山慈菇（杜鹃兰）快速繁殖技术优化及铁皮石斛叶cDNA PCR文库的构建

摘要

山慈菇是常用的名贵中药材，具有清热解毒、化痰散结等功效，临床上常用作抗肿瘤药物。《中华人民共和国药典》(国家药典委员会，1995，2000，2005)记载:山慈菇为兰科(Orchidaceae)植物杜鹃兰(Cremastra appendiculata(D.Don)Makino)、独蒜兰(Pleione bulbocod ioides(Franch.) Rolfe）或云南独蒜兰(Pleioneyunnanensis Rolfe)的干燥假鳞茎，主要分布于四川、云南、贵州等长江以南各省区。由于具有较大的药用价值，因此对于山慈菇的需求量较大，同时自身繁殖率低，使得野生山慈菇（杜鹃兰）的生存状态恶化，数量急剧减少。因此，通过植物组织培养技术实现其体外的快速繁殖具有重大的药用、经济和环境意义。课题以实验室培养的杜鹃兰为外植体，通过最佳基本培养基、最佳植物激素及浓度、最佳有机添加物及浓度的确定，再进行四因素四水平的正交试验，从而获得杜鹃兰体外快速繁殖的最佳培养条件。实验结果显示，最佳基本培养基为1/2MS培养基，最佳激素浓度为1.0mg/L NAA，最佳有机添加物浓度为100g/L土豆汁(PE)。正交试验结果显示，1/2MS+50g/L BE+50g/L PE+0.75mg/L6-BA+0.75mg/LNAA，30.0g/L蔗糖，3.0g/L活性炭，5.5g/L琼脂，pH值5.8～6.2，为杜鹃兰体外快速繁殖的最佳培养条件。另选取各个生长时期具有特征的材料，采用石蜡切片技术对杜鹃兰形态发生过程进行观察，结合杜鹃兰外部形态发育过程，对其发育进行初步研究。
　　另以RACE技术为基础，铁皮石斛（Dend rob ium candidum）叶总RNA为起始材料，通过逆转录和末端转移构建出两端含有特定序列的cDNA，然后以连接有引入序列的引物进行PCR，在实验条件下扩增生物体中微量mRNA的cDNA，构建cDNA PCR文库。该方法构建的cDNA PCR文库能使cDNA放大100倍以上。通过比较，cDNAPCR文库的PCR效果明显高于逆转录产物的PCR效果。以5pg的总RNA为起始材料构建的cDNA PCR文库仍可得到一定的PCR扩增结果。该文库构建方法费用较低，操作简单，为克隆微量表达的基因提供了较方便的方法参考。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 植物组织培养技术概况

1．1．1 植物组织培养技术的产生及发展

1．1．2 植物组织培养技术的应用现状及意义

1．2 山慈菇(杜鹃兰)研究概况

1．2．1 兰科植物概述

1．2．2 山慈菇(杜鹃兰)研究概况

1．3 本课题的研究目的和意义

第2章 山慈菇(杜鹃兰)体外快速繁殖

2．1 材料用品

2．1．1 外植体选择

2．1．2 实验用具及处理

2．2 实验方法

2．2．1 实验流程及内容

2．2．2 实验方法概述

2．3 结果与分析

2．3．1 最佳基本培养基

2．3．2 最佳激素及浓度

2．3．3 最优有机添加物及浓度

2．3．4 正交试验确定最佳培养基组合

2．4 讨论

第3章 山慈菇(杜鹃兰)发育过程的初步研究

3．1 实验方法

3．1．1 山慈菇(杜鹃兰)宏观发育观察

3．1．2 山慈菇(杜鹃兰)微观发育观察

3．2 结果与分析

3．2．1 山慈菇(杜鹃兰)宏观发育分析

3．2．2 山慈菇(杜鹃兰)微观发育分析

第4章 铁皮石斛叶cDNA PCR文库的构建

4．1 材料与方法

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验原理

4．1．3 试验方法

4．2 结果与分析

4．2．1 RNA提取和cDNA PCR文库检测

4．2．2 cDNA PCR文库和逆转录产物的PCR效率

4．2．3 不同RNA起始量的cDNA PCR文库的PCR效率

4．3 结果与讨论

结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的论文