新的5－羟基氨基甲酰亚氨基－2－羟基苯磺酰胺衍生物晶体

摘要

本发明提供了新的盐酸n－丁基[4－[2－[2－羟基－5－(N－羟基氨基甲酰亚氨基)苯磺酰氨基]乙基]－2’－甲基磺酰联苯－3－基氧代]乙酸酯晶体形式，包含该物质的药物组合物及其应用，显示出优秀的对活化凝血因子X的抑制活性，可用于治疗或预防血栓栓塞疾病。

说明书

技术领域

本发明涉及新的盐酸n-丁基[4-[2-[2-羟基-5-(N-羟基氨基甲酰亚氨基)苯磺酰氨基]乙基]-2’-甲基磺酰联苯-3-基氧代]乙酸酯(n-Butyl[4-[2-[2-hydroxy-5-(N-hydroxycarbamimidoyl)benzenesulfonylamino]ethyl]-2’-methanesulfonyl-biphenyl-3-yloxy]acetate hydrochloride)晶体及其应用。

背景技术 

本申请中发现的是由化学式(I)

表示的新型化合物-盐酸n-丁基[4-[2-[2-羟基-5-(N-羟基氨基甲酰亚氨基)苯磺酰氨基]乙基]-2’-甲基磺酰联苯-3-基氧代]乙酸酯。该化合物对活化的凝血因子X显示出极好的抑制活性，并可被用于治疗或预防血栓栓塞疾病。至今未发现该化合物的晶体多态性。

发明概述

按日本专利申请2000-305569中公开的方法制备的化合物(I)的晶体(下文称为“晶体形式A”)，在稳定性上不佳，当储存时间较长时，会有严重问题减少活性成分的含量。而且，晶体形式A在大规模生产时过滤率低在操作特性上不佳，不适合商业化生产。本发明的发明人详细研究了盐酸n-丁基[4-[2-[2-羟基-5-(N-羟基氨基甲酰亚氨基)苯磺酰氨基]乙基]-2’-甲基磺酰联苯-3-基氧代]乙酸酯晶体的稳定性佳，适合商业化生产，并发现化合物(I)在晶体形式A以外有两个晶体形式，“晶体形式B”和“化合物(I)的晶体一水合物”。其中，化合物(I)的晶体一水合物由于水溶性较低难于制备药学制剂。相反，本发明的发明人发现晶体形式B的水溶性高，有好的口服生物利用度。而且，晶体形式B的储藏稳定性好，过滤率高，适合商业化生产。基于这些发现，完成本发明。

因此本发明提供：

(1)盐酸n-丁基[4-[2-[2-羟基-5-(N-羟基氨基甲酰亚氨基)苯磺酰氨基]乙基]-2’-甲基磺酰联苯-3-基氧代]乙酸酯晶体，其X射线粉末衍射图在5.4，8.6，9.1，12.1，16.7，17.3和21.0度的衍射角(2θ±0.1度)有特征峰(下文中称为“晶体形式B”)；

(2)药物组合物，它含有上述(1)所述的晶体作为活性成分；

(3)如上述(2)所述的用于治疗或预防血栓栓塞疾病的药物组合物；

(4)如上述(1)所述的晶体在制造用于治疗或预防血栓栓塞疾病的药物中的应用；

(5)一种治疗血栓栓塞疾病的方法，包括施用治疗有效量的上述(1)的晶体。

附图简述

图1是在实施例1中获得的盐酸n-丁基[4-[2-[2-羟基-5-(N-羟基氨基甲酰亚氨基)苯磺酰氨基]乙基]-2’-甲基磺酰联苯-3-基氧代]乙酸酯晶体形式B的X射线粉末衍射图，其中纵坐标为X射线强度cps；横坐标为衍射角2θ。

图2是在参考例2中获得的盐酸n-丁基[4-[2-[2-羟基-5-(N-羟基氨基甲酰亚氨基)苯磺酰氨基]乙基]-2’-甲基磺酰联苯-3-基氧代]乙酸酯晶体一水合物的X射线粉末衍射图，其中纵坐标为X射线强度cps；横坐标为衍射角2θ。

图3是在参考例1中获得的盐酸n-丁基[4-[2-[2-羟基-5-(N-羟基氨基甲酰亚氨基)苯磺酰氨基]乙基]-2’甲基磺酰联苯-3-基氧代]乙酸酯晶体形式A的X射线粉末衍射图，其中纵坐标为X射线强度cps；横坐标为衍射角2θ。

实施本发明的最佳方式

本发明的晶体形式B按下文内容制备。

化学式(I)代表的化合物的任意晶体形式在加热下与丁醇溶解，其量的范围在约4到约10份重量，在1份重量的化合物(I)基础上的约4到约7份重量较佳。此后，如果需要，把化学物(I)在其中溶解较差的溶剂加入上述产生的溶液，温度在约20℃到约50℃，该混合物可维持不变或在约0℃到约30℃中搅拌约3到约24小时以提供本发明的晶体形式B。较差的溶剂的例子包括乙酸乙酯、丙酮、甲基乙基酮、二乙醚、叔丁基甲醚、1，2-二甲氧基乙烷、四氢呋喃、甲苯、二甲苯、氯苯、乙睛等等，它们可以单独使用或与一种或多种溶剂组成混合物使用。较差的溶剂的量取决于较差的溶剂的类型而变化，通常范围在在1份重量的丁醇基础上的约0.5到约2份重量。

获得的晶体形式B可以通过其在如图1中X射线粉末衍射图表中所示的5.4，8.6，9.1，12.1，16.7，17.3和21.0度的衍射角(2θ±0.1度)有特征峰确定。

本发明的晶体形式B可在普通储存条件如25℃/60％相对湿度等等条件下长时间储存而不改变其晶体形式，可按照传统方法制备成粉剂、颗粒、片剂、胶囊、注射剂等等。

在使用包含本发明晶体作为活性成分的药物组合物的情况中，各种剂量形式取决于它们的使用。剂量形式的例子包括可口服或胃肠外施用的粉剂、颗粒、精细颗粒、干糖浆、片剂、胶囊、注射剂、液体、药膏、栓剂、膏药等等。

药物组合物的制备可通过混合、稀释或溶解于合适的药学添加剂如赋形剂、分解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等张制剂、防腐剂、湿润制剂、乳化制剂、分散剂、稳定剂、增溶剂等等，按照取决于它们剂量形式的传统制备步骤进行。

在使用药物组合物作为医学治疗的情况中，作为活性成分的本发明的晶体的剂量按照个体患者的年龄、性别或体重，疾病的严重程度，治疗的情况等等进行适当的确定。口服施用的典型剂量的范围在每天每个成年人约1mg到约500mg。该剂量可单独施用或分开施用，例如每天数次。

实施例

下列实施例、参考例和试验实施例进一步仔细阐明本发明。但是，应当理解这些实施例并不被解释为对发明范围的任何限制。

每个晶体形式的X射线粉末衍射图是通过X射线衍射分析仪获得的。在40kV/40mA操作RINT2100(Rigaku)和使用Cukα射线。使用热重分析/微分热量分析仪(TG/DTA，Rigaku：Thermo plus TG8120)以10℃/分钟的加热速度测量确定每个晶体形式的熔点。每个晶体形式的熔点被显示为推断启动温度。

参考例1

盐酸n-丁基[4-[2-[2-羟基-5-(N-羟基氨基甲酰亚氨基)苯磺酰氨基]乙基]-2’-甲基磺酰联苯-3-基氧代]乙酸酯的晶体形式A

(步骤1)

7-羟基croman-2-one(7-hydroxycroman-2-one)

100g 7-羟基croman-2-one，10g碳钯，500ml四氢呋喃和800ml乙醇的混合物在氢气中在65℃搅拌15小时。反应的混合物通过硅藻土过滤，滤出液在减低的压力下被浓缩产生106.5g无色的7-羟基croman-2-one。

¹H-NMR(CDCl₃)δppm：2.75-2.96(4H，m)，5.81(1H，br s)，6.59-6.66(2H，m)，7.04(1H，d，J＝7.9Hz)

(步骤2)

7-苯氧基croman-2-one(7-benzyloxycroman-2-one)

搅拌202.4g 7-羟基croman-2-one和341.0g碳酸钾在N，N-二甲基甲酰胺的悬液，在室温加入153.2ml苯甲基氯，混合物在室温搅拌15小时。在反应混合物减压浓缩以除去溶剂，残余物被加入乙酸乙酯和水的混合物中。分离有机层，用水清洗，在无水硫酸钠上干燥，过滤。该过滤物减压浓缩，残余物在二异丙醚己烷中粉碎。通过过滤收集固体以产生266.1g灰褐色固体状的7-苯氧基croman-2-one。

¹H-NMR(CDCl₃)δppm：2.73-2.81(2H，m)，2.90-2.98(2H，m)，5.05(2H，s)，6.68(1H，d，J＝2.5Hz)，6.73(1H，dd，J＝8.3，2.5Hz)，7.08(1H，d，J＝8.3Hz)，7.30-7.46(5H，m)

(步骤3)

3-(4-苄氧基-2-羟氧基)丙酸酰胺

室温下在33.26g 7-苯氧基croman-2-one在264ml四氢呋喃的溶液中加入82ml28％水性氨溶液。混合物在室温搅拌20分钟，冰浴下在反应混合物中加入654ml1mol/L盐酸。产生的悬液用1L水稀释，通过过滤收集沉淀产生34.8g无色粉末状的3-(4-苄氧基-2-羟氧基)丙酸酰胺。

¹H-NMR(CDCl₃)δppm：2.60-2.70(2H，m)，2.80-2.90(2H，m)，5.01(2H，s)，5.46(2H，br s)，6.49(1H，dd，J＝8.5，2.5Hz)，6.58(1H，d，J＝2.5Hz)，6.93(1H，d，J＝8.5Hz)，7.28-7.45(5H，m)，8.67(1H，s)

(步骤4)

3-(4-苄氧基-2-甲氧基甲氧基苯基)丙酸酰胺

搅拌5.64g在油中60％氢化钠在628ml N，N-二甲基甲酰胺的悬液，在冰浴中加入34.8g 3-(4-苄氧基-2-羟氧基)丙酸酰胺，混合物在50℃搅拌40分钟。在冰浴中反应混合物中加入12.39g氯甲基甲醚，混合物在室温搅拌15小时。在反应混合物减压浓缩以除去溶剂，残余物被倒入500ml乙酸乙酯，100ml甲苯和200ml水的混合物中。分离有机层，用水清洗，在无水硫酸镁上干燥，过滤。该过滤物减压浓缩以产生无色固体。该固体在乙酸乙酯-二异丙醚中粉碎。通过过滤收集固体以产生35.3g无色固体状的3-(4-苄氧基-2-甲氧-甲氧苯基)丙酸酰胺。

¹H-NMR(CDCl₃)δppm：2.50(2H，t，J＝7.6Hz)，2.91(2H，t，J＝7.6Hz)，3.47(3H，s)，5.02(2H，s)，5.18(2H，s)，5.25-5.45(2H，m)，6.56(1H，dd，J＝8.5，2.5Hz)，6.77(1H，d，J＝2.5Hz)，7.07(1H，d，J＝8.5Hz)，7.30-7.45(5H，m)

(步骤5)

2-(4-苄氧基-2-甲氧基甲氧基苯基)乙胺

在28.42g 3-(4-苄氧基-2-甲氧-甲氧苯基)丙酸酰胺和40.4ml 1，8-二氮杂二环[5.4.0.]-7-十一碳烯在895ml甲醇中的溶液中加入65℃的16.04g N-溴代琥珀酰亚胺。在混合物在65℃中搅拌15分钟后，在反应混合物中另外加入65℃的16.04g N-溴代琥珀酰亚胺。在65℃中搅拌15分钟后，产生的混合物减压浓缩以除去溶剂。在残余物中加入水和乙酸乙酯，分离有机层。用水清洗有机层，在无水硫酸镁上干燥，过滤。该过滤物减压浓缩以产生油性产物。在该残余物在242ml乙醇的溶液中加入67.6ml 8mol/L水性氢氧化钾溶液，混合物被返流15小时。在反应混合物减压浓缩以除去溶剂。残余物中加入500ml乙酸乙酯，50ml甲苯和300ml水，分离有机层，在无水硫酸镁上干燥，过滤。该过滤物减压浓缩，残余物通过中等压力液柱色谱的硅胶(洗脱液：己烷-乙酸乙酯)中提纯产生无色油的80.0g 2-(4-苄氧基-2-甲氧基甲氧基苯基)乙胺。

¹H-NMR(CDCl₃)δppm：1.31(2H，br s)，2.71(2H，t，J＝6.9Hz)，2.90(2H，t，J＝6.9Hz)，3.47(3H，s)，5.03(2H，s)，5.17(2H，s)，6.56(1H，dd，J＝8.2，2.5Hz)，6.79(1H，d，J＝2.5Hz)，7.04(1H，d，J＝8.2Hz)，7.29-7.45(5H，m)

(步骤6)

4-(2-氨乙基)-3-甲氧基甲氧基苯基

18.00g 2-(4-苄氧基-2-甲氧基甲氧基苯基)乙胺，3.6g的10％碳钯(DegussaInc.：E101NE/W)和230ml乙醇的混合物在氢气中室温下搅拌1小时。在催化剂通过硅藻土被过滤后，该滤液减压浓缩以产生12.65g的无色固体4-(2-氨乙基)-3-甲氧基甲氧基苯基。

¹H-NMR(CD₃OD)δppm：2.65-2.75(2H，m)，2.75-2.85(2H，m)，3.45(3H，s)，5.16(2H，s)，6.36(1H，dd，J＝8.1，2.3Hz)，6.58(1H，d，J＝2.3Hz)，6.94(1H，d，J＝8.1Hz)

(步骤7)

5-氨基甲酰-2-甲氧苯磺酰基氯化物

冰浴中在1733g氯磺酸中加入小部分150g的4-甲氧苯甲酰胺同时搅拌15分钟，该混合物再于室温下搅拌14小时。在50℃中另外搅拌1.5小时，反应混合物放入7kg冰中。通过过滤收集沉淀物，用水和己烷清洗以产生230g 5-氨基甲酰-2-甲氧苯磺酰基氯化物。

¹H-NMR(DMSO-d6)δppm：3.81(3H，s)，7.00(1H，d，J＝8.5Hz)，7.10(1H，br s)，7.84(1H，dd，J＝8.5，2.5Hz)，7.87(1H，br s)，8.23(1H，d，J＝2.5Hz)

(步骤8)

5-氰基-2-甲氧苯磺酰基氯化物

5-氨基甲酰-2-甲氧苯磺酰基氯化物(150g)被悬浮在1800ml乙酸乙酯中。在219ml亚硫酰氯化物被加入在冰冷却下被搅拌的悬液后，在该混合物中加入2.3mlN，N-二甲基甲酰胺。在55℃搅拌3小时后，反应混合物减压浓缩。残余物中假如乙酸乙酯和水，分离的有机层用水、饱和的水性碳酸氢钠溶液和盐水清洗，在无水硫酸镁上干燥。在减低压力下除去溶剂，获得的粗制品从乙酸乙酯-己烷中再次结晶，产生86.8g 5-氰基-2-甲氧苯磺酰基氯化物。

¹H-NMR(CDCl₃)δppm：4.16(3H，s)，7.24(1H，d，J＝8.8Hz)，7.96(1H，dd，J＝8.8，2.2Hz)，8.28(1H，d，J＝2.2Hz)

(步骤9)

5-氰基-N-[2-(4-羟基-2-甲氧基甲氧基苯基)乙基]-2-甲氧苯磺胺

4-(2-氨乙基)-3-甲氧基甲氧基苯基(12.3g)和7.9g碳酸氢钠被悬浮在133ml四氢呋喃和14.4ml水组成的混合物中。每隔10分钟在产生的混合物中加入18ml 14.50g的5-氰基-2-甲氧苯磺酰氯化物在180ml四氢呋喃中形成的溶液的部分，保持内部温度在10-20℃。在室温中搅拌8小时后，反应混合物通过在氨基甲醇硅胶(洗脱液：乙酸乙酯)上的柱色谱提纯，从乙酸乙酯-二异丙醚中再结晶以产生21.87g无色晶体的5-氰基-N-[2-(4-羟基-2-甲氧基甲氧基苯基)乙基]-2-甲氧苯磺胺。

¹H-NMR(CDCl₃)δppm：2.74(2H，t，J＝6.3Hz)，3.10-3.20(2H，m)，3.40(3H，s)，3.81(3H，s)，4.85-4.95(2H，m)，5.08(2H，s)，6.38(1H，dd，J＝8.2，2.2Hz)，6.59(1H，d，J＝2.2Hz)，6.87(1H，d，J＝8.2Hz)，7.00(1H，d，J＝8.5Hz)，7.78(1H，dd，J＝8.5，2.2Hz)，8.16(1H，d，J＝2.2Hz)

(步骤10)

4-[2-(5-氰基-2-甲基苯磺酰胺)乙基]-3-甲氧基甲氧基苯基三氟甲基磺酸酯

在21.87g 5-氰基-N-[2-(4-羟基-2-甲氧基甲氧基苯基)乙基]-2-甲氧苯磺胺和10.21g N，N-二甲氨嘧啶在230ml二氯甲烷中的已被搅拌过的溶液中加入用冰冷却的9.38ml三氟甲基磺酸酐。该混合物被搅拌1小时，在反应混合物中加入50g碎冰。该混合物减压浓缩以除去二氯甲烷，残余物被倒入500ml乙酸乙酯和200ml水的混合物中。分离有机层，用水清洗，在无水硫酸镁上干燥，过滤。过滤物减压浓缩，残余物从乙酸乙酯-二异丙醚中再结晶以产生24.75g无色粉末状的4-[2-(5-氰基-2-甲基苯磺酰胺)乙基]-3-甲基甲基苯三氟甲基磺酸酯。

¹H-NMR(CDCl₃)δppm：2.86(2H，t，J＝6.6Hz)，3.15-3.25(2H，m)，3.44(3H，s)，3.86(3H，s)，4.89(1H，t，3＝6.0Hz)，5.16(2H，s)，6.86(1H，dd，J＝8.5，2.2Hz)，7.00-7.05(2H，m)，7.12(1H，d，J＝8.5Hz)，7.81(1H，dd，J＝8.5，2.2Hz)，8.20(1H，d，J＝2.2Hz)

(步骤11)

5-氰基-2-甲基-N-[2-(3-甲氧甲氧-2’-甲硫二苯-4-基)乙基]苯磺胺

24.75g的4-[2-(5-氰基-2-甲基苯磺酰胺)乙基]-3-甲氧基甲氧基苯基三氟甲基磺酸酯，8.32g的2-(甲硫)苯硼酸，2.73g的四(三苯磷化氢)钯(O)，728mg四-n-丁胺溴化物，10.00g碳酸钠，48ml水和285ml甲苯组成的混合物在氩气中在85℃加热15小时。沉淀物通过过滤收集，用乙酸乙酯和水连续清洗以获得19.74g黄色粉末状的5-氰基-2-甲基-N-[2-(3-甲氧甲氧-2’-甲硫二苯-4-基)乙基]苯磺胺。

¹00H-NMR(CDCl₃)δppm：2.40(3H，s)，2.88(2H，t，J＝6.3Hz)，3.19-3.27(2H，m)，3.43(3H，s)，3.82(3H，s)，5.04(1H，t，J＝5.7Hz)，5.17(2H，s)，6.95-7.05(2H，m)，7.08(1H，d，J＝7.6Hz)，7.10-7.25(3H，m)，7.25-7.30(1H，m)，7.30-7.40(1H，m)，7.79(1H，dd，J＝8.8，2.2Hz)，8.22(1H，d，J＝2.2Hz)

(步骤12)

5-氰基-N-[2-(2’-甲基磺酰-3-甲氧甲氧二苯-4-基)乙基]-2-甲氧苯磺胺

每隔15分钟在冰冷冻下已搅拌的由26.44g的5-氰基-2-甲基-N-[2-(3-甲氧甲氧-2’-甲硫二苯-4-基)乙基]苯磺胺和35.6g的碳酸氢钠在530ml丙酮和106ml水的混合物中形成的悬液中加入两部分81.5g的OXONE(商标)。该混合物在同样的条件下搅拌3小时，在冰冷冻下向搅拌过的反应混合物中加入100ml二乙醚，100ml水，和饱和的水性硫酸钠。该混合物减压浓缩以除去丙酮，此后在冰冷冻下把300ml水和二乙醚-己烷加入搅拌过的残余物。该混合物被搅拌30分钟，沉淀物通过过滤收集，用水和二乙醚-己烷清洗以产生27.1g白色粉末状的5-氰基-N-[2-(2’-甲基磺酰-3-甲氧甲氧二苯-4-基)乙基]-2-甲氧苯磺胺。

¹H-NMR(DMSO-d₆)δppm：2.65-2.75(2H，m)，2.79(3H，s)，3.05-3.15(2H，m)，3.30-3.35(3H，m)，4.00(3H，s)，5.15(2H，s)，6.94(1H，dd，J＝7.6，1.6Hz)，7.06(1H，d，J＝1.6Hz)，7.16(1H，d，J＝7.6Hz)，7.35-7.45(2H，m)，7.66(1H，td，J＝7.6，1.3Hz)，7.70-7.80(2H，m)，8.05-8.15(3H，m)

(步骤13)

5-氰基-N-[2-(3-羟基-2’-甲基磺酰二苯-4-基)乙基]-2-甲氧苯磺胺

在14.89g的5-氰基-N-[2-(2’-甲基磺酰-3-甲氧甲氧二苯-4-基)乙基]-2-甲氧苯磺胺在30ml异丙醇和90ml四氢呋喃的混合物中组成的悬液中加入11.7ml浓缩盐酸。在50℃搅拌2小时后，反应混合物用50ml水稀释，用150ml乙酸乙酯提取。有机层用饱和水性碳酸氢钠和盐水清洗，在无水硫酸镁上干燥，过滤。滤液减压浓缩，残余物通过在氨丙基化的硅胶(洗脱液：乙酸乙酯-甲醇)上的柱色谱提纯以产生10.22g无色无定形物5-氰基-N-[2-(3-羟基-2’-甲基磺酰二苯-4-基)乙基]-2-甲氧苯磺胺。

¹H-NMR(CDCl₃)δppm：2.69(3H，s)，2.87(2H，t，J＝6.9Hz)，3.20-3.30(2H，m)，3.98(3H，s)，5.34(1H，t，J＝5.7Hz)，5.93(1H，s)，6.88(1H，dd，J＝7.6，1.6Hz)，6.97(1H，d，J＝1.6Hz)，7.05-7.15(2H，m)，7.33(1H，dd，J＝7.6，1.3H2)，7.56(1H，td，J＝7.6，1.3Hz)，7.65(1H，td，J＝7.6，1.3Hz)，7.82(1H，dd，J＝8.5，2.2Hz)，8.15-8.25(2H，m)

(步骤14)

乙基[4-[2-(5-氰基-2-甲氧基苯磺酰基氨基)乙基]-2’-甲基磺酰二苯-3-基氧代]乙酸酯

在5.72g的5-氰基-N-[2-(3-羟基-2’-甲基磺酰二苯-4-基)乙基]-2-甲氧苯磺胺和57ml N，N-二乙基甲酰胺组成的溶液中加入2.46ml N，N-二异丙乙胺和1.37ml乙基溴乙酸酯。在50℃搅拌15小时，反应混合物被倒入100ml水中，用150ml乙酸乙酯和20ml甲苯组成的混合物提取。有机层用水和盐水清洗，在无水硫酸镁上干燥，过滤。滤液减压浓缩，残余物通过在氨丙基化的硅胶(洗脱液：乙酸乙酯-己烷)上的柱色谱提纯以产生无定形的乙基[4-[2-(5-氰基-2-甲氧基苯磺酰基氨基)乙基]-2’-甲基磺酰二苯-3-基氧代]乙酸酯。

¹H-NMR(CDCl₃)δppm：1.28(3H，t，J＝6.9Hz)，2.59(3H，s)，2.95(2H，t，J＝6.6Hz)，3.30-3.60(2H，m)，3.99(3H，s)，4.23(2H，q，J＝6.9Hz)，4.68(2H，s)，5.43(1H，t，J＝6.3Hz)，6.95(1H，dd，J＝7.6，1.6Hz)，7.04(1H，d，J＝1.6Hz)，7.09(1H，d，J＝8.5Hz)，7.20(1H，d，J＝7.6Hz)，7.36(1H，dd，J＝7.6，1.3Hz)，7.57(1H，td，J＝7.6，1.3Hz)，7.65(1H，td，J＝7.6，1.3Hz)，7.80(1H，dd，J＝8.5，2.2Hz)，8.20-8.25(2H，m)

(步骤15)

乙基[4-[2-(5-氰基-2-羟基苯磺酰胺)乙基]-2’-甲基磺酰二苯-3-基氧代]乙酸酯

在4.62g[4-[2-(5-氰基-2-甲氧基苯磺酰基氨基)乙基]-2’-甲基磺酰二苯-3-基氧代]乙酸酯在40ml N，N-二甲基甲酰胺组成的溶液中加入1.03g氯化锂，该混合物在140℃搅拌2小时。在冷却到室温后，反应混合物被倒入60ml乙酸乙酯，6ml甲苯和32ml 1mol/L盐酸的混合物中。分离有机层，用1mol/L盐酸和盐水清洗。有机层在无水硫酸镁上干燥，过滤。滤液减压浓缩，残余物通过在氨丙基化的硅胶(洗脱液：乙酸-乙酸乙酯)上的柱色谱提纯以产生3.67g无色的无定形物乙基[4-[2-(5-氰基-2-羟基苯磺酰胺)乙基]-2’-甲基磺酰二苯-3-基氧代]乙酸酯。

¹H-NMR(DMSO-d₆)δppm：1.14(3H，t，J＝7.3Hz)，2.71(3H，s)，2.75-2.82(2H，m)，3.07-3.16(2H，m)，4.10(2H，q，J＝7.3Hz)，4.75(2H，s)，6.90-6.95(2H，m)，7.12(1H，d，J＝8.5Hz)，7.20-7.30(1H，m)，7.38(1H，dd，J＝7.6，1.3Hz)，7.45-7.60(1H，br s)，7.65(1H，td，J＝7.6，1.3Hz)，7.75(1H，td，J＝7.6，1.3Hz)，7.87(1H，dd，J＝8.5，2.2Hz)，8.01(1H，d，J＝2.2Hz)，8.07(1H，dd，J＝7.6，1.3Hz)，11.80-12.30(1H，br)

(步骤16)

乙基[4-[2-[2-羟基-5-(N-羟基氨基甲酰亚氨基)苯磺酰氨基]乙基]-2’-甲基磺酰联苯-3-基氧代]乙酸酯

2.01g的乙基[4-[2-(5-氰基-2-羟基苯磺酰胺)乙基]-2’-甲基磺酰二苯-3-基氧代]乙酸酯在1.0ml饱和氯化氢/乙醇溶液中形成的悬液在室温中被搅拌3小时。该反应混合物减压浓缩，残余物溶解在20.0ml乙醇中。在该溶液中加入3.34g醋酸羟铵，该混合物在室温中被搅拌13小时。反应混合物被倒入乙酸乙酯-水中，有机层被分离。在水性层用乙酸乙酯提取后，与有机层结合，用盐水清洗。有机层在无水硫酸镁上干燥，过滤。滤液减压浓缩，残余物通过在硅胶(洗脱液：乙酸乙酯)上的柱色谱提纯以产生1.90g无定形的乙基[4-[2-[2-羟基-5-(N-羟基氨基甲酰亚氨基)苯磺酰氨基]乙基]-2’-甲基磺酰联苯-3-基氧代]乙酸酯。

¹H-NMR(DMSO-d₆)δppm：1.12(3H，t，J＝6.9Hz)，2.70(3H，s)，2.75-2.85(2，m)，3.00-3.10(2H，m)，4.08(2H，q，J＝6.9Hz)，4.75(2H，s)，5.77(2H，br s)，6.85-6.95(2H，m)，6.97(1H，d，J＝8.5Hz)，7.10-7.25(2H，m)，7.35-7.40(1H，m)7.60-7.80(3H，m)，7.95-8.10(2H，m)，9.53(1H，br s)，10.9(1H，br s)

(步骤17)

盐酸n-丁基[4-[2-[2-羟基-5-(N-羟基氨基甲酰亚氨基)苯磺酰氨基]乙基]-2’-甲基磺酰联苯-3-基氧代]乙酸酯的晶体形式A

1.499g的乙基[4-[2-[2-羟基-5-(N-羟基氨基甲酰亚氨基)苯磺酰氨基]乙基]-2’-甲基磺酰联苯-3-基氧代]乙酸酯在20ml 34％氯化氢/n-丁醇溶液中于60℃中搅拌3小时。反应混合物减压浓缩，粗晶体从n-丁醇/二异丙醚中再结晶以产生1.472g的白色晶体的盐酸n-丁基[4-[2-[2-羟基-5-(N-羟基氨基甲酰亚氨基)苯磺酰氨基]乙基]-2’-甲基磺酰联苯-3-基氧代]乙酸酯。获得的晶体通过X射线粉末衍射分析确定为晶体形式A。晶体的X射线粉末衍射图如图3所示。

熔点：155℃

¹H-NMR(DMSO-d₆)δppm：0.78(3H，t，J＝7.6Hz)，1.15-1.30(2H，m)，1.40-1.55(2H，m)，2.72(3H，s)，2.75-2.85(2H，m)，3.05-3.15(2H，m)，4.05(2H，t，J＝6.6Hz)，4.78(2H，s)，6.90-6.95(2H，m)，7.18(1H，d，J＝7.6Hz)，7.20-7.30(1H，m)，7.37(1H，d，J＝7.6Hz)，7.42-7.50(1H，m)，7.66(1H，td，J＝7.6，1.3Hz)，7.72-7.82(2H，m)，8.02-8.10(2H，m)，8.60-9.60(1H，br)，10.85-11.30(1H，br)，11.80-12.20(1H，br)，12.50-13.05(1H，br)

参考例2

盐酸n-丁基[4-[2-[2-羟基-5-(N-羟基氨基甲酰亚氨基)苯磺酰氨基]乙基]-2’-甲基磺酰联苯-3-基氧代]乙酸酯-水合物晶体

在参考例1中获得的盐酸n-丁基[4-[2-[2-羟基-5-(N-羟基氨基甲酰亚氨基)苯磺酰氨基]乙基]-2’-甲基磺酰联苯-3-基氧代]乙酸酯(827mg)的粗晶体和12.6ml 1N盐酸的混合物在40℃加热搅拌过夜。产生的晶体通过过滤收集和在40℃和在减低压力下过夜干燥以产生823mg晶体。获得的晶体通过Karl Fischer水测量确定为盐酸n-丁基[4-[2-[2-羟基-5-(N-羟基氨基甲酰亚氨基)苯磺酰氨基]乙基]-2’-甲基磺酰联苯-3-基氧代]乙酸酯一水合物。晶体的X射线粉末衍射图如图2所示。

熔点：133℃

实施例1

盐酸n-丁基[4-[2-[2-羟基-5-(N-羟基氨基甲酰亚氨基)苯磺酰氨基]乙基]-2’-甲基磺酰联苯-3-基氧代]乙酸酯的晶体形式B

在参考例1中获得的盐酸n-丁基[4-[2-[2-羟基-5-(N-羟基氨基甲酰亚氨基)苯磺酰氨基]乙基]-2’-甲基磺酰联苯-3-基氧代]乙酸酯(476mg)的粗晶体和2.1kg的n-丁醇的混合物在86℃加热搅拌直至溶液变清。在不溶解物质被过滤出以后，滤液被冷却到45℃，在同样的温度向其中逐滴加入2.5kg乙酸乙酯。随后加入晶体形式B的晶种，产生的混合物在室温搅拌过夜以结晶化。该悬液在冰冷却下搅拌5.5小时，沉淀晶体通过过滤收集。该晶体用乙酸乙酯(150g)/n-丁醇(300g)和乙酸乙酯(650g)连续清洗，在40℃和在减低压力下过夜干燥以产生360g的晶体。获得的晶体用X射线粉末衍射分析确定为晶体形式B。晶体的X射线粉末衍射图如图1所示。

熔点：168℃

实施例2

盐酸n-丁基[4-[2-[2-羟基-5-(N-羟基氨基甲酰亚氨基)苯磺酰氨基]乙基]-2’-甲基磺酰联苯-3-基氧代]乙酸酯的晶体形式B

在参考例1中获得的盐酸n-丁基[4-[2-[2-羟基-5-(N-羟基氨基甲酰亚氨基)苯磺酰氨基]乙基]-2’-甲基磺酰联苯-3-基氧代]乙酸酯(200mg)的粗晶体和1.2ml n-丁醇的混合物被加热到100℃，搅拌直至溶液变清。该溶液被冷却到室温，向其中加入1.2ml甲乙酮。产生的混合物在室温搅拌过夜以结晶化。沉淀晶体通过过滤收集。该晶体用0.8ml乙酸乙酯清洗，在40℃和在减低压力下过夜干燥以产生135mg晶体。获得的晶体用X射线粉末衍射分析确定为晶体形式B。

熔点：168℃

实施例3

盐酸n-丁基[4-[2-[2-羟基-5-(N-羟基氨基甲酰亚氨基)苯磺酰氨基]乙基]-2’-甲基磺酰联苯-3-基氧代]乙酸酯的晶体形式B

在参考例1中获得的盐酸n-丁基[4-[2-[2-羟基-5-(N-羟基氨基甲酰亚氨基)苯磺酰氨基]乙基]-2’-甲基磺酰联苯-3-基氧代]乙酸酯(100mg)的粗晶体和1.0ml n-丁醇的混合物在90℃加热，搅拌直至溶液变清。该混合物被冷却到室温，向其中逐滴加入0.8ml 1，2-二甲基乙烷。产生的混合物在室温搅拌过夜以结晶化。沉淀晶体通过过滤收集，用0.8ml乙酸乙酯清洗，在40℃和在减低压力下过夜干燥以产生52mg晶体。获得的晶体用X射线粉末衍射分析确定为晶体形式B。

熔点：168℃

实验实施例1

(储存稳定性实验)

稳定性实验在40℃/90％相对湿度的储存条件下对实验物质进行实验。实验物质的剩余比率通过HPLC按照下列条件确定。结果如表1所示。

HPLC条件：

检测波长：225nm

柱：CAPCELL PAK C18，MG 5μm，3.0mm I.D.x250mm

柱温：35℃

流动相：

0.02mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)∶乙腈混合溶剂

0→20分钟；42∶58

20→40分钟；42∶58→70∶30

40→45分钟；70∶30

流速；0.5ml/min

表1

    实验物质    剩余比率    参考例1    96.8    实施例1    99.0

实验实施例2

(饱和水溶解性)

大约40mg实验物质被放置在容器中，在其中加入大约15ml水来悬浮。该悬液在37℃加热搅拌，随时间每次收集大约1ml部分。每部分通过0.45μm的过滤器过滤。此后，从过滤物中准确地取出500μl，在其中加入500μl水/乙腈(l/l)的混合溶剂以制备实验溶液。5μl的实验溶液按照下列条件用高效液相色谱分析方法分析。在实验溶液的每个点的水溶解性中，最高的浓度被认为是饱和水溶解性。结果如表2所示。

HPLC条件：

检测波长：225nm

柱：Inertsil ODS-3，5μm，4.6mm I.D.x 250mm

柱温：30℃

流动相：

0.02mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)∶乙腈混合溶剂

0→30分钟；42∶58

流速；1.0ml/min

测量时间：30分钟

表2

    实验物质    饱和水溶解性(μg/mL)    参考例2    270    实施例1    1600

实施例3

(对活化凝血因子X抑制活性和凝血素时间(PT)的测量)

使用年龄在6-9周(SLC)的，禁食过夜的雄性Wistar鼠。实验物质悬浮于0.5％甲基纤维素溶液，浓度为6.0mg/mL。以5.0ml/kg的量口服施用到鼠。因此，在施用实验物质前后30分钟，从颈静脉收集柠檬酸处理(1∶10稀释，3.13％柠檬酸钠)的血液。通过离心获得血浆样本。使用血浆样本按照下列步骤检测实验物质对活化凝血因子X和凝血素时间(PT)的效果。

1)对活化凝血因子X抑制活性

2.5μl血浆样本，200μl的100mM tris-200mM NaCl缓冲液(pH8.4)和10μl的0.06U/mL在凝胶-氨基乙酸缓冲液中的人活化凝血因子X(Calbiochem)被倒入96孔微板。随后加入50μl的1mM S-2222(Daiichi Pure Chemicals)水性溶液，该混合物在室温中温育10分钟。反应用加入50μl的60％乙酸终止，使用微板测读设备(SPECTRAmax250，Molecular Devices)检测吸光率(405nm)。代替血浆样本的2.5μl的对照血浆组被定义为对照，代替人活化凝血因子X的10μl的凝胶-氨基乙酸缓冲溶液组被定义为空白。按照对照的吸光率为100％计算血浆样本的抑制百分率，该值被用于血浆中抗-活化凝血因子X活性的指数。结果如表3所示。

2)凝血素时间(PT)

50μl血浆被置于加工管，在37℃温育。1分钟后，在混合物中加入100mu L在37℃预热的血浆PT试剂(Boehringer Mannheim)。PT用血凝度测量计(ST4，Boehringer Mannheim)测量。每个时间点上施用实验物质后的PT与施用实验物质前的PT的比值被用作抗凝结活性指数。结果如表3所示。

表3

    实验物质对活化凝血因子X抑制活性(％)    PT比值    实施例1    58.2    1.50

工业应用

本发明的盐酸n-丁基[4-[2-[2-羟基-5-(N-羟基氨基甲酰亚氨基)苯磺酰氨基]乙基]-2’-甲基磺酰联苯-3-基氧代]乙酸酯的晶体形式B有高滤过率和良好的操作特性。本发明的晶体形式B可通过方便的提纯步骤获得高纯度，适合商业化生产。而且，本发明的晶体形式B有高水溶性和良好的口服生物利用度。本发明的晶体形式B有良好的储存稳定性，适合药学制剂。因此，本发明的晶体形式B可用于药物物质。