用于治疗对PPARα活化有反应的疾病的α－苯硫基羧酸和α－苯氧基－羧酸的衍生物

摘要

本发明描述了式(I)化合物，其中取代基的含义如正文所述，该化合物可用于治疗对PPARα活化有反应的疾病如心力衰竭、高脂血症和动脉粥样硬化。

说明书

本文所述本发明涉及通式(I)的α-苯硫基羧酸和α-苯氧基羧酸的衍生物，用于治疗对PPARα(过氧化物酶体增殖物激活性受体α)活化有反应的疾病：

其中：

R代表-H；-YCR₅R₆COX；单环、双环或三环芳基或杂芳基，可能被一个或多个-YCR₅R₆COX卤素、硝基、羟基、烷基和烷氧基取代，上述取代基可能被一个或多个卤素基团取代；单环、双环或三环芳烷基或杂芳烷基，其中的芳基或杂芳基可能被一个或多个-YCR₅R₆COX卤素、硝基、羟基、烷基和烷氧基取代，上述取代基可能被一个或多个卤素基团取代；其中的杂芳基可能是带电荷的下述类型

其中的正电荷被适宜的负抗衡离子平衡；

m代表0-1；

n代表0-3；当n代表1时，R₃和R₄可相同或不同，选自H或C₁-C烷基；当n代表2或3时，R₃＝R₄，并且代表H；

p代表0-1；

X代表-OH、-O-C₁-C₃烷基；

R₁和R₂可相同或不同，选自：-H；C₁-C₅烷基、-烷氧基，可能被一个或多个卤素基团取代；

-苯氧基，可能被一个或多个卤素、硝基、羟基、烷基取代；

-苄氧基，可能被一个或多个卤素、硝基、羟基、烷基取代；

-COX；

或者R₁或R₂与通式(I)的COX一起形成下述类型的环：

R₅和R₆可以相同或不同，选自上述R₁和R₂所列基团；

Q和Z可以相同或不同，选自NH、O、S、-NHC(O)O-、NHC(O)NH-、-NHC(O)S-、-OC(O)NH-、-NHC(S)O-、-NHC(S)NH-、-C(O)NH-；

和Y代表O、S。

根据本发明，对PPARα活化有反应的疾病是心力衰竭、高脂血症和动脉粥样硬化。

PPAR是核受体超家族的成员，是被调节基因表达的配体激活的转录因子。

现已鉴定出多种不同的PPAR同种型：PPARα、PPARδ(有时表示为β)和PPARγ(J.Med.Chem.2000，43，527-550；Nature 2000，405：421-424)。

PPARα属于类固醇激素受体大家族(Kersten等，Nature 2000，405：421-424)。

此受体最初被鉴别出来是基于其控制编码脂肪酸氧化酶的基因应答过氧化物酶体增殖物如fibric acid的衍生物(Issemann和Green，Nature 1990，347：645-650)。

在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，96：7473-7478中，Leone等证实了PPARα对组织中脂肪酸所起的关键作用。

心力衰竭是劳动能力丧失和猝死的一个重要原因。这是由于心脏不能泵送足量的血液以满足各种组织的代谢需要。

这种病症伴有心脏电和机械功能的控制系统的深刻变化。观察到的生化和神经激素的异常构成对失代偿心脏的血液动力状况改变的适应机制，其特征主要在于心输出量降低、外周阻力增加和衰竭心脏上游的血液滞留，结果造成心房扩张和逆行失代偿。

心力衰竭的起始、发生和进展所涉及的病理生理机制仍需部分阐明。

用于治疗对PPARα活化有反应的疾病的化合物是已知的。

在Gen.Pharmacol.1995年9月；26(5)：897-904中，报道了依托莫司对心功能有有益的作用，并且涉及PPAR。

在Prostaglandins Leukot.Essent.Fatty Acids；1999 5月-6月；60(5-6)：339-43中，报道依托莫司和PPARα均涉及对脂代谢的控制。

在Am.J.Physiol.Renal.Physiol.2000年4月；278(4)：F667-75中报道了依托莫司是PPARα的活化剂并且这种活化诱导对脂肪酸氧化的调节。

在Circulation 1997，96：3681-3686和Br.J.Pharmacol.1999，126：501-507中，报道了在心脏肥大和心力衰竭的动物模型中，依托莫司能有效改善心肌功能。

在Clin.Sci.(Colch)2000；7月；99(1)：27-35中报道了患心力衰竭的病人在用依托莫司治疗后心脏功能有改善。

在Curr.Opin.Lipidol.1999，10：245-247中报道了通过激活PPARα，贝特类促进脂肪酸氧化、抑制血管壁炎症和使其免于动脉粥样硬化。

在WO98/05331中报道了贝特类通过激活PPARα提供保护作用，对抗因糖尿病引起的高血压、冠状动脉疾病和动脉粥样化现象。

然而，迄今为止，仍仅有极少的化合物能激活PPARα，并证实能用于治疗心脏代偿失调。

因而在此医学方面，强烈地感觉到需要愈加特异性的新药来治疗此病症。

上述已知化合物具有某些缺点。

事实上，在Therapie 1991年9-10月；46(5)：351-4中，报道了贝特类引起严重的副作用如皮肤反应、出血、胰腺炎和神经系统疾病。

在Current Pharmaceutical Design，1998；4；1-15中，报道了依托莫司诱导心肌肥大并增加了心肌梗塞的风险。

因此，强烈感受到需要具有治疗上述疾病的活性、但没有上述已知化合物的缺点的新PPARα活化剂。

现已意外地发现式(I)化合物是PPARα活化剂，这使其可用于治疗对所述PPARα的活化有反应的疾病。

如上所述，对PPARα活化有反应的疾病包括心力衰竭、高脂血症和动脉粥样硬化。

本发明的一个目的是式(I)化合物及其在医药领域的应用。

本发明的另一目的是含式(I)化合物作为其活性成分和至少一种药用可接受的赋形剂和/或稀释剂的药物组合物。

本发明的另一目的是使用式(I)化合物制备用于治疗对PPARα活化有反应的疾病的药物的应用，所述疾病的实例是心力衰竭、高脂血症和动脉粥样硬化，但不仅限于这些疾病。

下列实施例进一步说明了本发明。

通用合成方法

下列图示说明用于合成式(I)化合物的方法。

除非另有说明，各种符号的含义与通式(I)中表示的相符。方法A中所述水解方法也适用于其他方法。

方法A

或

           III

通式(1)化合物的制备是如下实现的：通过将通式II化合物与碱(优选无机碱，优选氢化钠)反应，形成相应的阴离子，然后在极性溶剂如乙腈、甲苯或优选二甲基甲酰胺中，与含离去基团的通式III化合物例如2-甲基-α-溴代异丁酸酯反应18-48小时，所述离去基团如氯、溴、碘、甲磺酰基、甲苯磺酰基和重氮基(当为重氮基时，使用二价乙酸铑二聚体代替无机碱作为催化剂)，反应温度范围是10-50℃，优选25℃。在10-100℃，优选25℃下，将如此获得的产物使用例如NaOH或例如HCl/乙酸的混合物进行碱水解或酸水解1-72小时，优选3小时，产生相应的酸IA。

方法B

Q＝O，S

X≠OH

通式(I)化合物的制备由通式结构IV化合物开始，将该化合物与通式结构V的醇在Mitsunobu反应的典型条件(如Synthesis 1981，1-28所述)下反应，使用无水和质子惰性溶剂如苯、甲苯、乙醚或优选四氢呋喃，反应时间30分钟至72小时，优选48小时，反应温度10-40℃，优选25℃。

方法C

W＝O，NH，S

K＝-NCS，-NCO，-OC(O)Cl，-COOH

Q≠N，O，S

获得用此方法制备的化合物是由溶解于质子惰性溶剂如甲苯、乙醚、苯、优选四氢呋喃的通式结构VI开始的，然后添加相关的异氰酸酯、硫代异氰酸酯或氯甲酸酯VII，可能在催化量或化学计量的无机碱或有机碱优选三乙胺的存在下，令混合物反应6-72小时，优选48小时，反应温度10-40℃，优选25℃。如果K＝COOH，使用缩合剂如氰化膦酸二乙酯(diethylphosphoro-cyanidate)、EEDQ、DCC或CDI等，缩合剂用量为与底物的比是1-3当量，优选1-1.5当量，或通过形成该酸的氯化物，在有机溶剂如DMF、CH₃CN、CHCl₃、THF等中进行缩合反应，反应温度20-80℃，优选25℃，反应时间18小时至3天，优选24小时。

方法D

Q＝O，S

X不同于OH

L＝离去基团

通式(I)化合物(m和n等于0，Y和Q等于O和/或S)的制备是例如按照如Tetrahedron，1990，46(3)，967-978中所述的方法完成的，由产物IV开始，将其与含离去基团的通式III化合物如2-甲基-α-溴代异丁酸酯在碱如碳酸钾和相转移催化剂如溴化四丁基铵(TBAB)的存在下在质子惰性溶剂如甲苯中反应，所述离去基团如氯、溴、碘、甲磺酰基、甲苯磺酰基和重氮基(当为重氮基时，使用二价乙酸铑二聚体代替无机碱作为催化剂)，反应温度为25℃至所选溶剂的回流温度，反应时间1-5天，优选2天。

实施例1

2-(4-羟基苯硫基)异丁酸甲酯(ST1923)的制备

方法A步骤1

向含4-巯基苯酚(0.500g，4.0mmol)的10ml无水CH₃CN中添加80％NaH(0.144g，4.8mmol)。将该混合物冷却至0℃，5分钟后添加α-溴异丁酸甲酯(0.724g，4.0mmol)。在磁力搅拌下，使反应在室温下保持2天。然后将反应混合物倒入水中，并用乙酸乙酯萃取；然后将水相酸化，用乙酸乙酯再次萃取。收集合并有机相，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发。所得残余物通过硅胶色谱纯化，使用三氯甲烷作为洗脱液。获得0.760g产物(产率：84％)；Mp(熔点)：110-112℃；TLC：硅胶，洗脱液：三氯甲烷，Fr(前沿比)：0.11；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ7.30(d，2H)，6.73(d，2H)，5.57(brm，1H)，3.70(s，3H)，1.45(s，6H)；HPLC：柱：Symmetry-C₁₈，(5μm)4.6×250mm，R.T.(室温)，流动相CH₃CN/H₂O50/50(v/v)，pH：按现状，流速：0.75ml/min，205nm UV检测器，保留时间：10.14分钟；E.A.(元素分析)与C₁₁H₁₄O₃S一致。

实施例2

2-(4-羟基苯硫基)异丁酸(ST1981)的制备

方法A步骤2

向2-(4-羟基苯硫基)异丁酸甲酯(ST1923)(0.200g，0.88mmol)中添加2.7ml乙酸和2.7ml 37％的盐酸，将如此获得的混合物在磁力搅拌下回流过夜。然后将溶液倒入水中，水相用乙酸乙酯萃取。然后将有机相经硫酸钠干燥、过滤和蒸发。获得0.161g产物(产率：87％)；Mp152-154℃；TLC：硅胶，洗脱液：三氯甲烷/甲醇9/1，Fr：0.38；¹HNMR(DMSO，300MHz)δ7.23(d，2H)，6.72(d，2H)，3.30(brm，2H)，1.30(s，6H)；HPLC：柱：Inertisil ODS-3，(5μm)4.6×250mm，R.T.，流动相CH₃CN/50mM KH₂PO₄ 40/60(v/v)，pH：按现状，流速：0.75ml/min，205nm UV检测器，保留时间：7.39分钟；KF：0.5％H₂O；E.A.(元素分析)与C₁₀H₁₂O₃S一致。

实施例3

2-(3-羟基苯硫基)异丁酸甲酯(ST2047)的制备

该产物按照方法A(步骤1)中所述方法制备，由含3-巯基苯酚(2.000g，15.9mmol)的40ml无水CH₃CN、80％NaH(0.572g，19.1mmol)在0℃开始制备。5分钟后，向悬浮液中添加2-溴异丁酸甲酯(2.88g，15.9mmol)。将如此获得的反应混合物在室温下磁力搅拌过夜。然后将反应混合物倒入水中，并用乙酸乙酯萃取。有机相经无水硫酸钠干燥、过滤和蒸发。所得残余物通过硅胶色谱纯化，使用三氯甲烷/甲醇98/2作为洗脱液，获得2.900g产物(产率：81％)；Mp 41.5-42.5℃；TLC：硅胶，洗脱液：三氯甲烷/甲醇98/2，Fr：0.23；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ7.19(t，1H)，7.00(d，1H)，6.95(brt，1H)，6.81(dd，1H)，3.69(s，3H)，1.50(s，6H)；HPLC：柱：Inertisil ODS-3，(5μm)4.6×250mm，R.T.，流动相CH₃CN/H₂O 50/50(v/v)，pH：按现状，流速：0.75ml/min，205nm UV检测器，保留时间：13.82分钟；KF：0.3％H₂O；E.A.(元素分析)与C₁₁H₁₄O₃S一致。

实施例4

2-[4-[2-(4-氯苯基)乙氧基]苯硫基]异丁酸甲酯(ST1929)的制备

方法B

向含2-(4-羟基苯硫基)异丁酸甲酯(ST1923，如实施例1所述制备)(0.800g，3.54mmol)和4-氯苯乙醇(0.554g，3.54mmol)的20ml无水THF中少量逐步添加DEAD(0.801g，4.6mmol)和三苯膦(1.205g，4.6mmol)，保持温度低于30℃。将反应混合物在室温下磁力搅拌过夜。然后将溶剂蒸发，残余物通过硅胶色谱纯化，使用己烷/乙酸乙酯9/1为洗脱液。获得0.416g油状产物(产率：32％)；TLC：硅胶，洗脱液：己烷/乙酸乙酯9/1，Fr：0.32；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ7.40-7.19(m，6H)，6.80(d，2H)，4.15(t，2H)，3.65(s，3H)，3.08(t，2H)，1.45(s，6H)；HPLC：柱：Symmetry-C₁₈，(5μm)4.6×250mm，R.T.，流动相CH₃CN/H₂O 70/30(v/v)，pH：按现状，流速：0.75ml/min，205nm UV检测器，保留时间：31.40分钟；KF：0.4％H₂O；E.A.(元素分析)与C₁₉H₂₁ClO₃S一致。

实施例5

2-[4-[2-(1-吲哚基)乙氧基]苯硫基]异丁酸甲酯(ST1983)的制备

中间产物1-(2-羟基乙基)吲哚的制备

该中间产物报道于J.Med.Chem.1998，41/10，1619-1639，除了反应持续时间(30小时而非30分钟)外，按照其中所述方法制备，由吲哚(5.0g，42.7mmol)、KOH(3.6g，64.1mmol)和溴乙醇(6.4g，51.3mmol)在50ml无水DMSO中，在温度：25-30℃下开始制备，获得5g油状产物(产率：73％)。

2-[4-[2-(1-吲哚基)乙氧基]苯硫基]异丁酸甲酯(ST1983)的制备

该产物按照方法B所述方法制备，由2-(4-羟基苯硫基)异丁酸甲酯(ST1923，如实施例1所述制备)(0.671g，2.97mmol)在15ml无水THF中的溶液开始制备，少量分批添加1-(2-羟基乙基)吲哚(0.478g，2.97mmol)、DEAD(0.672g，3.86mmol)和三苯膦(1.011g，3.86mmol)，保持反应温度低于30℃。将反应混合物在室温下磁力搅拌48小时。然后蒸发溶剂，残余物通过硅胶色谱纯化，使用己烷/乙酸乙酯8/2为洗脱液。共获得0.500g仍不纯的产物，将其溶解于乙酸乙酯中并用1NNaOH溶液洗。将有机相干燥并蒸发，产生0.230g残余物，将其进一步用硅胶色谱纯化，使用三氯甲烷为洗脱液。获得0.184g油状产物(产率：17％)；TLC：硅胶，洗脱液：己烷/乙酸乙酯8/2，Fr：0.29；¹HNMR(CDCl₃，300MHz)δ7.62(d，1H)，7.40-7.10(m，6H)，6.78(d，2H)，6.50(d，1H)，4.50(m，2H)，4.24(m，2H)，3.61(s，3H)，1.40(s，6H)；HPLC：柱：Symmetry-C₁₈，(3.5μm)4.6×75mm，R.T.，流动相CH₃CN/H₂O60/40(v/v)，pH：按现状，流速：0.90ml/min，75nm UV检测器，保留时间：10.70分钟；KF：1.7％H₂O；E.A.(元素分析)与C₂₁H₂₃NO₃S一致。

实施例6

2-[4-[2-(2-萘基)乙氧基]苯硫基]异丁酸甲酯(ST2011)的制备

该产物按照方法B所述方法制备，由2-(4-羟基苯硫基)异丁酸甲酯(ST1923，如实施例1所述制备)(1.000g，4.42mmol)在30ml无水THF中的溶液开始制备，少量分批添加2-(2-萘基)乙醇(0.760g，4.42mmol)、DEAD(1.000g，5.75mmol)和三苯膦(1.500g，5.75mmol)，保持反应温度低于30℃。将反应混合物在室温下磁力搅拌48小时。然后蒸发溶剂，残余物通过硅胶色谱纯化，使用己烷/乙酸乙酯9/1为洗脱液。获得1.262g产物(产率：75％)；Mp：56-57℃；TLC：硅胶，洗脱液：己烷/乙酸乙酯9/1，Fr：0.23；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ7.85-7.70(m，4H)，7.45-7.28(m，5H)，6.83(d，2H)，4.27(t，2H)，3.65(s，3H)，3.26(t，2H)，1.45(s，6H)；HPLC：柱：Inertisil ODS-3(5μm)4.6×250mm，R.T.，流动相CH₃CN/H₂O 80/20(v/v)，pH：按现状，流速：0.75ml/min，205nm UV检测器，保留时间：23.51分钟；KF：0.16％H₂O；E.A.(元素分析)与C₂₃H₂₄O₃S一致。

实施例7

2-[4-[2-(2-萘基)乙氧基]苯硫基]异丁酸(ST2036)的制备

向ST2011(如实施例6所述制备)(0.489g，1.29mmol)的30ml甲醇溶液中添加12.9ml 1N NaOH。将如此获得的溶液回流过夜。然后冷却溶液，用水稀释并酸化，水相用乙酸乙酯萃取。有机相经无水硫酸钠干燥，然后真空蒸发，残余物通过硅胶色谱纯化，使用氯仿为洗脱液。获得0.360g产物(产率：76.2％)；Mp：103-104℃；TLC：硅胶，洗脱液：三氯甲烷/甲醇98/2，Fr：0.13；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ7.80(m，3H)，7.70(s，1H)，7.50-7.38(m，5H)，6.83(d，2H)，4.26(t，2H)，3.35(t，2H)，1.48(s，6H)；HPLC：柱：Inertisil ODS-3(5μm)4.6×250mm，R.T.，流动相CH₃CN/KH₂PO₄ 75/25(v/v)，pH：按现状，流速：0.75ml/min，205nm UV检测器，保留时间：13.07分钟；KF：1％H₂O；E.A.与C₂₂H₂₂O₃S一致。

实施例8

2-[4-[[(4-甲氧基苄基)氨基甲酰基]氧]苯硫基]异丁酸甲酯(ST2031)的制备

方法C

向ST1923(如实施例1所述制备)(0.482g，2.13mmol)的10ml无水THF溶液中添加对-甲氧基苄基异氰酸酯(0.417g，2.56mmol)和0.010g三乙胺。将溶液在室温下磁力搅拌48小时。此后蒸发溶剂，残余物通过硅胶色谱纯化，使用三氯甲烷/甲醇98/2为洗脱液。获得0.410g产物(产率：50％)；Mp：64-65℃；TLC：硅胶，洗脱液：三氯甲烷，Fr：0.14；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ7.44(d，2H)，7.28(d，2H)，7.10(d，2H)，6.90(d，2H)，5.29(brm，1H)，4.39(d，2H)，3.80(s，3H)，3.65(s，3H)，1.48(s，6H)；HPLC：柱：Inertisil ODS-3(5μm)4.6×250mm，R.T.，流动相CH₃CN/H₂O 70/30(v/v)，pH：按现状，流速：0.75ml/min，205nm UV检测器，保留时间：11.22分钟；E.A.与C₂₀H₂₃NO₅S一致。

实施例9

2-[3-[[(4-甲氧基苄基)氨基甲酰基]氧]苯硫基]异丁酸甲酯(ST2139)的制备

该产物按照方法C所述方法制备，由ST2047(如实施例3所述制备)(0.240g，1.06mmol)的7ml无水THF溶液、对-甲氧基苄基异氰酸酯(0.207g，1.27mmol)和0.010g三乙胺开始制备，将溶液在室温下搅拌18小时。然后添加0.086g(0.53mmol)对-甲氧基苄基异氰酸酯，并将混合物在室温下再磁力搅拌6小时。然后蒸发溶剂至干，残余物通过硅胶色谱纯化，使用己烷/乙酸乙酯7/3为洗脱液。获得0.320g产物，将其通过用碳酸钠洗进一步纯化。获得0.200g油状产物(产率48％)；TLC：硅胶，洗脱液：己烷/乙酸乙酯7/3，Fr：0.37；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ7.35-7.18(m，6H)，6.90(d，2H)，5.25(brm，1H)，4.40(d，2H)，3.80(s，3H)，3.62(s，3H)，1.50(s，6H)；HPLC：柱：Inertisil ODS-3(5μm)4.6×250mm，R.T.，流动相CH₃CN/H₂O 50/50(v/v)，pH：按现状，流速：0.75ml/min，205nm UV检测器，保留时间：47.02分钟；E.A.与C₂₀H₂₃NO₅S一致。

实施例10

2-[4-(2-甲氧基-1，1-二甲基-2-氧代乙氧基)苯硫基]异丁酸甲酯(ST1982)的制备

方法D

向2-(4-羟基苯硫基)异丁酸甲酯(ST1923，如实施例1所述制备)(0.250g，1.11mmol)的15ml无水甲苯溶液中添加碳酸钾(0.306g，2.22mmol)和溴化四丁基铵(TBAB)(0.0193g，0.06mmol)；将混合物在100℃加热，5分钟后添加2-溴异丁酸甲酯(0.803g，4.44mmol)。然后将反应混合物回流2天(油浴温度130℃)。然后将混合物过滤，固体用甲苯洗。将收集合并的有机相干燥，油状残余物用乙酸乙酯溶解并用1N NaOH洗。有机溶剂蒸发后获得的残余物通过硅胶色谱纯化，使用己烷/乙酸乙酯9/1为洗脱液。获得0.145g油状产物(产率：40％)；TLC：硅胶，洗脱液：己烷/乙酸乙酯9/1，Fr：0.17；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ7.31(d，2H)，6.74(d，2H)，3.75(s，3H)，3.65(s，3H)，1.60(s，6H)，1.45(s，6H)；HPLC：柱：Symmetry-C₁₈，(3.5μm)4.6×75mm，R.T.，流动相CH₃CN/H₂O 50/50(v/v)，pH：按现状，流速：0.75ml/min，205nm UV检测器，保留时间：13.00分钟；E.A.与C₁₆H₂₂O₅S一致。

实施例11

2-[3-[2-(3-羟基苯氧基)乙氧基]苯氧基]异丁酸甲酯(ST1877)和2-[3-[2-[3-(2-甲氧基-1，1-二甲基-2-氧代乙氧基)苯氧基]乙氧基]苯氧基]异丁酸甲酯(ST1878)的制备

上述产物按照方法D所述方法制备，由3，3-亚乙基二氧化物苯酚(3，3-ethylenedioxidephenol)(2.000g，8.1mmol)、碳酸钾(4.500g，32.4mmol)、TBAB(0.131g，0.4mmol)和2-溴异丁酸甲酯(11.611g，64mmol)在100ml甲苯中开始制备。将反应混合物在130℃加热3天，然后冷却并过滤。所得固体用甲苯洗，将收集合并的有机相真空蒸发至干，油状残余物通过硅胶色谱纯化，使用己烷/乙酸乙酯8/2为洗脱液。获得两种产物：单衍生物ST1877(0.700g)(产率：25％)和双衍生物ST1878(1.100g)(产率：30.4％)。

ST1877的分析数据

熔点：77-79℃；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ7.13(t，2H)，6.62-6.40(m，6H)，4.25(s，4H)，3.78(s，3H)，1.60(s，6H)；HPLC：柱：Inertisil ODS-3(5μm)4.6×250mm，R.T.，流动相CH₃CN/H₂O(60/40v/v)，pH：3.2，流速：1.0ml/min，205nm UV检测器，保留时间：8.76分钟；E.A.与C₁₉H₂₂O₆一致。

ST1878的分析数据

熔点：60-62℃；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ7.13(t，2H)，6.60(d，2H)，6.41(m，4H)，4.26(s，4H)，3.78(s，6H)，1.60(s，12H)；HPLC：柱：Inertisil ODS-3(5μm)4.6×250mm，R.T.，流动相CH₃CN/H₂O(60/40v/v)，pH：3.2，流速：1.0ml/min，205nm UV检测器，保留时间：23.92分钟；E.A.与C₂₄H₃₀O₈一致。

实施例12

2-[4-[1-(4-羟基苯基)-1-甲基乙基]苯氧基]丙二酸二甲酯(ST2020)的制备

该产物如方法A步骤1所述按照下列方法制备：在氮气流下，向二价铑乙酸盐二聚体(0.220g，0.5mmol)和双酚A(2，2-双-(4-羟基苯基)-丙烷)(3.400g，15mmol)在100ml无水甲苯中形成的悬浮液中滴加重氮丙二酸(2.846g，18mmol)(如Org.Synth.：1973，V，179所述制备)的50ml无水甲苯溶液，小心保持温度在15-20℃。然后在氮气下，将反应混合物在120-130℃回流24小时。然后过滤反应混合物，真空蒸发甲苯。所得残余物通过硅胶色谱纯化，使用己烷/乙酸乙酯8/2为洗脱液。获得1.700g油状产物(产率：32％)；TLC：硅胶，洗脱液：己烷/乙酸乙酯7/3，Fr：0.23；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ7.16(m，4H)，6.90(d，2H)，6.87(d，2H)，5.12(s，1H)，3.90(s，6H)，1.62(s，6H)；HPLC：柱：Inertisil ODS-3(5μm)4.6×250mm，R.T.，流动相CH₃CN/H₂O 70/30(v/v)，pH：按现状，流速：0.75ml/min，205nm UV检测器，保留时间：7.00分钟；KF：0.6％H₂O；E.A.与C₂₀H₂₂O₆一致。

实施例13

2-[4-(1-{4-[2-甲氧基-1-(甲氧基羰基)-2-氧代乙氧基]苯基}-1-甲基乙基)苯氧基]丙二酸二甲酯(ST2048)的制备

该产物如方法A步骤1所述，按照实施例12已述方法制备，由二价铑乙酸盐二聚体(0.0885g，0.2mmol)和ST2020(1.230g，3.4mmol)(如实施例12所述制备)在36ml无水甲苯中的溶液开始，滴加重氮丙二酸(1.882g，11.9mmol)的18ml无水甲苯溶液，小心保持温度为15-20℃。在氮气下，将反应混合物在120-130℃回流24小时。然后过滤反应混合物，真空蒸发甲苯。所得残余物通过硅胶色谱纯化，使用己烷/乙酸乙酯8/2为洗脱液。获得0.430g油状产物(产率：26％)；TLC：硅胶，洗脱液：己烷/乙酸乙酯6/4，Fr：0.46；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ7.20(d，4H)，6.90(d，4H)，5.22(s，2H)，3.90(s，12H)，1.61(s，6H)；HPLC：柱：Inertisil ODS-3(5μm)4.6×250mm，R.T.，流动相CH₃CN/H₂O 70/30(v/v)，pH：按现状，流速：0.75ml/min，205nm UV检测器，保留时间：9.68分钟；KF：0.7％H₂O；E.A.与C₂₅H₂₈O₁₀一致。

实施例14

2-[3-[2-(2-萘基)乙氧基]苯硫基]异丁酸甲酯(ST2167)的制备

该产物按照方法B中所述方法步骤(除用DIAD代替DEAD外)制备，由2-(3-羟基苯硫基)异丁酸甲酯(ST2047)(1.110g，4.9mmol)、2-(2-萘基)乙醇(0.842g，4.9mmol)、DIAD(1.290g，6.37mmol)和三苯膦(1.670g，6.37mmol)在20ml无水THF中开始。将此反应混合物在室温下磁力搅拌过夜。然后真空除去溶剂，残余物通过硅胶色谱纯化，使用己烷/乙酸乙酯7/3为洗脱液。将产物溶解于乙酸乙酯中并用碳酸钠溶液洗有机相以进一步纯化。然后有机相经无水硫酸钠干燥、过滤和真空蒸发溶剂。获得1.14g产物(产率：61.2％)；TLC：硅胶，洗脱液：己烷/乙酸乙酯9/1，Fr：0.20；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ7.80(m，3H)，7.75(s，1H)，7.45(m，3H)，7.25(t，1H)，7.05(m，2H)，6.90(d，1H)，4.25(t，2H)，3.65(s，3H)，3.30(t，2H)，1.50(s，6H)；HPLC：柱：InertisilODS-3(5μm)4.6×250mm，R.T.，流动相CH₃CN/H₂O 80/20(v/v)，pH：按现状，流速：0.9ml/min，205nm UV检测器，保留时间：18.91分钟；KF：1.0％H₂O；E.A.与C₂₃H₂₄O₃S一致。

实施例15

2-[3-[[[4-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰基]氧]苯硫基]异丁酸甲酯(ST2208)的制备

该产物按照方法C所述方法制备，由ST2047(0.800g，3.54mmol)(如实施例3所述制备)的10ml无水THF溶液、4-三氟甲基异氰酸酯(0.749g，4.25mmol)和0.010g三乙胺开始制备；反应时间为18小时代替48小时，温度为室温。然后蒸发溶剂至干，残余物通过硅胶色谱纯化，使用三氯甲烷和三氯甲烷/甲醇98/2为洗脱液。获得0.881g产物(产率＝60％)；Mp＝66-67℃；TLC：硅胶，洗脱液：三氯甲烷，Fr：0.38；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ7.60(m，4H)，7.38(m，3H)，7.15(m，1H)，7.06(brs，1H)，3.70(s，3H)，1.55(s，6H)；HPLC：柱：InertisilODS-3(5μm)4.6×250mm，R.T.，流动相CH₃CN/50mM KH₂PO₄(60/40v/v)，pH：3.0(85％H₃PO₄)，流速：1ml/min，205nm UV检测器，保留时间：25.46分钟；KF：2.5％H₂O；E.A.与C₁₉H₁₈F₃NO₄S一致。

实施例16

2-[4-[[[4-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰基]氧]苯硫基]异丁酸甲酯(ST2209)的制备

标题产物按照方法C所述方法制备，由ST1923(0.300g，1.33mmol)(如实施例1所述制备)的7ml无水THF溶液、4-三氟甲基异氰酸酯(0.298g，1.6mmol)和0.010g三乙胺开始制备；反应时间为18小时代替48小时，温度为室温。然后蒸发溶剂至干，残余物通过硅胶色谱纯化，使用己烷/乙酸乙酯7/3为洗脱液。获得0.340g产物(产率＝62％)；Mp＝110-111℃；TLC：硅胶，洗脱液：三氯甲烷，Fr：0.34；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ7.55(m，4H)，7.48(d，2H)，7.15(d，2H)，7.10(brs，1H)，3.70(s，3H)，1.55(s，6H)；HPLC：柱：Inertisil ODS-3(5μm)4.6×250mm，R.T.，流动相CH₃CN/50mM KH₂PO₄(60/40 v/v)，pH：3.0(85％H₃PO₄)，流速：1ml/min，205nm UV检测器，保留时间：25.60分钟；E.A.与C₁₉H₁₈F₃NO₄S一致。

实施例17

2-[3-[2-(4-氯苯基)乙氧基]苯硫基]异丁酸甲酯(ST2195)的制备

标题产物按照方法B所述方法制备，由在15ml无水THF中的2-(3-羟基苯硫基)异丁酸甲酯(ST2047，如实施例3所述制备)(1.00g，4.42mmol)和4-氯苯乙醇(0.692g，4.42mmol)开始制备，向其中少量分批加入DIAD(1.16g，5.75mmol)和三苯膦(1.500g，5.75mmol)，保持温度低于30℃。将反应物在室温下磁力搅拌过夜。此后蒸发溶剂，残余物通过硅胶色谱纯化，使用己烷/乙酸乙酯9/1为洗脱液。获得1.146g产物(产率：71％)；TLC：硅胶，洗脱液：己烷/乙酸乙酯9/1，Fr：0.28；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ7.25(m，6H)，7.00(m，1H)，6.90(d，1H)，4.15(t，2H)，3.65(s，3H)，3.08(t，2H)，1.55(s，6H)；HPLC：柱：InertisilODS-3(5μm)4.6×250mm，R.T.，流动相CH₃CN/H₂O 80/20(v/v)，pH：按现状，流速：0.75ml/min，205nm UV检测器，保留时间：19.34分钟；KF：1.7％H₂O；E.A.与C₁₉H₂₁ClO₃S一致。

实施例18

2-[3-[2-(1-吲哚基)乙氧基]苯硫基]异丁酸甲酯(ST2394)的制备

标题产物按照方法B所述方法制备，由2-(3-羟基苯硫基)异丁酸甲酯(ST2047，如实施例3所述制备)(1.00g，4.42mmol)和1-(2-羟基乙基)吲哚(如实施例5所述制备)(0.711g，4.42mmol)在20ml无水THF中开始制备，向其中少量分批加入DIAD(1.16g，5.75mmol)和三苯膦(1.500g，5.75mmol)，保持温度低于30℃。将反应物在室温下磁力搅拌过夜。此后蒸发溶剂至干，残余物通过硅胶色谱纯化，使用己烷/乙酸乙酯8/2为洗脱液。获得0.581g产物(产率：35％)；TLC：硅胶，洗脱液：己烷/乙酸乙酯9/1，Fr：0.22；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ7.62(d，1H)，7.42(d，1H)，7.30-6.80(m，7H)，6.52(d，1H)，4.55(m，2H)，4.30(m，2H)，3.61(s，3H)，1.50(s，6H)；HPLC：柱：Supelco-C₁₈(5μm)4.6×150mm，R.T.，流动相CH₃CN/H₂O 70/30(v/v)，pH：按现状，流速：0.90ml/min，205nm UV检测器，保留时间：6.36分钟；E.A.与C₂₁H₂₃NO₃S一致。

实施例19

2-[3-[(1-甲基-1-甲氧基羰基)乙氧基]苯硫基]异丁酸甲酯(ST2418)的制备

标题产物按照方法D中所述方法制备，由在100ml甲苯中的2-(3-羟基苯硫基)异丁酸酯(ST2047，如实施例3所述制备)(0.870g，3.85mmol)、碳酸钾(1.06g，7.7mmol)、TBAB(0.062g，0.19mmol)和2-溴异丁酸甲酯(2.8g，15.4mmol)开始制备。将反应混合物在130℃加热3天，然后冷却并过滤。所得固体用甲苯洗，将收集合并的有机相真空蒸发至干，油状残余物通过硅胶色谱纯化，使用己烷/乙酸乙酯9/1为洗脱液。获得1.0g油状产物(产率：79％)；TLC：硅胶，洗脱液：己烷/乙酸乙酯9/1，Fr：0.20；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ7.20(m，1H)，7.05(d，1H)，6.95(s，1H)，6.90(d，1H)，3.80(s，3H)，3.65(s，3H)，1.60(s，6H)，1.45(s，6H)；HPLC：柱：Symmetry-C₁₈(5μm)4.6×150mm，R.T.，流动相CH₃CN/H₂O 60/40(v/v)，pH：按现状，流速：0.75ml/min，205nmUV检测器，保留时间：9.53分钟；E.A.与C₁₆H₂₂O₅S一致。

实施例20

2-[4-[2-(4-氯苯基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基丙酸(ST2505)的制备

标题产物按照通用方法A步骤2中所述方法制备，由ST1929(如实施例4所述制备)(0.572g，1.57mmol)在36ml甲醇中的溶液开始制备，向其中添加15.7ml 1N氢氧化钠。所得溶液回流过夜。然后冷却溶液，用水稀释并酸化，水相用乙酸乙酯萃取。有机相真空蒸发，残余物通过硅胶色谱纯化，使用己烷/乙酸乙酯7/3为洗脱液。获得0.448g产物(产率：81％)；Mp＝87-88℃；TLC：硅胶，洗脱液：己烷/乙酸乙酯6/4，Fr：0.30；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ7.45(d，2H)，7.15(m，4H)，6.85(d，2H)，4.15(t，2H)，3.05(t，2H)，1.50(s，6H)；HPLC：柱：Symmetry-C₁₈(5μm)4.6×250mm，R.T.，流动相CH₃CN/10mM乙酸铵45/55(v/v)，pH：按现状，流速：0.70ml/min，205nm UV检测器，保留时间：4.73分钟；E.A.与C₁₈H₁₉ClO₃S一致。

实施例21

2-[3-[5-(4-硝基苯基)糠氧基]苯硫基]异丁酸甲酯(ST2501)的制备

标题产物按照方法B所述方法制备，由2-(3-羟基苯硫基)异丁酸甲酯(ST2047，如实施例3所述制备)(1.02g，4.5mmol)和5-(硝基苯基)糠醇(0.986g，4.5mmol)在23ml无水THF中开始制备，向其中少量分批加入DIAD(1.18g，5.85mmol)和三苯膦(1.53g，5.85mmol)，保持温度低于30℃。将反应物在室温下磁力搅拌过夜。此后蒸发溶剂，残余物通过硅胶色谱纯化，使用己烷/乙酸乙酯9.4/0.6为洗脱液。获得0.300g产物(产率：16％)；Mp：81-82℃；TLC：硅胶，洗脱液：己烷/乙酸乙酯7/3，Fr：0.45；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ8.25(d，2H)，7.80(d，2H)，7.30(m，1H)，7.05(m，1H)，7.03(m，1H)，7.01(m，1H)，6.90(d，1H)，6.60(d，1H)，5.10(s，2H)，3.70(s，3H)，1.50(s，6H)；HPLC：柱：Symmetry-C₁₈(5μm)4.6×250mm，R.T.，流动相CH₃CN/H₂O 85/15(v/v)，pH：按现状，流速：0.85ml/min，205nm UV检测器，保留时间：6.24分钟；E.A.与C₂₂H₂₁NO₆S一致。

实施例22

2-[3-[2-(4-氯苯基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基丙酸(ST2518)的制备

标题产物按照通用方法A步骤2中所述方法制备，由ST2195(如实施例17所述制备)(0.150g，0.41mmol)在9ml甲醇中的溶液开始制备，向其中添加4ml 1N氢氧化钠。所得溶液在室温下磁力搅拌48小时。然后用水稀释溶液、酸化，水相用乙酸乙酯萃取。有机相经无水硫酸钠干燥和过滤，真空蒸发溶剂。获得0.128g产物(产率：88％)；Mp：105-106℃；TLC：硅胶，洗脱液：三氯甲烷/甲醇9.4/0.6，Fr：0.42；¹HNMR(CDCl₃，300MHz)δ7.45(m，5H)，7.10(m，2H)，6.80(dd，1H)，4.15(t，2H)，3.05(t，2H)，1.50(s，6H)；HPLC：柱：Symmetry-C₁₈(5μm)4.6×250mm，R.T.，流动相CH₃CN/10mM乙酸铵35/65(v/v)，pH：按现状，流速：0.80ml/min，205nm UV检测器，保留时间：4.66分钟；E.A.与C₁₈H₁₉ClO₃S一致。

实施例23

2-[4-(2-(2，4-二氯苯基)乙氧基)苯硫基]异丁酸甲酯(ST2531)的制备

标题产物按照方法B所述方法制备，由溶解于3ml无水THF的2-(4-羟基苯硫基)异丁酸甲酯(ST1923，如实施例1所述制备)(0.280g，1.24mmol)和DIAD(0.325g，1.61mmol)开始制备，在0℃，将其滴加到2，4-二氯苯乙醇(0.260g，1.36mmol)和三苯膦(0.422g，1.61mmol)溶于4ml无水THF的溶液。将反应混合物在室温下磁力搅拌过夜。此后蒸发溶剂，残余物通过硅胶色谱纯化，使用己烷/乙酸乙酯9.6/0.4为洗脱液。获得0.346g产物(产率：70％)；Mp：73-74℃；TLC：硅胶，洗脱液：己烷/乙酸乙酯9/1，Fr：0.26；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ7.35(m，3H)，7.22(m，2H)，6.83(d，2H)，4.18(t，2H)，3.65(s，3H)，3.20(t，2H)，1.45(s，6H)；HPLC：柱：Inertisil ODS-3(5μm)4.6×250mm，R.T.，流动相CH₃CN/H₂O 85/15(v/v)，pH：按现状，流速：1ml/min，205nm UV检测器，保留时间：12.58分钟；KF：0.4％H₂O；E.A.与C₁₉H₂₀Cl₂O₃S一致。

实施例24

2-[3-(2-(2，4-二氯苯基)乙氧基)苯硫基]异丁酸甲酯(ST2534)的制备

标题产物按照方法B所述方法制备，由溶解于3ml无水THF的2-(3-羟基苯硫基)异丁酸甲酯(ST2047，如实施例3所述制备)(0.280g，1.24mmol)和DIAD(0.325g，1.61mmol)开始制备，在0℃，将其滴加到2，4-二氯苯乙醇(0.260g，1.36mmol)和三苯膦(0.422g，1.61mmol)溶于4ml无水THF的溶液。将反应混合物在室温下磁力搅拌过夜。蒸发溶剂，残余物通过硅胶色谱纯化，使用己烷/乙酸乙酯9.6/0.4为洗脱液。获得0.327g油状产物(产率：66％)；TLC：硅胶，洗脱液：己烷/乙酸乙酯9/1，Fr：0.34；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ7.40(d，1H)，7.20(m，3H)，7.00(m，2H)，6.90(dd，1H)，4.15(t，2H)，3.65(s，3H)，3.20(t，2H)，1.45(s，6H)；HPLC：柱：Inertisil ODS-3(5μm)4.6×250mm，R.T.，流动相CH₃CN/H₂O 90/10(v/v)，pH：按现状，流速：0.8ml/min，205nm UV检测器，保留时间：12.40分钟；KF：0.2％H₂O；E.A.与C₁₉H₂₀Cl₂O₃S一致。

实施例25

2-[3-(2-(咔唑-9-基)乙氧基)苯硫基]异丁酸甲酯(ST2356)的制备

标题产物按照方法B所述方法制备，由溶解于14ml无水THF的2-(3-羟基苯硫基)异丁酸甲酯(ST2047，如实施例3所述制备)(0.609g，2.7mmol)、9H-咔唑-9-乙醇(0.570g，2.7mmol)、DIAD(0.708g，3.5mmol)开始，向其中少量分批添加三苯膦(0.917g，3.5mmol)，保持温度低于30℃。将反应混合物在室温下磁力搅拌18小时。然后蒸发溶剂至干，残余物通过硅胶色谱纯化，使用己烷/乙酸乙酯9/1为洗脱液。获得0.510g产物(产率：45％)；Mp：101-103℃；TLC：硅胶，洗脱液：己烷/乙酸乙酯8/2，Fr：0.38；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ8.05(d，2H)，7.50(m，4H)，7.15(m，2H)，7.08(t，1H)，7.00(d，1H)，6.90(s，1H)，6.80(m，1H)，4.75(t，2H)，4.35(t，2H)，3.60(s，3H)，1.40(s，6H)；HPLC：柱：Symmetry-C18(5μm)4.6×150mm，R.T.，流动相CH₃CN/H₂O 65/35(v/v)，pH：按现状，流速：0.80ml/min，205nm UV检测器，保留时间：11.45分钟；E.A.与C₂₅H₂₅NO₃S一致。

实施例26

2-[4-(2-(咔唑-9-基)乙氧基)苯硫基]异丁酸甲酯(ST2387)的制备

产物按照方法B所述方法制备，由溶解于14ml无水THF的2-(3-羟基苯硫基)异丁酸甲酯(ST1923，如实施例1所述制备)(0.609g，2.7mmol)、9H-咔唑-9-乙醇(0.570g，2.7mmol)、DIAD(0.708g，3.5mmol)开始，向其中少量分批添加三苯膦(0.917g，3.5mmol)，保持温度低于30℃。将反应混合物在室温下磁力搅拌18小时。然后蒸发溶剂，残余物通过硅胶色谱纯化，使用己烷/乙酸乙酯9/1为洗脱液。获得0.702g产物(产率：62％)；Mp：72-74℃；TLC：硅胶，洗脱液：己烷/乙酸乙酯8/2，Fr：0.30；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ8.05(d，2H)，7.50(m，4H)，7.15(m，4H)，6.75(d，2H)，4.75(t，2H)，4.35(t，2H)，3.60(s，3H)，1.40(s，6H)；HPLC：柱：Symmetry-C₁₈(5μm)4.6×150mm，R.T.，流动相CH₃CN/H₂O 70/30(v/v)，pH：按现状，流速：0.80ml/min，205nm UV检测器，保留时间：11.60分钟；E.A.与C₂₅H₂₅NO₃S一致。

实施例27

主动脉缩窄

所用动物是雄性Wistar大鼠，重100-120g，每笼5只(笼尺寸：425mm×266mm×180mm，锯屑垫底)，在21±1℃温度和50±15％湿度下，光/暗循环12/12小时，每小时15-20次换气。用LP ALTROMIN饲料(REIPER)和无限制的泉水饲养动物。

诱导心脏肥大

通过用置于膈和肾分支之间的腹主动脉的钳夹(φ0.8mm)以缩窄腹主动脉，在耐波他(戊巴比妥钠)麻醉的大鼠中诱导左心室肥大；用作对照组的一组动物经历相同的手术操作但不植入钳夹，因此不经历主动脉缩窄(空白)。

因此将动物随机分成下列组：

空白：进行手术，不缩窄主动脉(8只动物)

对照：进行手术，缩窄主动脉(8只动物)

CLO：进行手术，缩窄主动脉，并且自手术后那天起用本发明化合物治疗12周(11只动物)。

心功能评价

在治疗结束时，借助于经由颈动脉插入左心室并连接压力传感器(Statham p23XL)和放大器(Biomedica Mangoni bm 61)的聚乙烯导管，评价用耐波他(戊巴比妥钠)麻醉的动物的心功能。

记录的参数是：心率，收缩期和舒张末期的左心室内压力，和心室内压力的正和负导数，这些参数通过专门的数据采集系统(IDAS)记录在个人电脑中。记录进行30分钟。

目测评价

在试验结束时，用致死剂量的耐波他将动物处死，打开腹腔，将内脏取出以便核实正确地放置了主动脉钳夹；取出心脏、肺和肝脏，并在肉眼检查可能的异常后，将其彻底地干燥并称重。

此试验获得的初步结果显示本发明所述化合物能被很好地耐受并且与对照组相比使治疗组的压力值正常化。

实施例28

瞬时转染真核细胞以评价PPARα配体的激动剂活性

真核细胞中反式激活分析能够定量评价假定的配体促进转录因子与启动子内其响应元件间的相互作用的能力。

过氧化物酶体增殖物激活性受体同种型α(PPARα)通过与9-顺式视黄酸受体(RXR)异二聚化而调节靶基因转录。只有当被两种受体中至少一种的配体激活，形成的二聚体才能结合到位于靶基因启动子中的过氧化物酶体增殖物响应元件(PPRE)上。

因此，反式激活测定要求在预选的细胞系中同时存在：

a)足量的PPARα；

b)足量的9-顺式视黄酸受体(RXR)；

c)含有由位于异源病毒启动子上游的PPRE控制的报道基因的嵌合质粒。在本例中，报道基因是氯霉素-乙酰基转移酶(CAT)。

只要PPARα和RXR的内源水平不足，就可以通过转染含有关受体的基因的表达载体从外源补充。

质粒pCH110含β-半乳糖苷酶基因并且和报道基因CAT一起共转染，从而提供转染效率和标化结果的内部对照。

实验方法

使用猴肾成纤维细胞(COS-7)细胞系。细胞用报道基因(见上述c项)和含PPARα基因编码序列(cDNA)的表达质粒转染。将细胞暴露于递增浓度的研究化合物下，评定CAT活性。未处理细胞用作对照。CAT水平增加表明通过其结合PPRE激活了PPARα-依赖性基因转录(化合物的激动剂活性)。

细胞培养

按照通常的细胞培养技术，在37℃、5％v/v二氧化碳气氛下，在终浓度100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素的存在下，使用DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)作为培养基培养猴肾成纤维细胞(COS-7)，所述DMEM用3.7g/l碳酸氢钠、4mM L-谷氨酰胺、4.5g/l葡萄糖、1mM丙酮酸钠和10％v/v胎牛血清改良。

COS-7细胞的瞬时转染

利用核酸与磷酸钙的共沉淀技术将COS-7细胞瞬时共转染。

在转染前24小时，将细胞接种在6孔(直径25mm)的平板上，接种密度是3×10⁵细胞/孔。转染前2小时更换培养基，然后向每个孔内滴加280μl如下制备的转染混合物：

1)含PPARα的cDNA的表达质粒(2.5μg)

2)含报道基因CAT的质粒(5μg)

3)pCH110(1μg)

+17.5μl的2M氯化钙。

加水至最终体积达140μl。向此质粒和盐的混合物中添加等体积的pH7.1的HBS溶液2x(每升含氯化钠16g，氯化钾0.74g，碱式磷酸钠脱水物0.27g，葡萄糖2g，Hepes 10g)。

将细胞在37℃、5％v/v二氧化碳气氛下培养6小时。

在2ml新鲜培养基中，用本发明所述化合物和参考化合物氯贝特和4-氯-6-(2，3二甲代苯氨基)-2-嘧啶基硫代乙酸(WY-14,643)处理24小时。未处理细胞用作阴性对照。对从处理和未处理细胞中提取的蛋白质进行放射测量评价各种处理影响报道基因CAT转录的能力。

制备细胞蛋白质提取物和测量CAT活性

处理后，将细胞用磷酸盐缓冲液(5ml)洗两次，并用机械方法将其从孔中移到TEN缓冲液(Tris[羟甲基]氨基甲烷10mM pH8，乙二胺四乙酸1mM，pH8，氯化钠0.1mM)中。在Eppendorf 5417R离心机(转子F453011)中在4℃以1000转/分钟(rpm)的转速离心2分钟后，将细胞重悬于0.15ml缓冲液(Tris[羟甲基-氨基甲烷-盐酸0.25M，pH8)中，并通过反复冻融(三次5-分钟循环)使其溶解。

在4℃以全速离心15分钟以除去不溶的细胞物质，回收上清液用于CAT活性测量。

测量CAT活性的试样由下列成分组成：

1)50μl蛋白质细胞提取物(在65℃加热10分钟)

2)10μl正-丁酰辅酶A(3.5mg/ml)

3)5μl[¹⁴C]氯霉素(0.25μCi)

用水加至最终体积达100μl。

在37℃培养大约2小时后，用2体积的二甲苯/2，6，10，14-四甲基十五烷(1∶2 v/v的混合物)阻断反应。用此溶剂萃取后，将150μl上层相加到5ml闪烁液中并用β-计数器(闪烁器)分析以确定因酶促反应而形成的[¹⁴C]丁酰-氯霉素的含量。

确定β-半乳糖苷酶活性的实验

为相对于转染效率标化CAT活性，使用质粒pCH110中存在的相应基因编码的β-半乳糖苷酶活性作为内部对照。

在“Z缓冲液”(含氯化钾10mM、氯化镁1mM、和β-巯基乙醇50mM的磷酸盐缓冲液)的存在下，评价20μl蛋白质提取物(见上文)对底物2mg/ml ONPG(O-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷)的活性。在37℃温育15-120分钟后(取决于典型的黄色出现的速度)，用200μl 1M碳酸钠阻断反应。样本在室温下温育10分钟，然后用分光光度计分析，测量在420nm(A420)波长的吸光度。

下面的公式用于相对于β-半乳糖苷酶活性标化CAT分析结果：

CAT样本计数/分钟-空白样本计数/分钟

实施例29

瞬时转染真核细胞以评价PPARα配体的激动剂活性(方法II)

使用一种可供选择的反式激活系统，其主要的区别在于受体定位到DNA上的方式，并且取决于配体结合事件如何转变成为转录激活。

在此模型中，用编码融合蛋白的表达载体瞬时转染真核细胞，所述融合蛋白是在酵母菌Gal4转录因子的DNA结合区(DBD)和PPARα的配体结合区(LBD)之间(Gal4DBD/PPARαLBD)。共转染报道载体，此报道载体在强病毒启动子上游含有5拷贝的Gal4高亲和结合部位(命名为UAS，上游激活序列)，该病毒启动子连接报道基因氯霉素乙酰基转移酶(CAT)。此模型有一些优点，其中最重要的是不受内源受体的干扰。

除表达载体和报道载体外，还用编码β-半乳糖苷酶的对照载体pCH110转染细胞以校正转染效率的差别。

实验方法

使用猴肾成纤维细胞系(COS-7)。细胞用携带报道基因的质粒、编码融合蛋白Gal4DBD/PPARαLBD的表达质粒和对照载体pCH110共转染。然后用递增浓度的试验化合物处理细胞，测量CAT活性。未处理细胞用作对照。

细胞培养

猴肾成纤维细胞(COS-7)在存在100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)中进行常规培养，所述DMEM中补充3.7g/l碳酸氢钠、4mM L-谷氨酰胺、4.5g/l葡萄糖、1mM丙酮酸钠和10％v/v胎牛血清。

COS-7细胞的瞬时转染

使用多成分脂基FuGENE6转染试剂对COS-7细胞进行瞬时转染，该试剂与DNA复合并在转染过程中将DNA转运到细胞中。将细胞接种在12孔平板上，接种密度为1.2×10⁵细胞/孔，并在37℃、5％v/v二氧化碳气氛下培养过夜。在转染前2小时，用新鲜的无血清培养基替换培养基，然后用FuGENE6转染试剂按照制造商的使用说明进行转染。简单地说，将转染混合物在无血清培养基存在下直接添加到细胞中，该转染混合物含(每个孔)0.8μg表达载体、1.6μg报道载体、0.8μg对照载体和9μl FuGENE6转染试剂。5小时后，用1ml含三种不同浓度(2、20和100μM)的试验分子或无试验分子的完全培养基替换转染培养基。用2μM Wy-14,643(一种已知的PPARα配体)作为阳性对照。

制备细胞蛋白质提取物和测量CAT活性

48小时后，将细胞用1ml磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次，然后刮下收集到TEN缓冲液(Tris[羟甲基]氨基甲烷10mM pH8，乙二胺四乙酸1mM pH8，氯化钠0.1M)中。室温下以1000转/分钟(rpm)转速离心3分钟后，将细胞重悬于60μl溶胞缓冲液(0.25M Tris-HCl，pH8)中，并通过三次快速冻/融循环(三次5-分钟循环)使其溶解。然后在4℃以15000转/分钟(rpm)转速离心15分钟以除去细胞碎片，然后添加甘油(终浓度10％v/v)和β-巯基乙醇(终浓度5mM)(终体积75μl)，将细胞提取物贮存于-80℃直至分析。

CAT活性分析如下进行：将20μl细胞溶解产物(在65℃预热10分钟以钝化内脱乙酰酶酶活性)加到10μl 3.5mg/ml正-丁酰-CoA、5μl(0.25μCi)[¹⁴C]-氯霉素和65μl蒸馏水中并在37℃温育2小时。加入200μl的二甲苯/2，6，10，14-四甲基十五烷(1∶2 v/v的混合物)溶液阻断反应。剧烈涡旋和全速离心5分钟后，将150μl上清液转移到闪烁瓶中的5ml闪烁液中，用β-计数器测量相对放射性。

确定β-半乳糖苷酶活性的实验

如下测量β-半乳糖苷酶活性：将20μl细胞提取物添加到750μl反应缓冲液中，该缓冲液由1体积2mg/ml ONPG和3体积“Z缓冲液”(含氯化钾10mM、氯化镁1mM、和β-巯基乙醇50mM的磷酸盐缓冲液)组成。在37℃进行反应，当可看出特有的黄色时添加200μl 1M碳酸钠阻断反应。样本在室温下温育10分钟，然后用分光光度计测量在420nm(A₄₂₀)的吸光度。

如下将CAT活性结果相对于β-半乳糖苷酶活性进行标化：

CAT样本计数/分钟-空白样本计数/分钟

β-半乳糖苷酶活性单位^*

获得的初步结果报告于表1，显示本发明的化合物是PPARα激动剂。

表1

化合物              2μM      20μM          100μM

实施例5(ST1983)     150％     391,2％        1372％

实施例14(ST2167)    98,1％    360％          462,7％

实施例24(ST2534)    113,1％   284,9％        421％

结果表示为与在参照化合物(WY-14.643 2μM)存在下测量的结果相比，CAT报道基因的激活百分数，后者按照惯例视为等于100％。

实施例30

db/db小鼠中HDL-胆固醇水平的增加

在此实验中，使用的db/db小鼠中PPARα表达是高于正常的(Memon等，Endocrinology 2000，4021-4031)并且HDL-胆固醇水平大大升高(Silver等，J Biol Chem 1999，274：4140-4146)。

将C57BL/KsJ db/db小鼠在标准条件(22±2℃，55±15％湿度；换气15-20次/小时；12小时光/暗循环，光照从上午7.00到下午7.00)下，进行标准4 RF21饮食(Mucedola)适应1周。在吸收后状态下(从上午8.30到下午4.30禁食)，借助于Jelco 22G导管(Johnson andJohnson)从尾静脉取血样。检测葡萄糖、胰岛素、甘油三酯、胆固醇、游离脂肪酸和尿素的血浆水平以确保处理组中小鼠的均匀分布。

在处理开始时，检查动物的体重并为监测其水和食物消耗做好准备。

对小鼠每天口服两次(上午8:30和下午6.30)处理10天或14天。

将如实施例4所述获得的试验化合物(ST1929)以在10ml/kg载体(1％CMC，含在去离子水中的0.5％吐温80)中的24mg/kg剂量给药。

其他试验化合物也以与实施例4中化合物相当的剂量给药。

环丙贝特，一种已知的PPARα激动剂(Varanasi等，J Biol Chem1996，271：2147-2155；Latruffe等，Cell Biochem Biophys 2000，32春：213-220)以20mg/kg的剂量给药(Dwivedi等，Toxicol Pathol 1989，17：16-26；Qi等，Proc Natl Acad Sci USA 1999，96：1585-1590)。

最后处理后7小时，在吸收后状态下(从上午9.30到下午4.30禁食)处死(通过断头术)动物。确定多种重要的脂类和碳水化合物代谢参数的血清水平。

测量HDL-胆固醇水平是用基于磷钨酸的沉淀试剂(ABXDiagnostics)处理血清以除去乳糜微粒、极低密度和低密度脂蛋白，借助于胆固醇试剂盒(ABX Diagnostics)和Cobas Mira S自动分析仪(Roche)测定上清液中HDL-胆固醇水平。

结果显示，在db/db小鼠中，本发明化合物能够以类似于或大于参照化合物环丙贝特的方式提高HDL-胆固醇值(PPARα激动剂活性的指示)(表2)。

表2

db/db小鼠中HDL-胆固醇水平的增加

化合物    剂量    (mg/kg)处理持续时间    (天)HDL-胆固醇水  平的增加％环丙贝特    20    14    +52▲实施例4化合物(ST1929)    24    10    +80▲实施例8化合物(ST2031)相当于24mg ST1929    10    +51▲

学生‘t’检验：▲表示相对对照，P＜0.001。

本发明的式(I)化合物可以原样或以药用可接受的衍生物如盐或能改善药代动力学方面同时保持特异性活性的衍生物(前药)的形式使用。

就本发明的工业方面来说，药物可以是按照本领域专家熟悉的常规方法制备的适宜的药用制剂(或组合物)形式。药物组合物的实例是片剂、胶囊、丸剂、栓剂、药囊、用于口服的液体形式如溶液、悬浮剂和乳剂；一般用于口服或肠道给药的控释形式；和肠胃外给药的形式如可注射形式。