大豆基因工程中，通过农杆菌介导、利用大豆胚尖再生系统进行高效遗传转化方法。

背景技术

大豆是一种重要的油料和蛋白作物。大豆的遗传转化一直是植物基因工程领域的难点之一，自Hinchee和McCabe分别用两种不同方法转化大豆成功得到转基因植株以来，虽然也相继有关于此方面的报道，但是一直没有突破性的进展。具体来说，最重要的一点就是转化率没有显著提高。

目前应用于大豆遗传转化的方法主要有根癌农杆菌介导法，基因枪法，超声辅助农杆菌法，真空抽滤法，花粉管导入法等，但其中获得广泛应用的只有根癌农杆菌介导法和基因枪法。即使这两种方法在应用中也有一定的局限性。如何真正实现大豆的高效转化仍然是大家所面临的主要问题。

根癌农杆菌介导遗传转化法是利用根癌农杆菌对植物的侵染特性从而把外源基因导入植物基因组的方法。因其低拷贝，整合完整，遗传稳定以及受目的基因分子量限制小而广泛应用于植物的遗传转化，其对植物的侵染机理也是当前研究的热点之一。

双子叶植物虽然是农杆菌的天然宿主，但直到1983年才由Pederson证明了大豆可作为农杆菌的合适宿主。而农杆菌成功转化大豆的首例报道也是由Hinchee等在1988年所报道的。他们从100多个品种中筛选出对农杆菌反应最佳的Peking(这也是以后经常被采用的品种)，以子叶为受体材料，gus为报告基因，筛选基因为nptII，经过后期的抗生素筛选得到转基因植株，转化率为6％，后期分离实验也证明了外源片段在转基因植株中是单拷贝整合。这个实验直接证明了农杆菌可介导大豆的遗传转化。

之后的农杆菌转化大豆方面的报道大多以Hinchee的工作为基础。Twonsand和Thomas用相似的方法得到了品种Pioneer9341的转基因植株，其成功的主要因素有四点：

1、乙酰丁香酮的使用，因为其可诱导农杆菌Vir基因的活化，促进外源DNA与植物基因组的整合；

2、培养温度18-28℃；

3、菌液浓度在10⁸～3×10⁹个/ml；

4、再生培养基中添加了焦谷氨酸。

Di等把BPMV(Bean Pool Mottle Virus)衣蛋白通过农杆菌介导法转入大豆，400个子叶节中仅有5个被成功转化。

Meurer等摸索了农杆菌转化大豆子叶节的影响因素，发现用超声处理过的子叶节较对照容易转化，而且农杆菌菌株KYRT1的转化效果明显优于EHA105和LBA4404。

Zhang等以Bar基因作为筛选基因，农杆菌法转化大豆子叶节频率达3％。

Donaldson等用农杆菌转化12个短季大豆品种子叶节，感染率可达92％，但仅从品种Accolibri得到了遗传稳定的转基因植株，且转化率极低。

由以上报道可看出，农杆菌转化法采用的受体材料大多为子叶节，这一系统由Cheng等用无菌苗子叶节首次报道成功再生植株。这个系统相对于其他不定芽和体细胞系统有其特有优点：(a)3个月内可形成生根的植株；(b)不可育的再生植株少；(c)外植体来源广，不受时间限制。但由此系统获得的植株嵌合体多，后期筛选工作量较大。

另外，Chee等曾经用水浸24小时的种子，去掉一片子叶，然后用农杆菌进行转化，得到了转基因植株，R₀代转化率为0.07％，R₁代又有10％产生了转化的种子。这种方法虽然简洁，但转化率太低，而且以后也未见相关报道。

还有一种超声辅助的农杆菌转化法(Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation，SAAT)，采用的靶组织为胚性悬浮系、未成熟子叶，子叶节等，扫描电镜下可发现超声处理过的受体材料表面可形成许多小孔，使农杆菌穿越表层细胞进入深层更加容易，可显著提高转化效率。这种方法使得农杆菌转化法的受体材料范围扩大。

基因枪法又称为微弹轰击法，采用被DNA包被的金属微粒(金或钨)被加速穿过植物细胞的细胞壁和细胞膜，然后DNA可以从金属微粒上脱离并随机整合进植物基因组中。相对于农杆菌方法而言，基因枪法受受体材料的影响较小，且转化效率相对高，且操作简便，可控度高。但亦有其自身缺点，如转移DNA分子量一般不高于10kb，在植物基因组中拷贝数高，易引起基因沉默等。

McCabe于1988年首次报道了利用基因枪法成功转化大豆芽分生组织获得转基因植株，但都是嵌合体，此后的报道采用此系统通过挑选含有被转化细胞的植株进行后期筛选，获得了非嵌合的转基因植株。

最近，等采用了一种新的筛选系统，通过基因枪法转化成熟种子浸泡24小时后的茎尖，直接获得了再生的非嵌合转基因植株。在这一系统中，其筛选基因为ahas基因，该基因是从拟南芥中分离，在653bp附近有一突变，编码的产物能引起植株对咪唑酮类除草剂分子，能特异分布在植物的分生区，抑制乙酰羟酸合成酶(acetohydroxy acid synthase)的活性，而该酶是植物合成异亮氨酸，亮氨酸和缬氨酸所必须的。所以非转化的细胞均不能生长，分裂。使用该系统转化率可达20.1％，且均为非嵌合体，后期分离试验表明外源基因稳定的整合进了植物基因组中。这是迄今看来应用于大豆转化最好的系统。

由于基因枪法不象农杆菌法那样受靶组织的限制，其应用于其他靶组织的报道也随后出现。McMullen首次报道用基因枪法转化体细胞胚性细胞团并获得了转基因植株，以后这一系统得以快速发展，成为大多数实验室采用的手段。然而，基因枪法容易在转基因植株基因组中产生多个拷贝数，从而进一步导致转基因沉默的现象，而且需要购置价格较昂贵的相关设备，所以目前本领域技术人员仍优选采用农杆菌介导法转化大豆等植物。

大豆体细胞胚再生系统首次获得再生植株是由Christianson在1983年报道的。其采用的外植体为胚轴，此后的报道采用的外植体大多为未成熟子叶和完整幼胚。但真正能应用于转化的是Finer等所建立的系统，把未成熟子叶放在含40mg/L 2，4-D的MS培养基上诱导出体胚，胚性组织在继代培养过程中可在诱导培养基或含低水平2，4-D的液体悬浮培养基上增殖。组织学分析表明，新生胚分布在旧胚表面，易于进行转化，而且可在液体培养基中进行筛选，这样由于筛选介质与可增殖胚的高面积接触而使筛选变得高效，从而可以克服嵌合体的问题。此后许多实验室都采用这一系统获得了非嵌合的转基因植株。其中Stewart于1996年报道了其把Bt基因导入大豆并获得了抗虫害的转基因植株。

除了根瘤农杆菌介导法和基因枪法之外，还有一些其他转化方法。例如，Wei和Xu首次报道大豆的原生质体再生系统，黄健秋等利用此系统采用改良PEG法，以带gus基因的pBI121质粒转化大豆未成熟子叶原生质体，转化率1％～3％(有GUS稳定表达的愈伤组织的百分比)，但没有得到转基因植株。Chowrira在含有lipofectin的溶液中把DNA注射入7～10天的苗的顶芽，然后在环形电极中电击转化，在无筛选条件下获得转基因种子。

发明内容

本发明的目的就是提供一种成本低、简便、高效地转化大豆的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种产生遗传转化的豆科植物的方法，包括以下步骤：

(a)将豆科植物胚尖与根瘤农杆菌在28±2℃接触0.5-30小时，所述的根瘤农杆菌含有携带外源基因和标记基因的载体，从而使外源基因和标记基因整合入豆科植物胚尖细胞的基因组中；

(b)选出携带标记基因的豆科植物胚尖、其组织、或细胞；

(c)将步骤(b)所述的豆科植物胚尖、其组织、或细胞再生成植株。

在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：

(d)对再生的植株检测其标记基因是否存在。

在另一优选例中，所述的豆科植物胚尖是用以下方法制备的：将豆科植物种子在28±5℃下，于无菌水中浸泡24±12小时，然后从萌动种子中取出胚尖。

在另一优选例中，所述的胚尖带有胚轴。

在另一优选例中，所述的标记基因是gus基因。

在另一优选例中，所述的胚尖是经过以下预培养处理的胚尖：在含2.5-4.5mg/L BAP的MSB5培养基上，在温度23～28℃，光照30±10μEm^-2s^-1，预培养12-36h。

在另一优选例中，所述的豆科植物选自下组：大豆、花生。

在另一优选例中，步骤(a)中的接触时间是6-26小时。

在本发明的第二方面，提供了一种改进的农杆菌介导的产生转基因大豆植株的方法，其改进之处在于将大豆胚尖用作被农杆菌感染的材料。

在本发明的第三方面，提供了豆科植物胚尖的用途，用作农杆菌介导的产生转基因植株的感染材料。

附图说明

图1显示了胚尖的再生及其在根瘤农杆菌(A.tumefaciens)介导的大豆转化中的应用。其中，

(a)是在补充有3.5mg/l BAP的MSB5培养基中培养了16小时的胚尖；

(b)是在补充有0.2mg/l BAP和0.2mg/l IBA的MSB5培养基中培养了2天的胚尖；

(c)是在补充有0.2mg/l BAP和0.2mg/l IBA的MSB5培养基中培养了12天的胚尖；

(d)一个胚尖可以再生出六个芽；

(e)经过生根之后，再生植株可以正常生长；

(f)胚尖和农杆菌共培养两天后gus基因的瞬间表达情况分析；

(g)胚尖恢复培养基恢复培养5天并在选择培养基上生长1周后gus基因的稳定表达分析。右为没有感染过的胚尖作为对照；

(h)胚尖恢复培养基恢复培养5天并在选择培养基上生长1周后去除表皮后gus基因的稳定表达分析；

(i)纵切胚尖后gus基因稳定表达分析，右为非感染的对照；

(j)横切胚尖后gus基因稳定表达分析，右为非感染的对照；

(k)转基因苗在卡那霉素浓度为100mg/L培养基上生长并伸长；

(l)转基因苗在生根培养基上顺利生根；

(m)T₀代转基因植株叶片的GUS染色分析，右为非转基因大豆叶片作为对照；

(m)T₀代转基因植株成熟照片，右为非转基因大豆。

图2显示了T₀代植株的Southern印迹分析结果。泳道A：总基因组DNA用HindIII完全消化，然后用α³²P-标记的gus探针进行杂交。泳道1、3、4、5分别代表转基因株系1，3，4，5。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究发现，大豆的胚尖是一种特别适合遗传转化的材料。用胚尖为材料，通过对感染时间等参数的优化，可以获得非常高的遗传转化效率。在此基础上完成了本发明。

本发明是在现有的农杆菌介导的植物转基因方法进行的改进发明，即在感染步骤中，将豆科植物(如大豆)的胚尖用作农杆菌感染的植物材料，并对用农杆菌感染胚尖的具体条件进行了优化。至于其他步骤，例如将感染后的植物细胞或组织再生成植株的过程，与现有技术没有区别。这些步骤在众多文献中有描述，例如Trick HN，Dinkins RD等1997 Recent advances in soybeantransformation，Plant Tissue Cult Biotechnol 3：9-26和Olhoft PM，Somers DA2001 L-Cysteine increases Agrobacterium-mediated T-DNA delivery into soybeancotyledonary-node cells.Plant Cell Rep 20：706-711等文献。

如本文所用，“豆科植物”指植物分类上属于豆科的植物。适用于本发明豆科植物没有特别限制，代表性的豆科植物包括(但并不限于)：大豆、花生。

以大豆为例，本发明方法通常包括以下步骤：

(1)获得大豆胚尖

通常，将大豆种子经灭菌消毒后，将豆科植物种子在适合发芽的温度(如28±5℃)下，于无菌水中浸泡一段时间(如24±12小时，较佳地24±6小时)，然后从萌动种子中取出胚尖。

此外，在优选例中，为了进一步提高T-DNA转移效率，可以对胚尖进行预处理，例如在含2.5-4.5mg/L BAP的MSB5培养基上，在温度23～28℃，光照30±10μEm^-2s^-1，预培养12-36h。

(2)农杆菌对大豆胚尖的浸染

将用常规方法制备的根瘤农杆菌(所述的根瘤农杆菌含有携带外源基因和标记基因的载体)，与大豆胚尖在适合感染的条件(如28±2℃)下接触一段时间(如0.5-30小时，较佳地1-28小时，更佳地6-26小时)，从而使外源基因和标记基因整合入豆科植物胚尖细胞的基因组中。

在一优选例中，具体的反应条件是将含有双元载体pCAMBIA2301的根癌土壤农杆菌菌株EHA105在培养基上培养至OD₆₀₀＝1.3，菌体经过离心后用培养胚尖的液体培养基重悬。然后，胚尖放入重悬过的菌液中在28℃摇床上培养20小时。

(3)再生成植株

将浸染的胚尖再生成植株的过程没有特别限制，可用本领域常规方法。

例如，对于外植体的共培养、恢复培养和筛选步骤而言，一种优选方法是例如，可将感染后的胚尖用无菌滤纸吸干后转接于共培养培养基(pH5.8)，25℃暗培养5天。转接于无筛选剂的恢复培养基上恢复5-7天，然后转到筛选培养基上培养，等待抗性芽长出(当标记基因是抗性基因时)。

对于抗性芽的生根及移栽而言，一种优选方法是等抗性芽长至3-5厘米将其切下转至生根培养基，跟长的足够壮时移栽到土壤中在人工气候室生长结实。

此外，根据标记基因的不同，可以选用本领域中合适的鉴定方法，例如当标记基因是gus基因时，可进行GUS染色分析。一种方法是取共培养2天的胚尖，在恢复培养基上生长5天的胚尖，在筛选培养基上生长一周的胚尖，在人工生长的卡那抗性大豆叶片，分别浸泡在X-Gluc溶液中染色，

此外，再生植株进行分子鉴定时，可取移栽的苗叶片提取总DNA，分别对GUS基因进行PCR鉴定，PCR阳性植株的叶片进行GUS染色和Southern杂交分析。

本发明的主要优点在于：

(a)转化率高；

(b)取材方便；

(c)周期大大缩短；

(d)操作简单，无需添加过多附加物；

(e)成本低；

(f)无需特殊筛选剂。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)和《植物组织培养手册》(上海科学技术出版社，1990年出版)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

大豆胚尖高效再生体系的建立

大豆(Glycine max L)品种包括合丰35，合丰39，东农42，东农163，东农211，绥农10，绥农14，绥农16，黑农37，黑农40，汾45，汾50，晋遗19。这些品种都是市场上可购得的，例如可购自黑龙江种子公司。

取表面光滑无杂色斑的大豆成熟种子，放入含有由30％NaClO(次氯酸钠)+20％HCl反应生成的氯气的密闭容器中，2-6小时后取出放至无菌水中28℃浸泡24h。然后把萌动种子的子叶去除，取带胚轴的胚尖，分别接种至含有不同6-苯甲基氨基嘌呤(BAP)浓度的培养基(采用常规的MS基本培养基的无机盐类浓度(Murashige T，Skoog F 1962 A revised medium for rapid growth and bioassayswith tobacco tissue cultures，Physiol Plant 15：473-497)，并均附加常规的B₅培养基的有机元素成分(Gamborg OL，Miller RA，Ojiama K 1968 Nutrientrequirements of suspension cultures of soybean root cells，Exp Cell Res 50：151-158))，pH5.6-7.0，蔗糖30g/L，固体培养基加0.6％琼脂，培养条件：温度23～28℃，光照30μEm^-2s^-1。光照16h。24小时后转至相同基本培养基但BAP和吲哚-3-丁酸(IBA)浓度均为0.2mg/L的培养基上，4周后统计每个外植体上的芽数。

结果如表1所示，证明BAP 3.5mg/L是最佳浓度。

      表1 BAP浓度对大豆胚尖再生芽的影响(培养时间为24h)

  培养基BAP浓度(mg/L)            胚尖再生芽数(芽数/茎尖)

            1.0                        1.5

            2.0                        2.6

            2.5                        3.4

            3.0                        4.8

            3.5                        5.4

            4.0                        3.5

            5.0                        2.1

实施例2

农杆菌对大豆胚尖的浸染

挑取含有双元载体pCAMBIA2301农杆菌EHA105(购自Cambia公司)单菌落接种于卡那霉素100mg/L浓度的5ml YEP液体培养基，28℃摇床培养过夜，然后菌液转至50ml YEP卡那霉素100mg/L培养基中摇至OD₆₀₀＝1.3，菌体于3000rpm离心10分钟后重悬于1/2MSB5液体培养基附加6mg/l BAP和100μM乙酰丁香酮，OD₆₀₀调整至0.5。在MSB5培养基(BAP＝3.5mg/L)上培养24小时的胚尖在上述培养基中28℃按表2培养时间培养，然后转到共培养培养基上，通过后来实验感染时间对T-DNA转移进入大豆胚尖的影响。

结果如表2所示，表明0.5-30小时的感染时间都可获得较有效的T-DNA转移效率，其中20小时的培养时间能获得最大的T-DNA的转移效率78.2％。

        表2感染时间对T-DNA转移进入大豆胚尖的影响

实验编号 感染时间 感染的胚尖 回收的卡那霉素抗 表达gus基因的  T-DNA转移

            (h)      数目       性外植体数目    外植体数目   效率^a(％)

    1        0.1      25             4              3           12.0

    2        0.2      24             7              4           16.7

    3        0.5      26             10             6           23.1

    4        1.5      30             13             11          36.7

    5        6        28             17             15          53.6

    6        12       23             15             14          60.8

    7        20       23             19             18          78.2

    8        26       26             12             11          42.3

    9        30       24             10             10          41.7

^aT-DNA转移效率＝(表达gus基因的外植体数目/感染的胚尖数目)×100

实施例3

外植体的共培养、恢复培养和筛选

感染后的胚尖在无菌滤纸上把菌液吸干后转移到共培养培养基上(1/2MSB5(pH5.8)，0.6％琼脂糖，6mg/l BAP，100μM乙酰丁香酮)，暗培养5天，用无菌水洗净后转移到恢复培养基上(1/2MSB5，0.6％琼脂糖，0.2mg/LBAP，0.2mg/l IBA，300mg/L头孢霉素)上光下培养5-7天。培养条件：温度25～28℃，光照30μEm^-2s^-1。培养温度23～27℃，光照16h。恢复培养后把胚尖转移到筛选培养基上培养(1/2MSB5，0.2mg/L BAP，0.2mg/l IBA，300mg/L头孢霉素，300mg/L羧苄青霉素，100mg/L卡那霉素)，每10天继代一次。

结果如图1中f，g，h，i，j所示。

显微镜下观察，发现gus基因瞬间表达在根尖和胚尖的分生区表达强烈，稳定表达分析表明转基因苗可以从胚尖区域再生出来，T-DNA向外植体的转移频率达到78.2％。参照图1。

实施例4

抗性芽的生根及移栽

等抗性芽长至3-5厘米将其切下转至生根培养基(1/2MSB5，0.2mg/L BAP，1.0mg/l IBA，300mg/L头孢霉素，300mg/L羧苄青霉素，25mg/L卡那霉素)，根长的足够壮时移栽到土壤中在人工气候室生长结实。

结果如图1中n所示。

实施例5

GUS染色分析

取共培养2天的胚尖，在恢复培养基上生长5天的胚尖，在筛选培养基上生长一周的胚尖，在人工生长的卡那抗性大豆叶片，分别浸泡在X-Gluc溶液(含EDTA 10mmol/L，磷酸钠缓冲液100mmol/L，亚铁氰化钾0.5mmol/L，高铁氰化钾0.5mmol/L，20％甲醇(V/V)和0.1％X-Gluc)中，37℃数小时后观查。

结果如图1中m所示。

实施例6

抗性芽的分子鉴定

取人工气候室生长的卡那抗性大豆叶片，DNA的提取按照常规的冷酚法进行，方法如下：用液氮研磨材料至粉状，加6mL提取缓冲液(1M Tris-HCl(pH9.0)，50mM EDTA，1％SDS)，混匀，再加入等体积的水饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，于冰上静置1小时，每隔10分钟摇匀一次。12000rpm4℃离心10分钟，取上清，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇，冰上静置5分钟；继续用酚∶氯仿∶异戊醇，直至有机相与水相之间没有蛋白为止。加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，12000rpm 4℃离心10分钟，取上清，加0.5倍体积的高盐溶液(0.8M柠檬酸钠，1.2M NaCl)和0.5倍体积的异丙醇，混匀，置-70℃ 30分钟。12000rpm 4℃离心10分钟去上清，沉淀溶于100μLddH₂O中，用RNAaseA处理，再用酚∶氯仿∶异戊醇抽提、乙醇沉淀后即得到很纯的基因组DNA，溶于100μLddH₂O，跑电泳并测定OD₂₆₀/OD₂₈₀值，确定总DNA的质量和浓度；加2.5倍体积的无水乙醇，保存于-70℃，用时沉淀取适量用于PCR鉴定或进行酶切作Southern杂交。

PCR鉴定

两个引物分别为(CGACGGCCTGTGGGCATTCA和TGGTCGTGCACCATCAGCAC)。

PCR反应体系：MgCl₂(10×)3μl，PCR反应缓冲液(10×)3μl，dNTPs(各2.5μM)3μl，E61(25μM)0.5μl，E62(25μM)0.5μl，模板(0.1μg/μl)1μl，牛血清白蛋白(10mg/ml)0.3μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.3μl，最后加水至30μl。

PCR反应条件：94℃预变性10分钟；然后94℃变性40秒，54℃复性30秒，延伸30秒，共30个循环；最后，72℃延伸7分钟。

Southern印迹分析

(a)基因组DNA的酶切、电泳和转膜

每样品取40μg DNA分别用Hind III，待DNA完全酶切后，0.8％琼脂糖凝胶电泳，切去多余的凝胶，0.25 M HCl浸泡20min，水洗，加入变性液(1.5 M NaCl，0.5M NaOH)，于室温轻摇变性45min，短暂水洗，加入中和液(1.5 M NaCl，0.5 MTris-HCl，pH7.0)室温中和30min。以20×SSC为转移液，用毛细管吸印法转膜12-16小时，将DNA转移到Hybond-XL膜上，用铅笔标记上样孔位置，6×SSC短暂漂洗，80℃烘烤固定2小时，备用。

(b)探针标记：

PCR(CGACGGCCTGTGGGCATTCA和TGGTCGTGCACCATCAGCAC)经电泳、割胶纯化后，取25ng的PCR产物作为模板标记探针。探针的标记使用Prime-a-Gene Labeling System(Promega)，标记体系为50μL(掺入α-³²P-dCTP)，37℃温浴1小时。标记的探针以QIAquick Nucleotide Removal Kit(Takara公司)纯化。

(c)预杂交和杂交

将转有总DNA尼龙膜，浸入10mL预杂交液中，在杂交炉中42℃预杂交2-4h。将变性后的探针，全部加入上述预杂交液中，42℃杂交24h。

预杂交液：50％(W/V)甲酰胺，5×SSC，5×Denhardt试剂，1％(W/V)SDS，100μg/ml变性的鱼精DNA。

(d)洗膜与压片

杂交结束后，倒出杂交液。按照以下程序洗膜：

1)2×SSC，0.1％SDS室温洗涤两次，每次5min。

2)0.2×SSC，0.1％SDS室温洗涤两次，每次5min

3)0.2×SSC，0.1％SDS 42℃洗涤两次，每次15min。

4)2×SSC，室温短暂漂洗。

将膜置于纸巾上，以除去大部分液体。将膜用保鲜膜包裹，平整压于X光片下，附加增感屏，-70℃曝光合适的时间。按照常规方法冲洗X光片。

(e)从尼龙膜上除去探针

将五百毫升0.05×SSC/0.01 M EDTA加热至沸腾，丛加热器上移开该液体，并加入SDS至终浓度为0.1％，将膜浸泡于其中15分钟。重复上述步骤。用0.1×SSC于室温短暂漂洗膜，将其置于一叠纸巾上，以除去膜上大部分液体。将膜夹于两张保鲜膜之间，压在X光片下，检查是否所有探针均被除去。将膜晾干，用铝箔宽松包起，于室温存放待用。

结果如图2所示，外源基因已经整合进大豆基因组中。

对各种大豆品系的实验结果汇总于表3(其中，感染时间为20小时)。

                    表3 根瘤农杆菌介导的大豆转化效率

实验      品系     感染的胚 回收的卡那霉素 再生成PCR阳性植 转移效率^a

编号                尖数目  抗性外植体数目 株的外植体数目    (％)

  1     Hefeng 35     55          42             5

  2     Hefeng 35     43          37             4

  3     Hefeng 35     39          32             4

合计                  137         111            13          11.7

  4     Dongnong 42   32          28             2

  5     Dongnong 42   29          26             3

  6     Dongnong 42   65          59             4

合计                  126         113            9           8.0

  7     Hefeng 39     35          33             3

  8     Hefeng 39     34          30             6

  9     Hefeng 39     40          38             7

合计                  109         101            16          15.8

^a转移效率＝(再生成PCR阳性植株的外植体数目/感染的外植体数目)×100

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。