法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2018-03-06
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N15/09 授权公告日:20090722 终止日期:20170213 申请日:20030213
专利权的终止
2009-07-22
授权
授权
2005-08-24
实质审查的生效
实质审查的生效
2005-06-29
公开
公开
技术领域
本发明涉及到用于持家基因(housekeeping gene)检测的核酸扩增用引物。
背景技术
随着近年来基因工程和分子生物学等领域的进步，可以在DNA或RNA水平对传染病和基因疾病等进行诊断了。特别是通过聚合酶链式反应法(PCR法、Science，230：1350-1354，1985)和NASBA法(Nucleic Acid Sequence Based Amplification法、Nature，350，91-92，1991、日本专利第2648802号公报和日本专利第2650159号公报记载)等核酸扩增方法，以往比较困难的生物检体中极微量核酸量的检测也可以进行了，基因解析迅速变成了容易的事情。
例如在癌症领域，向淋巴节的癌转移诊断就具有极其重要的意义。作为向淋巴节的癌转移诊断的一个手法，有检测作为癌标志的例如细胞角蛋白(CK)那样的蛋白质方法。由于近年来基因解析技术的发展，通过检测与癌标志蛋白质有关的mRNA的表达，已经可以有效地进行癌诊断了(北海道医学雑志、p.135-141，Vol.66(2)，1991)。通过RT-PCR可以通过切除的组织进行CK的mRNA表达的检测，漏掉癌转移(诊断)的问题已经可以避免到一定程度。在肿瘤或癌的诊断领域中，这样的核酸扩增方法已经实用化了(临床检查法提要、第31版、金原出版株式会社、1998年9月20日发行)。
作为上述以外的DNA扩增方法，报道了LAMP法(专利文献1)。LAMP法是通过利用含有当进行链置换反应时在扩增产物末端形成发卡构造的引物的多个引物进行的基因扩增方法。首先，在初期反应，通过2种内引物(FIP，RIP)以及2种外引物(F3引物、R3引物)和链置换型DNA聚合酶由模板DNA合成两端具有一条链环部分的哑铃状的结构。该结构成为扩增循环的起点结构，由该结构的3’末端侧以自身作为模板进行DNA的延伸合成反应。扩增产物由许多重复结构构成，重复结构単位由夹在引物之间构成被扩增区域的双链核酸的碱基序列成反向的同一链内的互补区构成。LAMP法的特征是不需要通过热变性将模板DNA的双链变为一条链的操作，扩增反应都是在等温下连续进行的(非专利文献1和2)。模板是RNA时，通过在模板为DNA的反应液组成中再添加逆转录酶，同样可以合成起点结构，进行扩增(RT-LAMP法)。通过LAMP法在30分钟左右时间就可检测到充分的扩增产物。因此，由于核酸检测需要的时间被缩短，可以运用于以例如迅速确定治疗方针为目的的向淋巴节的癌转移的诊断。另外由于可以迅速得到结果，也有望可运用于术中诊断。
在对mRNA进行定量时，作为样品中的内部对照，即可以使用认为虽然组织不同但表达量没有差异的持家基因的mRNA。存在着通过使用该持家基因的mRNA作为内部对照，即使不考虑靶基因mRNA的提取效率或cDNA的合成效率也可以检测相对的靶基因mRNA的优点。
作为持家基因例子，如作为细胞骨架构成成分的β-肌动蛋白的基因和作为糖酵解主要酶的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(以下称为「GAPDH」)基因。
关于作为内部对照目的使用的持家基因，期望开发出更有效的核酸扩增用引物。
(关于β-肌动蛋白基因)
肌动蛋白是大量出现在所有真核细胞的蛋白质。该蛋白质在高等生物细胞中提供包括有丝分裂中的作用、运动性以及结构完全性在内的很多结构和调节的功能。在脊椎动物中已鉴定有6个肌动蛋白的同工型，其中4个为肌肉型(骨骼肌、心肌、大动脉型平滑肌和胃型平滑肌的肌动蛋白)和2个非肌肉型(细胞质的β-肌动蛋白和γ-肌动蛋白)。肌肉肌动蛋白存在组织特异性，参与肌肉的收缩。与之相反，细胞质肌动蛋白基本上出现在所有细胞中，与许多细胞功能有关。细胞内存在的肌动蛋白尽管存在多样性，但氨基酸序列在肌动蛋白的类型和真核生物的种间高度保守。
人的细胞质β-肌动蛋白基因的序列已经确定，并已与其它种类的β-肌动蛋白基因进行了比较(Nakajima-Iijima，et.al.PNAS 82，p.6133-6137(1985)、欧洲专利申请第0174608号、Ponte et.al.1984.Nucleic Acids Res.12，p.1687-1696(1984))。用于扩增人β-肌动蛋白基因整体的引物来自Clontech Laboratories(Clontech Laboratories，Inc.(Palo Alto，CA)的以MAPPING Amplimershito β-肌动蛋白用的商品名在市场销售。而关于与人β-肌动蛋白的核苷酸序列进行种特异性杂交的寡核苷酸，有报道将这些寡核苷酸作为核酸扩增反应中的内部对照，以及用作决定核酸扩增反应中使用的样品的完全性的手段(特开平7-99981)。
(关于GAPDH基因)
人甘油醛-3-磷酸是生物体内糖酵解、戊糖磷酸循环等糖代谢以及脂质合成中的重要中间体之一，广泛分布于人体内。另外为了由该物质合成脂质，需要人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，所以该酶也广泛分布于人体内。
关于作为内部对照目的使用的β-肌动蛋白和GAPDH，期望开发更有效的核酸扩增用引物。
(专利文献1)国际公开第WO 00/28082号公报
(非专利文献1)Bioventure、2001年、Vol.1，No.1，p.109-115
(非专利文献2)BIO INDUSTRY、2001年、Vol.18，No.2，p.15-29
发明的内容
本发明的目的在于提供用于持家基因mRNA检测的核酸扩增用引物，具体来说是提供用于扩增β-肌动蛋白基因或GAPDH基因的mRNA的新的引物。
(用于解决课题的手段)
本发明人等为了解决上述课题进行了深入地研究，结果可以构建持家基因用核酸扩增用引物。
即本发明包括以下内容：
1.一种用于通过LAMP法对与持家基因和/或持家基因相关的mRNA进行检测的核酸扩增用引物。
2.上述1所述的核酸扩增用引物，其中持家基因是β-肌动蛋白基因或GAPDH基因。
3.含有选自以下组的序列构成的寡核苷酸的用于β-肌动蛋白检测的核酸扩增用引物；
1)由序列1所示碱基序列的第240～380位、或第401～1060位的区域和/或其互补链的区域选择的，至少含有5个以上的序列1或其互补链的连续碱基的寡核苷酸。
2)由序列2或4～34中任一个所示碱基序列构成的寡核苷酸。
3)上述1)或2)所述的寡核苷酸的互补链。
4)在严格条件下可与上述1)～3)中任一个所述的寡核苷酸杂交的寡核苷酸。
5)含有在上述1)～4)所述寡核苷酸中1个至数个碱基被变异(置换、缺失、插入或付加)的碱基序列在内的具有引物功能的寡核苷酸。
4.由从序列10和14～17、29～50的序列表示的碱基序列中选择的任一个寡核苷酸构成的用于β-肌动蛋白检测的核酸扩增用引物。
5.含有由以下组中选择的序列构成的寡核苷酸的用于GAPDH检测的核酸扩增用引物；
1)含有由序列51所示碱基序列的第110～450位的区域和/或其互补链区域选择的序列51或其互补链的至少5个以上连续碱基的寡核苷酸。
2)由序列52～79任一个所示碱基序列构成的寡核苷酸。
3)上述1)或2)所述的寡核苷酸的互补链。
4)在严格条件下可与上述1)～3)中任一个所述寡核苷酸杂交的寡核苷酸。
5)含有在上述1)～4)所述寡核苷酸中1个至数个碱基被变异(置换、缺失、插入或付加)的碱基序列的具有引物功能的寡核苷酸。
6.由从序列58和62～64、73～96的序列表示的碱基序列中选择的任一个寡核苷酸构成的用于GAPDH检测的核酸扩增用引物。
7.上述3～6项任一项所述的核酸扩增用引物，其中核酸扩增手段是LAMP法。
8.一种用于β-肌动蛋白检测的核酸扩增用引物组，其特征是从含有由以下各组选择的序列构成的寡核苷酸的核酸扩增用引物中至少选择2种。
1)含有从序列1所示碱基序列的第240～1060位的区域和/或其互补链选择的序列1或其互补链的至少5个以上连续碱基的寡核苷酸。
2)由序列2～34所示碱基序列构成的寡核苷酸。
3)上述1)或2)所述的寡核苷酸的互补链。
4)在严格条件下可与上述1)～3)中任一个所述寡核苷酸杂交的寡核苷酸。
5)包含在上述1)～4)所述寡核苷酸中1个至数个碱基被变异(置换、缺失、插入或付加)的碱基序列的具有引物功能的寡核苷酸。
9.一种用于β-肌动蛋白检测的核酸扩增用引物组，其特征是从含有上述8所述寡核苷酸的核酸扩增用引物中至少选择4种。
10.上述8或9所述的核酸扩增用引物组，其特征是上述引物组中含有的引物中至少2种识别序列1所示碱基序列和/或其互补链的各2处的基因区域。
11.上述9或10所述的核酸扩增用引物组，其特征是上述引物组中含有的引物识别序列1所示碱基序列和/或其互补链中的至少6个基因区域。
12.由序列10和14～17、29～32、35～42和43～50所示的碱基序列的寡核苷酸构成的用于β-肌动蛋白检测的核酸扩增用引物，该引物是从(a)FIP：序列35～42、(b)RIP：序列43～50、(c)F3：序列10和14～17、和(d)R3：序列29～32各个分类中各选择1个引物组合后的引物组。
13.在上述12所述的引物组中，作为引物还含有序列33和34所示碱基序列的寡核苷酸的引物组。
14.用于GAPDH检测的核酸扩增用引物组，其特征是从含有上述5所述寡核苷酸的核酸扩增用引物中至少选择2种。
15.用于GAPDH检测的核酸扩增用引物组，其特征是从含有上述5所述寡核苷酸的核酸扩增用引物中至少选择4种。
16.上述14或15所述核酸扩增用引物组，其特征是上述引物组中含有的引物中至少有2种识别序列51所示碱基序列和/或其互补链的各2处的基因区域。
17.上述14～16中任一项所述的核酸扩增用引物组，其特征是上述引物组含有的引物识别序列51所示碱基序列和/或其互补链的至少6个基因区域。
18.由序列80～96所示碱基序列的寡核苷酸构成的用于GAPDH检测的核酸扩增用引物，其特征是含有由(a)FIP：序列80～87、(b)RIP：序列88～96各个分类选择的1个引物的组合的引物组。
19.在上述18所述的被选择的各引物组合中作为引物还含有序列58或序列62～64所示碱基序列的寡核苷酸中的任一个和序列73～77所示碱基序列的寡核苷酸中的任一个的引物组。
20.在上述18或19所述的引物组中作为引物还含有序列78和79所示碱基序列的寡核苷酸的引物组。
21.上述8～20任一项所述核酸扩增用引物组，核酸扩增手段为IAMP法。
22.由以下1)～12)中所示任一个构成的β-肌动蛋白检测用的核酸扩增用引物组；
1)作为引物，含有序列35、43、14和29所示碱基序列的寡核苷酸的引物组。
2)作为引物，含有序列36、44、15和30所示碱基序列的寡核苷酸的引物组。
3)作为引物，含有序列37、45、10和31所示碱基序列的寡核苷酸的引物组。
4)作为引物，含有序列41、50、17和32所示碱基序列的寡核苷酸引物组。
5)作为引物，含有序列38、45、10和31所示碱基序列的寡核苷酸引物组。
6)作为引物，含有序列39、45、10和31所示碱基序列的寡核苷酸引物组。
7)作为引物，含有序列40、45、16和31所示碱基序列的寡核苷酸引物组。
8)作为引物，含有序列41、45、16和31所示碱基序列的寡核苷酸引物组。
9)作为引物，含有序列37、46、16和31所示碱基序列的寡核苷酸引物组。
10)作为引物，含有序列37、47、16和31所示碱基序列的寡核苷酸引物组。
11)作为引物，含有序列37、48、16和31所示碱基序列的寡核苷酸引物组。
12)作为引物，含有序列37、49、16和31所示碱基序列の寡核苷酸引物组、
23.由以下1)～16)中所示的任一个构成的用于GAPDH检测的核酸扩增用引物组；
1)作为引物含有序列80、88、62和73所示碱基序列的寡核苷酸引物组。
2)作为引物，含有序列81、89、63和75所示碱基序列的寡核苷酸引物组。
3)作为引物，含有序列86、95、58和76所示碱基序列的寡核苷酸引物组。
4)作为引物，含有序列87、96、64和77所示碱基序列的寡核苷酸引物组。
5)作为引物，含有序列81、89、62和75所示碱基序列的寡核苷酸引物组。
6)作为引物，含有序列82、89、62和75所示碱基序列的寡核苷酸引物组。
7)作为引物，含有序列83、89、63和75所示碱基序列的寡核苷酸引物组。
8)作为引物，含有序列83、89、62和75所示碱基序列的寡核苷酸引物组。
9)作为引物，含有序列84、89、62和75所示碱基序列的寡核苷酸引物组。
10)作为引物，含有序列85、89、62和75所示碱基序列的寡核苷酸引物组。
12)作为引物，含有序列81、90、63和75所示碱基序列的寡核苷酸引物组。
13)作为引物，含有序列81、91、63和75所示碱基序列的寡核苷酸引物组。
14)作为引物，含有序列81、92、63和75所示碱基序列的寡核苷酸引物组。
15)作为引物，含有序列81、93、63和75所示碱基序列的寡核苷酸引物组。
16)作为引物，含有序列81、94、63和75所示碱基序列の寡核苷酸引物组、
24.至少使用一个上述1～7中任一项所述的引物进行的核酸检测方法、
25.使用上述8～23中任一项所述的引物组进行的核酸检测方法、
26.上述24或25所述的核酸检测方法中使用的试剂和/或试剂盒、
27.利用上述24或25所述的核酸检测方法的核酸检测系统。
附图的简单说明
图1是表示使用本发明β-肌动蛋白用引物时的灵敏度的图(实验例2)，图2是表示在LS180细胞和Raji细胞培养液中使用本发明β-肌动蛋白用引物进行测定时的结果(实验例3)图。
图3是表示使用本发明GAPDH用引物时的灵敏度的图(实验例5)、图4是表示在LS180细胞和Raji细胞培养液中使用本发明GAPDH用引物进行测定时的结果(实验例6)图。
发明的具体实施方式
(引物的设计)
本发明目的在于提供持家基因的核酸扩增法、更具体地说是提供可适用于β-肌动蛋白基因或GAPDH基因的mRNA的核酸扩增法的核酸扩增用引物。
在LAMP法中使用的引物的基本思路就象专利文献1所述那样。
具体来说，由要扩增的靶DNA的3’末端侧开始依次规定称为F3c、F2c、F1c的区域，由5’末端侧开始依次规定称为R3、R2、R1的区域，至少对于这6个区域，选择实质上含有同一碱基序列、或实质上含有互补碱基序列的寡核苷酸链，至少设计4种引物。
所谓实质上同一碱基序列定义如下。即，以某一碱基序列为模板合成的互补链与目的碱基序列杂交，给出互补链合成的起点时，该序列相对于目的碱基序列实质上是同一序列。例如，所谓对于F2实质上同一的碱基序列，除了与F2完全同一的碱基序列外，还包括与F2杂交，具有作为给出可成为互补链合成起点的碱基序列的模板功能的碱基序列。
根据本发明，用于赋予构成寡核苷酸的碱基序列的特征中使用的同一、或互补的用语无论哪一个都不需要完全同一、或完全互补。即，所谓与某一序列同一也包括对可与某一序列杂交的碱基序列互补的序列。而，所谓互补的序列指的是在严格条件下可进行杂交，可提供成为互补链合成起点的3’末端的序列。
本发明的引物具有在以下所述的各种核酸合成反应中在所给予的环境下，一方面维持必要的特异性，一方面可与互补链进行碱基对结合的程度的链长。具体来说，做成5～200碱基、最好是10～50碱基对。由于催化依赖于序列的核酸合成反应的众所周知的聚合酶识别的引物链长最低为5个碱基左右，进行杂交的部分的链长必需为5个碱基以上。此外，为了维持作为碱基序列的特异性，希望维持在10个碱基以上的长度。另一方面，由于过长碱基序列通过化学合成制备困难，所以举出上述那样的希望的范围。
本发明中使用的所谓模板的用语指的是成为互补链合成的模板的一侧的核酸。具有与模板互补的碱基序列的互补链具有作为可与模板杂交的链的意思，两者的关系只不过始终是相对的关系。就是说，作为互补链合成的链可以起到再作为模板的功能。即，互补链可以变成模板。
在本发明中，由靶DNA碱基序列选择的引物构成各个FIP(正向内引物，forward inner primer)、F3引物(正向外引物，forward outerprimer)、RIP(反向内引物，reverse inner primer)和R3引物(反向外引物，reverse outer primer)中的任一个。
FIP设计成在3’末端具有与靶DNA的F2c区域实质上互补的F2区域的碱基序列，在5’末端具有与靶DNA的F1c区域实质上相同的碱基序列。在这种情形下，在F2和F1c的序列间也可以含有不依赖于靶DNA的序列。不依赖于该靶DNA的序列的长度可容许为0～50碱基、优选是0～40碱基。
F3引物可以设计为具有与F3区域实质上相同的碱基序列，而F3区域实质上与靶DNA的F3c区域互补。
RIP可以设计为在3’末端具有与靶DNA的R2c区域实质上互补的R2区域的碱基序列，在5’末端具有与靶DNA的R1c区域实质上相同的碱基序列。RIP也与FIP同样，在R2和R1c的序列间可以含有不依赖于靶DNA的序列。
R3引物可以设计为具有与R3区域实质上相同的碱基序列，而R3区域实质上与靶DNA的R3c区域互补。
另外在LAMP法中，通过并用至少1种以上的回环引物，可以缩短扩增时间(国际公开WO 02/24902号公报)。所谓回环引物指的是哑铃构造的5’末端侧的回环的单链部分，具体来说，例如在R1区域和R2区域间、或F1区域和F2区域间具有互补的序列的引物。通过使用回环引物，可以增加DNA合成的起点。该回环引物设计成在DNA合成过程中可与生成的FIP或RIP不杂交的回环区域进行杂交。
为了构建上述引物，选择的基因区域要注意碱基组成、GC含量、二级结构、Tm值等，识别DNA区域的碱基序列长度可以选择碱基数至少在5个碱基以上、最好是10～30个碱基、更理想的是17～25个碱基的碱基序列。Tm值一般可以通过Nearest Neighbor法求出。DNA区域可以选择Tm值为55～65℃、最好是58～64℃、GC含量为40～70％、最好是50～65％的区域。
本发明的引物也根据上述原理选择区域、进行设计。
在本发明中可选择的β-肌动蛋白基因的区域包括在序列1所示碱基序列的第240～1060位和/或其互补链的区域、最好是第240～380位或第401～1060位、更理想的是第740～990位的区域和/或该互补链的区域。
本发明中β-肌动蛋白检测用引物是1)序列1所示碱基序列的第240～1060位、最好是第240～380位或第401～1060位、更理想的是第740～990位的区域和/或该互补链的区域，碱基数至少在5个以上的寡核苷酸，2)由序列2～50所示碱基序列构成的寡核苷酸、3)上述1)或2)所述的寡核苷酸的互补链、4)在严格条件下可与上述1)～3)中任一个所述寡核苷酸杂交的寡核苷酸、或、5)含有上述1)～4)中所述寡核苷酸中1个至数个碱基被变异(置换、缺失、插入或付加)的碱基序列的寡核苷酸，可从中选择、设计用作引物。
而本发明中可选择的GAPDH基因的区域包括在序列51所示碱基序列的第110～450位的区域和/或该互补链的区域。
本发明中的GAPDH的引物是1)序列51所示碱基序列的第110～450位的区域和/或该互补链的区域，碱基数至少在5以上的寡核苷酸，2)由序列52～96所示碱基序列构成的寡核苷酸、3)上述1)或2)所述的寡核苷酸的互补链、4)在严格条件下可与上述1)～3)中任一个所述的寡核苷酸杂交的寡核苷酸、或、5)含有上述1)～4)中所述寡核苷酸中1个至数个碱基被变异(置换、缺失、插入或付加)的碱基序列的寡核苷酸，可从中选择、设计用作引物。
寡核苷酸可以通过众所周知的方法制造，例如可以通过化学合成制造。或者通过限制性内切酶等切天然核酸，可以使之变成或连接成上述那样的碱基序列的构成。具体来说，可以通过寡核苷酸合成装置(Applied Biosystems公司生产Expedite Model 8909 DNA合成仪)等进行合成。另外、变异(置换、缺失、插入或付加)1至数个碱基的寡核苷酸的合成法也可以使用众所周知的制造方法。另外，可以单独或适当组合使用部位特异的变异导入法、基因同源重组法、引物延伸法或PCR法，例如根据Molecular Cloning；A Laboratory Manual、2版、Sambrook等人编、Cold Spring Harbor Laboratory Prss，ColdSpring Harbor，New York，1989年；[Laboratory Manual基因工程]、村松正实编、丸善株式会社、1988年；[PCR Technology、DNA扩增的原理和应用]、Ehrlich，HE.编、Stockton Press、1989年等记载的方法，或改变的这些方法实施，例如可以利用Ulmer的技术(Science(1983)219：666)。
严格杂交条件可以选择一般都知道的条件。举一个例子，在含有50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠、pH7.6、5×Denhardt溶液、10％葡聚糖硫酸酯、和20μg/ml的DNA的溶液中，于42℃下杂交过夜后，于室温下在2×SSC的0.1％SDS中洗一次，然后在约65℃下用0.1×SSC的0.1％SDS洗二次的条件。
在本发明应当被扩增的核酸的模板由于是持家基因的mRNA，使用的引物需要设计成不扩增检体中含有的基因组DNA。具体来说，希望本发明引物组中含有的至少一个引物是包含横跨例如β-肌动蛋白或GAPDH的基因中多个外显子区域的引物。可以通过想办法将来自基因组DNA序列的扩增排除，有选择地扩增来自β-肌动蛋白或GAPDH的mRNA的序列。
(引物组)
使用本发明引物进行核酸扩增时，将至少2种引物组合作为引物组使用。在LAMP法中、将至少4种引物(FIP、F3引物、RIP、R3引物)组合后作为引物组使用。另外也可以组合1种以上回环引物作为引物组使用。
(RT-LAMP法)
RT-LAMP法是以RNA为模板的LAMP法，LAMP法的基本思路就象专利文献1所述那样。在RT-LAMP法中，在一个溶液中一方面由模板RNA合成cDNA，一方面合成了LAMP法的起点结构。具体来说，以下的1)步骤后、通过反复进行2)～5)步骤、反复进行DNA延伸，进行靶DNA的扩增。
1)FIP结合模板RNA链，与模板RNA链互补的DNA链延伸。该反应使用逆转录酶、例如来自AMV的逆转录酶等。
2)F3引物将上述1)中合成的从FIP开始的DNA链从模板RNA剥下，与模板RNA链互补的DNA链延伸。以后DNA链的延伸由DNA聚合酶催化进行。
3)RIP与上述2)中剥下的DNA链结合后DNA链延伸。
4)R3引物将上述3)中延伸的由RIP开始的DNA链剥下，与来自FIP的DNA链互补的DNA链延伸，合成LAMP法的起点结构。
5)在上述4)中被剥下的DNA链两端序列由于在同样DNA链序列中含有互补的序列，各自进行杂交，两端具有回环结构。
另外，存在着例如象BcaDNA聚合酶那样具有逆转录酶活性和DNA聚合酶活性两者活性的酶，使用这样的酶时，上述反应可以通过一个酶实施。
(测定方法)
在LAMP法中，由于合成的DNA链具有与自身序列互补的序列，所以其大部分可形成碱基对结合。利用该特征，可以进行扩增产物的检测。在溴化乙锭、SYBER GREEN I、或Pico Green那样的双链嵌入剂(インタ一カ一レ一タ一)荧光色素的存在下，使用本发明引物实施核酸扩增，可以观察到随着产物増加，荧光强度増大的现象。对该现象进行监测，可同时追踪在闭链系中DNA的扩增和荧光的增加(临床检查法提要、31版1318页；特开2001-242169号公报参照。以下简单称为「实时(real time)法」。)。
(试剂、试剂盒等)
使用本发明引物进行核酸检测时需要的各种试剂类可以预先进行包装，做成试剂盒。具体来说、可以将作为本发明的互补链合成引物，或作为置换用的引物所必需的各种寡核苷酸、具有逆转录活性的酶、成为互补链合成的底物的dNTP、进行链置换型的互补链合成的DNA聚合酶、赋予酶反应合适条件的缓冲液、以及根据需要用于反应生成物检测所必需的试剂类做成试剂盒提供。
本发明涉及到核酸扩增用引物和引物组、以及使用这些引物的核酸检测方法、核酸检测方法中使用的检测试剂、核酸检测试剂盒和核酸检测系统整体。
(实施例)
以下、通过实施例对本发明进行具体说明，但本发明并不限定于这些实施例。
(实施例1)β-肌动蛋白基因区域的选择
由序列1记载的碱基序列，使用探针设计软件研究适合LAMP法的β-肌动蛋白基因区域的位置。基因区域的选择，F1c和R1c通过Tm值为58.5～63.5℃、F2和R2通过Tm值为61.5～62.5℃、F3和R3通过Tm值为58.5～62.5℃选择基因区域，结果选择了如下所示序列1记载的碱基序列上第240～1060位区域和其互补链的区域中含有的序列。
F1c：位于序列1记载序列的互补链中的基因区域
343-327 5′-tggccttgggttcagg-3′ (序列2)
400-381 5′-cgtacatggctggggtgttg-3′ (序列3)
822-803 5′-gatgccacaggactccatgc-3′ (序列4)
838-817 5′-tgaaggtagtttcgtggatgcc-3′ (序列5)
922-904 5′-cagggtacatggtggtgcc-3′ (序列6)
F2：序列1记载的序列上的基因区域
265-284 5′-accttctacaatgagctgcg-3′ (序列7)
341-357 5′-ccaaccgcgagaagatg-3′ (序列8)
748-766 5′-attggcaatgagcggttcc-3′ (序列9)
750-766 5′-tggcaatgagcggttcc-3′ (序列10)
774-790 5′-tgaggcactcttccagc-3′ (序列11)
782-799 5′-tcttccagccttccttcc-3′ (序列12)
851-868 5′-agtgtgacgtggacatcc-3′ (序列13)
F3：序列1记载的序列上的基因区域
240-259 5′-cgacatggagaaaatctggc-3′ (序列14)
274-290 5′-aatgagctgcgtgtggc-3′ (序列15)
718-734 5′-tacgagctgcctgacgg-3′ (序列16)
750-766 5′-tggcaatgagcggttcc-3′ (序列10)
818-837 5′-gcatccacgaaactaccttc-3′ (序列17)
R1c：序列1记载的序列上的基因区域
346-366 5′-cgcgagaagatgacccagatc-3′ (序列18)
402-423 5′-tgctatccaggctgtgctatcc-3′ (序列19)
848-868 5′-tgaagtgtgacgtggacatcc-3′ (序列20)
857-876 5′-acgtggacatccgcaaagac-3′ (序列21)
925-945 5′-attgccgacaggatgcagaag-3′ (序列22)
R2：处于序列1记载的序列的互补链中的基因区域
414-396 5′-agcctggatagcaacgtac-3′ (序列23)
461-444 5′-tccatcacgatgccagtg-3′ (序列24)
921-905 5′-agggtacatggtggtgc-3′ (序列25)
925-909 5′-tgccagggtacatggtg-3′ (序列26)
929-911 5′-gcaatgccagggtacatgg-3′ (序列27)
1011-994 5′-gtacttgcgctcaggagg-3′ (序列28)
R3：处于序列1记载的序列的互补链中的基因区域
454-438 5′-cgatgccagtggtacgg-3′ (序列29)
497-480 5′-tagatgggcacagtgtgg-3′ (序列30)
947-930 5′-tccttctgcatcctgtcg-3′ (序列31)
1059-1043 5′-ctggaaggtggacagcg-3′ (序列32)
loop F：处于序列1记载的序列的互补链中的基因区域
816-801 5′-acaggactccatgccc-3′ (序列33)
loop R：序列1记载的序列上的基因区域
878-895 5′-tgtacgccaacacagtgc-3′ (序列34)
(实施例2)β-肌动蛋白用引物的设计
从选择区域的序列得到适用于LAMP法的β-肌动蛋白用的如下核酸扩增用引物。
FIP：(连接区域F1c的碱基序列和F2的碱基序列的引物)
AFA-1 (序列35)连接序列2和7的序列
AFA-2 (序列36)连接序列3和8的序列
AFA-4 (序列37)连接序列5和11的序列
AFA-4a (序列38)连接序列5和12的序列
AFA-4c (序列39)连接序列5和10的序列
AFA-4d (序列40)连接序列4和9的序列
AFA-4e (序列41)连接序列4和10的序列
AFA-6 (序列42)连接序列6和13的序列
RIP：(连接区域R1c的碱基序列和R2的碱基序列的引物)
ARA-1 (序列43)连接序列18和23的序列
ARA-2 (序列44)连接序列19和24的序列
ARA-4 (序列45)连接序列20和25的序列
ARA-4a (序列46)连接序列20和27的序列
ARA-4b (序列47)连接序列20和26的序列
ARA-4d (序列48)连接序列21和27的序列
ARA-4e (序列49)连接序列21和26的序列
ARA-6 (序列50)连接序列22和28的序列
F3引物：(与F3区域的碱基序列同一的序列)
AF3-1 (序列14)
AF3-2 (序列15)
AF3-4 (序列10)
AF3-6 (序列17)
AF3-9 (序列16)
R3引物：(与R3区域的碱基序列同一的序列)
AR3-1 (序列29)
AR3-2 (序列30)
AR3-4 (序列31)
AR3-6 (序列32)
回环引物：
(与loop F或loop R区域的碱基序列同一的序列)
AD-LPF1 (序列33)
AD-LPR1 (序列34)
(实施例3)GAPDH基因区域的选择
由序列51记载碱基序列，利用探针设计软件研究适合于LAMP法的GAPDH基因区域的位置。基因区域的选择，F1c和R1C通过Tm值为58.5～63.5℃、F2和R2通过Tm值为61.5～62.5℃、F3和R3通过Tm值为58.5～62.5℃选择基因区域，结果选择了如下所示的序列51记载的碱基序列上第110～450位的区域含有的序列。
F1c：位于序列51记载的序列的互补链中的基因区域
213-192 5′-tccattgatgacaagcttcccg-3′ (序列52)
236-217 5′-tcctggaagatggtgatggg-3′ (序列53)
246-228 5′-gggatctcgctcctggaag-3′ (序列54)
284-265 5′-acgtactcagcgccagcatc-3′ (序列55)
335-316 5′-aaatgagccccagccttctc-3′ (序列56)
F2：序列51记载的序列上的基因区域
152-169 5′-ccacccatggcaaattcc-3′ (序列57)
163-180 5′-aaattccatggcaccgtc-3′ (序列58)
179-195 5′-tcaaggctgagaacggg-3′ (序列59)
217-235 5′-cccatcaccatcttccagg-3′ (序列60)
276-293 5′-tgagtacgtcgtggagtc-3′ (序列61)
F3：序列51记载的序列上的基因区域
103-120 5′-gaccccttcattgacctc-3′ (序列62)
159-176 5′-tggcaaattccatggcac-3′ (序列63)
163-180 5′-aaattccatggcaccgtc-3′ (序列58)
227-244 5′-tcttccaggagcgagatc-3′ (序列64)
R1c：序列51记载的序列上的基因区域
216-235 5′-tcccatcaccatcttccagg-3′ (序列65)
248-268 5′-ccaaaatcaagtggggcgatg-3′ (序列66)
254-271 5′-tcaagtggggcgatgctg-3′ (序列67)
305-323 5′-tcaccaccatggagaaggc-3′ (序列68)
338-354 5′-aggggggagccaaaagg-3′ (序列69)
R2：处于序列51记载的序列的互补链上的基因区域
295-279 5′-tggactccacgacgtac-3′ (序列70)
305-289 5′-aagacgccagtggactc-3′ (序列71)
310-294 5′-tggtgaagacgccagtg-3′ (序列72)
324-308 5′-agccttctccatggtgg-3′ (序列73)
327-311 5′-cccagccttctccatgg-3′ (序列74)
365-346 5′-gagatgatgacccttttggc-3′ (序列75)
399-383 5′-catgacgaacatggggg-3′ (序列76)
R3：处于序列51记载的序列的互补链上的基因区域
324-308 5′-agccttctccatggtgg-3′ (序列73)
365-346 5′-gagatgatgacccttttggc-3′ (序列75)
399-383 5′-catgacgaacatggggg-3′ (序列76)
445-426 5′-tgctgatgatcttgaggctg-3′ (序列77)
loop F：处于序列51记载的序列的互补链上的基因区域
227-212 5′-atggtgatgggatttc-3′ (序列78)
loop R：序列51记载的序列上的基因领域
275-293 5′-ctgagtacgtcgtggagtc-3′ (序列79)
(实施例4)GAPDH引物的设计
从选择的区域的序列得到适用于LAMP法的GAPDH用的以下核酸扩增用引物。
FIP：(连接区域F1c的碱基序列和F2的碱基序列的引物)
FA-2 (序列80)连接序列52和57的序列
FA-3 (序列81)连接序列54和59的序列
FA-3b (序列82)连接序列54和58的序列
FA-3d (序列83)连接序列53和59的序列
FA-3e (序列84)连接序列53和58的序列
FA-3g (序列85)连接序列53和57的序列
FA-5 (序列86)连接序列55和60的序列
FA-7 (序列87)连接序列56和61的序列
RIP：(连接区域R1c的碱基序列和R2的碱基序列的引物)
RA-2 (序列88)连接序列65和80的序列
RA-3 (序列89)连接序列67和83的序列
RA-3a (序列90)连接序列67和84的序列
RA-3b (序列91)连接序列67和82的序列
RA-3c (序列92)连接序列67和81的序列
RA-3d (序列93)连接序列66和83的序列
RA-3e (序列94)连接序列66和84的序列
RA-5 (序列95)连接序列68和75的序列
RA-7 (序列96)连接序列69和76的序列
F3：(与F3領域的碱基序列同一的序列)
F3-3 (序列63)
F3-4 (序列68)
F3-6 (序列64)
F3-8 (序列62)
R3：(与R3区域的碱基序列同一的序列)
R3-2 (序列73)
R3-3 (序列75)
R3-5 (序列76)
R3-7 (序列77)
回环引物：
(与loop F或loop R区域的碱基序列同一的序列)
GC-LPF1(序列78)
GC-LPR1(序列79)
(实验例1)
对使用以表1各组合的实施例2记载的β-肌动蛋白用引物利用RT-LAMP法从开始反应后直至确认扩增为止所需要的时间进行研究。
1)人β-肌动蛋白的mRNA样品
作为人β-肌动蛋白的模板使用市售的人总RNA(来自Raji细胞、ABI公司生产)。
2)β-肌动蛋白用引物
各引物使用(表1)的组合。
(表1)引物组和扩增确认时间
3)反应液组成
dNTPs(GIBCO公司生产) 0.4mM
MgSO4 2mM
二硫苏糖醇(dithiothreitol) 5mM
甜菜碱(betaine)(Sigma公司生产) 640mM
Thermopol buffer(New England BioLabs公司生产)
AMV逆转录酶(Promega公司生产) 1.25U
Bst DNA聚合酶(New England BioLabs公司生产) 16U
溴化乙锭(ethidium bromide) 0.125mg/ml
各引物
FIP 40pmol、 RIP 40pmol
F3引物 5pmol、 R3引物 5pmol
4)RT-LAMP法
向含有上述4种引物的反应液23μl中添加RNA样品2μl(含有20ng的人总RNA)，于65℃加温1小时。
5)扩增的确认
扩增产物由于具有双链结构，溴化乙锭嵌入后发荧光。该荧光强度的增加用ABI公司生产PRISM7700通过实时(real time)法进行测定。
6)结果
表1给出了使用各引物组反应时直至确认β-肌动蛋白扩增为止的时间。该结果表明，确认扩增在各引物组中最大为45分，大多数情形是在30分以内。
(实验例2)
在实验例1中研究的β-肌动蛋白用引物组中选择确认在最短时间扩增的引物组，再使用组合有回环引物的引物组，研究利用RT-LAMP法测定时的灵敏度。
1)人β-肌动蛋白的mRNA样品
与实验例1同样进行。
2)引物组
(表2)引物组
3)反应液组成
向与实验例1同样的组成中再加入终浓度各为5pmol的F3回环引物和R3回环引物。
4)RT-LAMP法
与实验例1同样进行。向含有上述6种引物的反应液23μl中添加RNA样品2μl(含有20ng的人总RNA)，于65℃加温1小时。
5)扩增的确认
与实验例1同样进行。
6)结果
图1给出了研究结果。该结果表明，β-肌动蛋白基因的mRNA模板量越多，越可确认在短时间扩增。即使在模板量为0.02ng时30分以内也确认扩增，模板量为20ng时15分左右可确认扩增。
(实验例3)
研究在LS180细胞(大肠癌细胞株)和Raji细胞(Burkitt淋巴瘤细胞株)的培养细胞中进行β-肌动蛋白的扩增。
即、对于细胞角蛋白为阳性的LS180细胞溶液以及细胞角蛋白在用阴性的Raji细胞溶液稀释情形的各浓度LS180细胞溶液样品中进行β-肌动蛋白的扩增进行研究，研究在测定细胞角蛋白的肿瘤标志时作为数据修正对照能否使用β-肌动蛋白。
1)样品
制备LS180细胞和Raji细胞的总细胞数为8000的样品。使总细胞数8000中的LS180细胞数为8000、800、80、8和0。
2)β-肌动蛋白用引物
选择与实验例2同样的引物。
3)反应液组成
使用与实验例2同样组成的反应液。
4)RT-LAMP法
与实验例2同样进行。
5)核酸的检测
与实验例2同样向含有6种引物的反应液23μl中添加2μl细胞的悬浮液，于65℃加温1小时。
6)结果
结果如图2所示。其结果即使当LS180细胞和Raji细胞的比率不同时，β-肌动蛋白在15分左右也可确认扩增。该结果表明，不管有无肿瘤标志，也可确认在人细胞中β-肌动蛋白进行了组成表达，β-肌动蛋白可以作为LAMP法中数据修正的对照使用。
(实验例4)
对以表3记载的各组合使用实施例4记载的GAPDH用引物，利用RT-LAMP法从反应开始后直至确认扩增为止需要的时间进行研究。
1)GAPDH的mRNA样品
作为GAPDH的模板使用市售的人总RNA(来自Raji细胞、ABI公司生产)。
2)GAPDH用引物
各引物使用(表3)的组合引物。
(表3)引物组和扩增确认时间
3)反应液组成
使用与实验例1同样组成的反应液。
4)RT-LAMP法
与实验例1同样进行。向含有上述4种引物的反应液23μl中添加RNA样品2μl(含有20ng的人总RNA)、于65℃下加温1小时。
5)扩增的确认
与实验例1同样进行。
6)结果
表3给出了使用各引物组反应时直至确认GAPDH扩增为止的时间。其结果表明，扩增在各引物组中最大为45分，大部分情形在30分以内。
(实验例5)
实验例4中研究的GAPDH用引物组中，选择在最短时间内确认扩增的引物组，再使用组合有回环引物的引物组，研究通过RT-LAMP法进行测定时的灵敏度。
1)人GAPDH的mRNA样品
作为GAPDH模板、使用市售人总RNA(来自Raji细胞、ABI公司生产)。
2)引物组
(表4)引物组
3)反应液组成
使用与实验例2同样组成的反应液。
4)RT-LAMP法
与实验例2同样进行。
5)核酸的检测
与实验例2同样进行。
6)结果
图3给出了研究结果。该结果表明，GAPDH的mRNA模板量越多，确认越可在短时间扩增。而且即使模板量为0.02ng时也可确认在30分以内进行了扩增，模板量为20ng时可确认10分左右就扩增了。
(实验例6)
在LS180细胞(大肠癌细胞株)和Raji细胞(Burkitt淋巴瘤细胞株)的培养细胞中进行GAPDH扩增研究。
即，对于细胞角蛋白在用阳性的LS180细胞溶液以及细胞角蛋白用阴性的Raji细胞溶液稀释的情形的各浓度LS180细胞溶液样品中进行GAPDH扩增的研究，研究作为数据修正的对照在测定细胞角蛋白的肿瘤标志时能否使用GAPDH。
1)样品
制备LS180细胞和Raji细胞的总细胞数为8000的样品。使总细胞数8000中的LS180细胞数为8000、800、80、8和0。
2)GAPDH用引物组
选择与实验例5同样的引物组。
3)反应液组成
使用与实验例2同样组成的反应液。
4)RT-LAMP法
与实验例2同样进行。向与实验例5同样的含有6种引物反应液23μl中添加细胞悬浮液2μl，于65℃加温1小时。
5)核酸的检测
与实验例2同样进行。
6)结果
图4给出了实验结果。该结果表明，即使LS180细胞和Raji细胞的比率不同时，也可确认GAPDH10分左右扩增。这表明，不管有无肿瘤标志，都可确认人细胞中GAPDH进行了组成表达，作为LAMP法中的数据修正对照可以使用GAPDH。
产业上利用的可能性
就象以上说明的那样，如果使用本发明的引物或引物组，实施LAMP法，最快时，15分以内就可确认β-肌动蛋白或GAPDH的扩增。
另外不管有无细胞角蛋白那样的肿瘤标志，可知通过确认来自人细胞的β-肌动蛋白或GAPDH的存在，可以使用他们作为LAMP法中数据修正的对照。
所以，使用本发明的引物、或引物组，在用核酸扩增手段进行癌转移诊断时，可以缩短诊断需要的时间，是具有可靠性的诊断。
序列表
<110>希森美康株式会社
<120>用于持家基因mRNA检测的核酸扩增用引物和使用该引物的检查方法
<130>GP02-1019
<150>JP P2002-043866
<151>2002-02-20
<150>JP P2002-043867
<151>2002-02-20
<160>96
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1128
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
atggatgatg atatcgccgc gctcgtcgtc gacaacggct ccggcatgtg caaggccggc 60
ttcgcgggcg acgatgcccc ccgggccgtc ttcccctcca tcgtggggcg ccccaggcac 120
cagggcgtga tggtgggcat gggtcagaag gattcctatg tgggcgacga ggcccagagc 180
aagagaggca tcctcaccct gaagtacccc atcgagcacg gcatcgtcac caactgggac 240
gacatggaga aaatctggca ccacaccttc tacaatgagc tgcgtgtggc tcccgaggag 300
caccccgtgc tgctgaccga ggcccccctg aaccccaagg ccaaccgcga gaagatgacc 360
cagatcatgt ttgagacctt caacacccca gccatgtacg ttgctatcca ggctgtgcta 420
tccctgtacg cctctggccg taccactggc atcgtgatgg actccggtga cggggtcacc 480
cacactgtgc ccatctacga ggggtatgcc ctcccccatg ccatcctgcg tctggacctg 540
gctggccggg acctgactga ctacctcatg aagatcctca ccgagcgcgg ctacagcttc 600
accaccacgg ccgagcggga aatcgtgcgt gacattaagg agaagctgtg ctacgtcgcc 660
ctggacttcg agcaagagat ggccacggct gcttccagct cctccctgga gaagagctac 720
gagctgcctg acggccaggt catcaccatt ggcaatgagc ggttccgctg ccctgaggca 780
ctcttccagc cttccttcct gggcatggag tcctgtggca tccacgaaac taccttcaac 840
tccatcatga agtgtgacgt ggacatccgc aaagacctgt acgccaacac agtgctgtct 900
ggcggcacca ccatgtaccc tggcattgcc gacaggatgc agaaggagat cactgccctg 960
gcacccagca caatgaagat caagatcatt gctcctcctg agcgcaagta ctccgtgtgg 1020
atcggcggct ccatcctggc ctcgctgtcc accttccagc agatgtggat cagcaagcag 1080
gagtatgacg agtccggccc ctccatcgtc caccgcaaat gcttctag 1128
<210>2
<211>16
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>2
tggccttggg ttcagg 16
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>3
cgtacatggc tggggtgttg 20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>4
gatgccacag gactccatgc 20
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>5
tgaaggtagt ttcgtggatg cc 22
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>6
cagggtacat ggtggtgcc 19
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>7
accttctaca atgagctgcg 20
<210>8
<211>17
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>8
ccaaccgcga gaagatg 17
<210>9
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>9
attggcaatg agcggttcc 19
<210>10
<211>17
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>10
tggcaatgag cggttcc 17
<210>11
<211>17
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>11
tgaggcactc ttccagc 17
<210>12
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>12
tcttccagcc ttccttcc 18
<210>13
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>13
agtgtgacgt ggacatcc 18
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>14
cgacatggag aaaatctggc 20
<210>15
<211>17
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>15
aatgagctgc gtgtggc 17
<210>16
<211>17
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>Designed DNA based on beta-acitn
<400>16
tacgagctgc ctgacgg 17
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>17
gcatccacga aactaccttc 20
<210>18
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>18
cgcgagaaga tgacccagat c 21
<210>19
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>19
tgctatccag gctgtgctat cc 22
<210>20
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>20
tgaagtgtga cgtggacatc c 21
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>21
acgtggacat ccgcaaagac 20
<210>22
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>22
attgccgaca ggatgcagaa g 21
<210>23
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>23
agcctggata gcaacgtac 19
<210>24
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>24
tccatcacga tgccagtg 18
<210>25
<211>17
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>25
agggtacatg gtggtgc 17
<210>26
<211>17
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>Designed DNA based on beta-acitn
<400>26
tgccagggta catggtg 17
<210>27
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>27
gcaatgccag ggtacatgg 19
<210>28
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>28
gtacttgcgc tcaggagg 18
<210>29
<211>17
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>29
cgatgccagt ggtacgg 17
<210>30
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>30
tagatgggca cagtgtgg 18
<210>31
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>31
tccttctgca tcctgtcg 18
<210>32
<211>17
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>32
ctggaaggtg gacagcg 17
<210>33
<211>16
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>33
acaggactcc atgccc 16
<210>34
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>34
tgtacgccaa cacagtgc 18
<210>35
<211>36
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>35
tggccttggg ttcaggacct tctacaatga gctgcg 36
<210>36
<211>37
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>36
cgtacatggc tggggtgttg ccaaccgcga gaagatg 37
<210>37
<211>39
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>37
tgaaggtagt ttcgtggatg cctgaggcac tcttccagc 39
<210>38
<211>40
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>38
tgaaggtagt ttcgtggatg cctcttccag ccttccttcc 40
<210>39
<211>39
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>39
tgaaggtagt ttcgtggatg cctggcaatg agcggttcc 39
<210>40
<211>37
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>40
gatgccacag gactccatgc tggcaatgag cggttcc 37
<210>41
<211>39
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>41
gatgccacag gactccatgc attggcaatg agcggttcc 39
<210>42
<211>38
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>42
gatgccacag gactccatgc agtgtgacgt ggacatcc 38
<210>43
<211>40
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>43
cgcgagaaga tgacccagat cagcctggat agcaacgtac 40
<210>44
<211>40
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>44
tgctatccag gctgtgctat cctccatcac gatgccagtg 40
<210>45
<211>38
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>45
tgaagtgtga cgtggacatc cagggtacat ggtggtgc 38
<210>46
<211>40
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>46
tgaagtgtga cgtggacatc cgcaatgcca gggtacatgg 40
<210>47
<211>38
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>47
tgaagtgtga cgtggacatc ctgccagggt acatggtg 38
<210>48
<211>39
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>48
acgtggacat ccgcaaagac gcaatgccag ggtacatgg 39
<210>49
<211>37
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>49
acgtggacat ccgcaaagac tgccagggta catggtg 37
<210>50
<211>39
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌动蛋白设计的DNA
<400>50
attgccgaca ggatgcagaa ggtacttgcg ctcaggagg 39
<210>51
<211>1008
<212>DNA
<213>人
<400>51
atggggaagg tgaaggtcgg agtcaacgga tttggtcgta ttgggcgcct ggtcaccagg 60
gctgctttta actctggtaa agtggatatt gttgccatca atgacccctt cattgacctc 120
aactacatgg tttacatgtt ccaatatgat tccacccatg gcaaattcca tggcaccgtc 180
aaggctgaga acgggaagct tgtcatcaat ggaaatccca tcaccatctt ccaggagcga 240
gatccctcca aaatcaagtg gggcgatgct ggcgctgagt acgtcgtgga gtccactggc 300
gtcttcacca ccatggagaa ggctggggct catttgcagg ggggagccaa aagggtcatc 360
atctctgccc cctctgctga tgcccccatg ttcgtcatgg gtgtgaacca tgagaagtat 420
gacaacagcc tcaagatcat cagcaatgcc tcctgcacca ccaactgctt agcacccctg 480
gccaaggtca tccatgacaa ctttggtatc gtggaaggac tcatgaccac agtccatgcc 540
atcactgcca cccagaagac tgtggatggc ccctccggga aactgtggcg tgatggccgc 600
ggggctctcc agaacatcat ccctgcctct actggcgctg ccaaggctgt gggcaaggtc 660
atccctgagc tgaacgggaa gctcactggc atggccttcc gtgtccccac tgccaacgtg 720
tcagtggtgg acctgacctg ccgtctagaa aaacctgcca aatatgatga catcaagaag 780
gtggtgaagc aggcgtcgga gggccccctc aagggcatcc tgggctacac tgagcaccag 840
gtggtctcct ctgacttcaa cagcgacacc cactcctcca cctttgacgc tggggctggc 900
attgccctca acgaccactt tgtcaagctc atttcctggt atgacaacga atttggctac 960
agcaacaggg tggtggacct catggcccac atggcctcca aggagtaa 1008
<210>52
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>52
tccattgatg acaagcttcc cg 22
<210>53
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>53
tcctggaaga tggtgatggg 20
<210>54
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>54
gggatctcgc tcctggaag 19
<210>55
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>55
acgtactcag cgccagcatc 20
<210>56
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>56
aaatgagccc cagccttctc 20
<210>57
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>57
ccacccatgg caaattcc 18
<210>58
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>58
aaattccatg gcaccgtc 18
<210>59
<211>17
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>59
tcaaggctga gaacggg 17
<210>60
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>60
cccatcacca tcttccagg 19
<210>61
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>61
tgagtacgtc gtggagtc 18
<210>62
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>62
gaccccttca ttgacctc 18
<210>63
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>63
tggcaaattc catggcac 18
<210>64
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>64
tcttccagga gcgagatc 18
<210>65
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>65
tcccatcacc atcttccagg 20
<210>66
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>66
ccaaaatcaa gtggggcgat g 21
<210>67
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>67
tcaagtgggg cgatgctg 18
<210>68
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>68
tcaccaccat ggagaaggc 19
<210>69
<211>17
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>69
aggggggagc caaaagg 17
<210>70
<211>17
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>70
tggactccac gacgtac 17
<210>71
<211>17
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>71
aagacgccag tggactc 17
<210>72
<211>17
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>72
tggtgaagac gccagtg 17
<210>73
<211>17
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>73
agccttctcc atggtgg 17
<210>74
<211>17
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>74
cccagccttc tccatgg 17
<210>75
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>75
gagatgatga cccttttggc 20
<210>76
<211>17
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>76
catgacgaac atggggg 17
<210>77
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>77
tgctgatgat cttgaggctg 20
<210>78
<211>16
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>78
atggtgatgg gatttc 16
<210>79
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>79
ctgagtacgt cgtggagtc 19
<210>80
<211>40
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>80
tccattgatg acaagcttcc cgccacccat ggcaaattcc 40
<210>81
<211>36
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>81
gggatctcgc tcctggaagt caaggctgag aacggg 36
<210>82
<211>37
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>82
gggatctcgc tcctggaaga aattccatgg caccgtc 37
<210>83
<211>37
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>83
tcctggaaga tggtgatggg tcaaggctga gaacggg 37
<210>84
<211>38
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>84
tcctggaaga tggtgatggg aaattccatg gcaccgtc 38
<210>85
<211>38
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>85
tcctggaaga tggtgatggg ccacccatgg caaattcc 38
<210>86
<211>39
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>86
acgtactcag cgccagcatc cccatcacca tcttccagg 39
<210>87
<211>38
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>87
aaatgagccc cagccttctc tgagtacgtc gtggagtc 38
<210>88
<211>37
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>Desigend DNA based on GAPDH
<400>88
tcccatcacc atcttccagg tggactccac gacgtac 37
<210>89
<211>35
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>89
tcaagtgggg cgatgctgag ccttctccat ggtgg 35
<210>90
<211>35
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>90
tcaagtgggg cgatgctgcc cagccttctc catgg 35
<210>91
<211>35
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>91
tcaagtgggg cgatgctgtg gtgaagacgc cagtg 35
<210>92
<211>35
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>92
tcaagtgggg cgatgctgaa gacgccagtg gactc 35
<210>93
<211>38
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>93
ccaaaatcaa gtggggcgat gagccttctc catggtgg 38
<210>94
<211>38
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>94
ccaaaatcaa gtggggcgat gcccagcctt ctccatgg 38
<210>95
<211>39
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>95
tcaccaccat ggagaaggcg agatgatgac ccttttggc 39
<210>96
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH设计的DNA
<400>96
aggggggagc caaaaggcat gacgaacatg gggg 34
机译： 使用核酸扩增引物和管家基因的mRNA检测用引物的检查方法
机译： 使用核酸扩增引物和管家基因的mRNA检测用引物的检查方法
机译： 使用引物和所述引物进行核酸扩增以管家基因mRNA检测的检查方法
