杜鹃兰离体培养与快速繁殖生物技术方法

摘要

本发明属于植物离体快繁技术领域，主要提供了紧缺难繁药用植物杜鹃兰的离体培养与快速繁殖的关键生物技术及其在紧缺难繁中药材野生变家种中种子种苗快速繁殖的方法。具体涉及杜鹃兰离体培养及植株生长过程中必需的共生真菌的分离、培养与真菌提取物的制备，杜鹃兰原球茎的诱导、增殖、根和芽的分化及植株生长调控等方法，解决了杜鹃兰人工繁殖的技术难题，为该药材的GAP种植奠定了基础。

说明书

一、技术领域

本发明属于植物离体快繁技术领域。

二、背景技术

杜鹃兰[Cremastra appendiculata(D.Don.)Makino]为兰科杜鹃兰属的野生珍稀药用植物，主要分布于东亚地区，尤以中国的贵州、四川为多(Acta Phytotaxonomica Sinica.2003，41：263-266)。以假鳞茎入药，药材称毛慈菇，味辛、甘，性寒，有小毒。有清热解毒、润肺止咳、活血止痛、消肿散结等功效，内用可抗肝癌、乳腺癌、子宫癌等(Journalof Traditional Chinese Medicine.1996，16：243-246；Planta Medica.2004，70：171-173)，外用于治疮毒、蛇虫咬伤、皮肤烫伤或烧伤等。杜鹃兰自然储量极为稀少，加之无计划的人为采挖，野生资源濒临枯竭。目前该药材的市场需求量上千吨，可野生药材的最大供给量不足100吨，药材价格高达200元/kg。为挽救这一珍稀物种以确保其资源的永续利用，同时也为满足该药材的市场需求，及时开展该药用植物野生变家种的工作便是当务之急。

然而，种子种苗的培育是中药材人工种植首先必须解决的关键问题。由于杜鹃兰几乎不能以种子繁殖，假鳞茎是其唯一的繁殖器官。而该植物每个假鳞茎在一年生长期中只能产生1个新的假鳞茎，故繁殖速度极其缓慢，致使人工种植难以规模化进行。加之该植物正常生长需要与特定的真菌共生，更是增加了人工种植的难度。因此，要实现杜鹃兰的人工种植，则必须首先解决其种子种苗的快速高效繁殖技术问题。其次是分离、鉴定其共生真菌的种类并加以培养、利用。

近年来，有关兰科植物的组织培养与快速繁殖研究虽取得了突破性进展，但在兰科部分种属的快繁生物技术上仍存在相当大的困难，杜鹃兰的繁殖便是一例。一些研究者尝试了杜鹃兰的组织培养与快速繁殖研究，但几乎都以失败而告终，原因在于没有弄清该植物与真菌共生的特性。从杜鹃兰植株分离的外植体几乎不能产生愈伤组织，而是在适宜条件下形成原球茎，再由原球茎分化出芽和根，进一步发育成植株。原球茎的形成、芽和根的产生、植株生长发育等过程，均需有特定真菌或真菌提取物作用。

三、发明内容

本发明解决的主要问题是珍稀紧缺难繁药用植物杜鹃兰的离体快速繁殖技术，即采用现代生物技术获得杜鹃兰原球茎、再生植株及其增殖群体，为按照“中药材生产质量管理规范”(GAP)进行该药用植物的人工种植奠定了基础。本发明涉及杜鹃兰的组织细胞代谢与生长发育，离体培养外植体的选择与培养条件的优化及离体培养技术，杜鹃兰的共生真菌种类及其相互作用，共生真菌分离及培养方法，共生真菌提取物制备及成分分析，共生真菌提取物的作用机理等。

在本发明中，术语“原球茎”是指通过离体培养兰科植物顶端分生组织、腋芽或不定芽所形成的可以分化发育成植株的结构。原球茎是兰科植物组织培养的中间结构，在适宜的培养基上，原球茎可以被扩繁。

(一)本发明中的材料

杜鹃兰[Cremastra appendiculata(D.Don.)Makino]采自其地道产区黔东南，其共生真菌从杜鹃兰植株分离获得。

(二)本发明的技术方案

1.杜鹃兰共生真菌的分离、培养与真菌提取物的制备

采集野生杜鹃兰假鳞茎经消毒后，切成小块接种于PDA平皿内，25℃恒温培养，待从切块内长出真菌菌丝后，挑取尖端菌丝纯化培养、鉴定。

将分离、纯化的杜鹃兰共生真菌采用麦麸培养基进行液体振荡培养，培养物经双层纱布过滤获得菌丝体。菌丝体经干燥、粉碎后，用甲醇回流法提取以获得浸膏(真菌提取物)。

2.杜鹃兰原球茎的诱导培养

将新采集的野生杜鹃兰假鳞茎消毒后，切成带1～2个芽眼的小块作为外植体，接种于含有共生真菌提取物的诱导培养基上，其培养基组成为：MS+BA(1.0～3.0)mgl^-1+2，4-D(0.3～1.0)mgl^-1+蔗糖(25.0～35.0)gl^-1+共生真菌提取物(5.0～15.0)mgl^-1+PVP(0.3～0.6)gl^-1+琼脂(6.0～10.0)gl^-1，pH5.8～6.0，以培养基中不加共生真菌提取物作为对照。待原球茎长出后，将其用作增殖培养的材料。

3.杜鹃兰原球茎增殖培养基的筛选、原球茎增殖培养与植株再生

采用正交试验法筛选原球茎增殖的适宜培养基，将诱导所得的杜鹃兰原球茎接种于适宜增殖培养基上，待形成足够的原球茎增殖群体后，再将其转入适于芽和根分化的培养基上以获得再生植株(试管苗)。带根的杜鹃兰试管苗经炼苗后即可移栽。

四、具体实施方式

1.杜鹃兰共生真菌的分离、培养与真菌提取物的制备

(1)共生真菌的分离与鉴定

分离：将新采集的野生杜鹃兰假鳞茎经流水冲洗12h并用无菌水冲洗干净后，切成0.5cm³左右的小块。用75％乙醇表面消毒3～5s，无菌水冲洗3次，再用0.1％HgCl₂表面消毒10min，无菌水冲洗5次后，将切块接种于PDA平皿内，25℃恒温培养，待从切块内长出真菌菌丝后，挑取尖端菌丝纯化培养。

鉴定：已鉴定出2个属的共生真菌。

①简梗孢霉属Chromosporium sp.。在麦麸糖培养基上，菌落菌丝初白色、污白色，后黄白色、浅土黄色，短绒毛状。

②柱孢霉属Cylindrocarpon sp.I。在麦麸糖培养基上，菌落菌丝白色、污白色至淡黄褐色，短绒毛状。菌丝分泌色素使培养基呈红褐色至黑褐色。

(2)共生真菌液体培养及菌丝体收集

液体培养采用麦麸培养基：麦麸30g，葡萄糖20g，KH₂PO₄ 0.75g，MgSO₄ 1.5g，加水至1000mL。挑取纯化菌丝接种，25℃振荡培养，转速120r/min。培养10～15d后，培养物经双层纱布过滤获得菌丝体，蒸馏水冲洗菌丝体3次，用滤纸吸干水分，干燥后低温保存。

(3)共生真菌提取物的制备

将干菌丝体粉碎后，甲醇回流提取7次，得浸膏(真菌提取物)，置4℃保存备用。

2.杜鹃兰离体培养外植体的选择与原球茎的诱导

将新采集的野生杜鹃兰假鳞茎经流水冲洗12h并用无菌水冲洗干净后，用70％乙醇表面消毒1min，无菌水冲洗3次，再用0.1％HgCl₂表面消毒10min，无菌水冲洗5次后，将假鳞茎切成带1～2个芽眼的小块作为外植体，无菌条件下接种于150ml容量的装有40ml培养基的三角瓶中。培养基预先在121℃下高压灭菌15min，培养基成分为MS+BA2.0mgl^-1+2，4-D 0.5mgl^-1+蔗糖30gl^-1+共生真菌提取物10mgl^-1+PVP 0.5gl^-1+琼脂8.0gl^-1，pH 5.8，以培养基中不加共生真菌提取物作为对照。25±0.5℃恒温培养，每日光照12h，光照强度为55μmolm^-2s^-1。约6周左右获得原球茎，将其用作增殖培养的材料。从原球茎的诱导结果发现，在诱导假鳞茎不定芽产生原球茎的培养基中不加共生真菌提取物时，所诱导产生的原球茎数目只有加共生真菌提取物的19.2％(表1)，其生长状况也较差，说明共生真菌或其提取物为杜鹃兰原球茎形成与生长所必需。

表1：共生真菌提取物对诱导杜鹃兰假鳞茎不定芽产生原球茎的效果

诱导培养基           6周后各培养瓶中诱导产生的原球茎数目  原球茎总和

基本培养基+共生真

                     13  17  16  18  15  17  15  15  14  16  156

菌提取物10mgl^-1

基本培养基           3   5   1   3   4   2   2   3   4   3   30

注：①基本培养基：MS+BA 2.0mgl^-1+2，4-D 0.5mgl^-1+sucrose 30gl^-1+agar 8.0gl^-1+PVP 0.5gl^-1，

pH5.8；②外植体：含1个不定芽芽眼的假鳞茎切块

3.杜鹃兰原球茎增殖培养基筛选、原球茎增殖培养与植株再生

在预实验基础上，选择培养基组分中对原球茎增殖影响较大的3个因素(蔗糖、BA、2，4-D)并各设3个浓度水平(表2)按L₉(3⁴)进行正交试验。原球茎增殖培养基基本组成为：MS+BA+2，4-D+蔗糖+PVP 0.5gl^-1+琼脂8.0gl^-1，pH5.8。试验分处理组和对照组，处理组各培养基中均按10mgl^-1加入共生真菌提取物，对照组各培养基中均不加共生真菌提取物。将所获得的杜鹃兰原球茎按1粒/瓶接种于相应的增殖培养基上，25±0.5℃恒温培养，每日光照12h，光照强度为55μmolm^-2s^-1。处理和对照的正交试验均重复3次(表3和表4)，6周后对原球茎增殖结果进行极差和方差分析(表5～表8)。结果表明，对照和处理的培养基中均以蔗糖对原球茎增殖影响最大(p＜0.01)；培养基中加入共生真菌提取物(处理)时，BA和2，4-D对原球茎增殖均有极显著影响(p＜0.01)；若培养基中不加入共生真菌提取物(对照)，则BA和2，4-D对原球茎增殖影响不大，增殖培养基中不含共生真菌提取物时的原球茎增殖率只有加入共生真菌提取物(10mgl^-1)的10.3％(表3和表4)，且增殖的原球茎生长状况不良。因此，对杜鹃兰原球茎增殖的最佳培养基组成为MS+BA 2.0mgl^-1+2，4-D 0.5mgl^-1+蔗糖30gl^-1+共生真菌提取物10mgl^-1+PVP 0.5gl^-1+琼脂8.0gl^-1，pH5.8。

表2正交试验L₉(3⁴)因素水平表

                                试验因素

处理水平        A                  B                  C

                BA-D(mgl^-1)       2，4-D(mgl^-1)     蔗糖(gl^-1)

1               1.0                0.8                30

2               2.0                0.3                35

3               3.0                0.5                25

表3原球茎增殖培养基中加入共生真菌提取物时对杜鹃兰原球茎的诱导增殖结果

                            [L₉(3⁴)正交试验。下同]

试验    试验因素

                                每粒原球茎的增殖个数                   原球茎总数

组合 A    B    C

1-1  1.0  0.8  30     5    9    4    6    5    7    11    7    6    5    65

1-2  1.0  0.8  30     11   8    4    5    6    10   6     8    7    3    68

1-3  1.0  0.8  30     8    5    6    9    7    8    5     7    12   4    71

2-1  1.0  0.3  35     1    0    2    2    1    3    0     2    4    2    17

2-2  1.0  0.3  35     2    2    3    0    2    4    2     0    2    1    18

2-3  1.0  0.3  35     1    3    2    4    0    2    1     3    2    1    19

3-1  1.0  0.5  25     3    5    7    5    4    3    5     5    6    6    49

3-2  1.0  0.5  25     3    4    4    6    7    6    5     4    5    3    47

3-3  1.0  0.5  25     4    5    3    6    5    6    7     4    5    2    47

4-1  2.0  0.8  35     2    1    3    3    0    3    2     4    3    4    25

4-2  2.0  0.8  35     3    4    1    2    3    2    4     5    3    2    29

4-3  2.0  0.8  35     3    2    3    3    2    3    4     4    1    2    27

5-1  2.0  0.3  25     7    5    5    6    4    4    7     6    5    5    54

5-2  2.0  0.3  25     7    4    4    5    6    5    7     4    5    4    51

5-3  2.0  0.3  25     5    4    5    7    4    6    6     3    6    7    53

6-1  2.0  0.5  30     11   9    12   15   14   8    9     14   13   15   120

6-2  2.0  0.5  30     10   7    14   11   12   14   13    12   15   9    117

6-3  2.0  0.5  30     14   13   6    10   16   15   9     12   17   11   123

7-1  3.0  0.8  25     5    3    4    2    4    5    1     5    2    4    35

7-2  3.0  0.8  25     2    4    5    3    5    4    5     2    4    3    37

7-3  3.0  0.8  25     3    4    2    5    4    3    5     4    6    3    39

8-1  3.0  0.3  30     7    8    9    8    5    7    12    10   7    8    81

8-2  3.0  0.3  30     8    9    6    11   8    13   8     9    7    9    88

8-3  3.0  0.3  30     7    12   9    7    6    12   11    7    5    8    84

9-1  3.0  0.5  35     3    5    4    1    2    3    4     3    6    4    35

9-2  3.0  0.5  35     3    4    2    1    3    2    5     3    4    5    32

9-3  3.0  0.5  35     4    3    2    4    5    3    5     5    2    3    36

总和                                                                     1467

表4原球茎增殖培养基中不加共生真菌提取物时对杜鹃兰原球茎的诱导增殖结果

试验   试验因素

                             每粒原球茎的增殖个数                         原球茎总数

组合   A    B      C

1-1    1.0  0.8    30    1    2    1    1    0    1    1    1    0    0    8

1-2    1.0  0.8    30    1    1    0    0    2    1    0    1    1    1    8

1-3    1.0  0.8    30    0    1    2    0    1    1    0    0    1    0    6

2-1    1.0  0.3    35    1    0    0    0    0    0    0    0    0    0    1

2-2    1.0  0.3    35    0    0    0    0    1    0    0    0    0    1    2

2-3    1.0  0.3    35    0    0    0    0    0    0    0    0    0    0    0

3-1    1.0  0.5    25    1    0    1    0    1    0    0    0    1    1    5

3-2    1.0  0.5    25    0    1    1    0    2    0    1    0    1    0    6

3-3    1.0  0.5    25    1    1    0    1    0    1    0    0    0    1    5

4-1    2.0  0.8    35    0    1    0    0    1    0    1    0    0    0    3

4-2    2.0  0.8    35    0    0    0    0    0    0    1    0    0    1    2

4-3    2.0  0.8    35    1    0    0    1    0    0    0    0    1    0    3

5-1    2.0  0.3    25    0    1    1    1    1    0    2    1    0    1    8

5-2    2.0  0.3    25    1    1    0    0    2    1    0    0    1    1    7

5-3    2.0  0.3    25    1    0    1    0    0    0    1    1    0    1    5

6-1    2.0  0.5    30    2    1    2    1    0    3    1    0    1    0    11

6-2    2.0  0.5    30    0    3    1    1    0    1    1    2    0    1    10

6-3    2.0  0.5    30    2    1    0    1    0    1    4    1    1    0    11

7-1    3.0  0.8    25    1    0    0    0    1    0    0    0    1    0    3

7-2    3.0  0.8    25    0    1    1    0    0    1    0    1    0    1    5

7-3    3.0  0.8    25    1    0    1    1    0    1    1    0    0    1    6

8-1    3.0  0.3    30    2    1    0    1    0    1    0    1    0    1    7

8-2    3.0  0.3    30    1    1    2    0    1    0    1    1    0    2    9

8-3    3.0  0.3    30    0    1    0    0    1    2    0    1    2    1    8

9-1    3.0  0.5    35    0    2    0    1    0    1    0    0    1    0    5

9-2    3.0  0.5    35    1    0    0    0    0    0    0    1    0    1    3

9-3    3.0  0.5    35    1    0    0    1    0    0    1    0    1    0    4

总和                                                                       151

表5原球茎增殖培养基中加入共生真菌提取物时对原球茎增殖结果的极差分析

                         原球茎增殖数

试验结果累加

                    BA       2，4-D   蔗糖

K₁                 401      396      817

K₂                 599      465      238

K₃                 467      606      412

R                   66.00    70.00    193.00

注：R为极差。下同

表6原球茎增殖培养基中加入共生真菌提取物时对原球茎增殖结果的方差分析

                                                               F

变异来源      平方和       自由度       方差        F值

                                                              0.01

A             225.87       2            112.93     41.48^**   4.68

B             254.60       2            127.30     46.76^**   4.68

C             1961.27      2            980.63     360.21^**  4.68

e             710.55       261          2.72

注：e为试验误差平方和；“^**”表示差异极显著(p＜0.01)。下同

表7原球茎增殖培养基中不加共生真菌提取物时对原球茎增殖结果的极差分析

                         原球茎增殖数

试验结果累加

                    BA      2，4-D    蔗糖

K₁                 41      44        78

K₂                 60      47        23

K₃                 50      60        50

R                   6.33    5.33      18.33

表8原球茎增殖培养基中不加共生真菌提取物时对原球茎增殖结果的方差分析

                                                         F      F

变异来源      平方和      自由度      方差      F值

                                                         0.01   0.05

A             2.01        2           1.00      2.70     4.68   3.03

B             1.61        2           0.80      2.16     4.68   3.03

C             16.81       2           8.40      22.58^** 4.68   3.03

e             97.13       261         0.37

在1/2 MS+NAA 0.5mgl^-1+IBA 0.5mgl^-1+蔗糖30gl^-1+共生真菌提取物10mgl^-1+琼脂8.0gl^-1培养基上，杜鹃兰原球茎生长良好，出芽、生根快速。在不含共生真菌提取物的生根生芽培养基中，原球茎几乎不能分化出根和芽，偶尔有根、芽分化的植株，其生长也及其缓慢，且因不能有效地摄取养分而中途死亡。

带根的杜鹃兰试管苗经假植(基质为腐殖质∶蛭石∶沙＝2∶1∶1)炼苗成活后，即可移栽于大田，成活率达91％以上。

本发明在最佳增殖培养基(A₂B₃C₁)上，理论上平均每6周(42d)增殖12倍(表3)，则1年(365d，约9×6周)的增殖倍数约为12⁹。

按每个假鳞茎有5个不定芽芽眼计算，每个芽眼6周产生约15个原球茎(表1)。若按上述的原球茎增殖倍数，则每个假鳞茎在1年内能繁殖出5×15×12⁹株试管苗。若以在适宜炼苗与栽培基质中幼苗移栽成活率为91％计算，理论上每个假鳞茎在1年内能培育出5×15×12⁹×91％＝68.25×12⁹株再生种苗。而用假鳞茎直接种植，1年内每个假鳞茎只能产生1株新苗，长出1个新的假鳞茎。故采用在最佳培养基中加入共生真菌提取物的方法离体培养繁殖杜鹃兰，繁殖系数比传统繁殖(假鳞茎直接播种)提高了68.25×12⁹倍。

本发明不仅弥补了杜鹃兰自然繁殖的不足，更重要的是它解决了该物种人工繁殖的技术难题。这项发明成果为挽救杜鹃兰这一宝贵资源提供了技术保障，为该药材的GAP种植奠定了基础，同时也为其它濒危难繁物种的保存提供了参考依据。