枳椇的不溶于低级醇的提取物和从中分离的多糖

摘要

一种药物组合物和保健食品，其包含一种不溶于低级醇的枳椇提取物或者是一种从中分离的多糖，具有有效的保护肝脏和消除宿醉活性。

说明书

发明领域

本发明涉及一种具有保护肝脏和消除宿醉活性的不溶于低级醇的枳椇(Hovenia dulcis Thunb)的提取物，从其中分离的多糖，和包含其的药物组合物或保健食品。

发明背景

肝炎折磨着世界上越来越多的人，且因为缺乏有效的治疗药物，经常可发展为慢性肝炎，肝硬化，或癌症。当病人受到多种因素，比如压力，过量消费乙醇和/或肝毒性物质的影响时，可能发展各种类型的肝炎。

被认为是典型的肝毒性物质的有CCl₄，D-半乳糖胺，脂多糖(LPS)，溴苯，和醛类如被认为是乙醇代谢途径中间体的乙醛。因此，寻找新的可以保护肝脏免受肝毒性物质伤害或者在受到此类伤害后可恢复肝脏功能的药物的尝试很多。

例如，从枳椇的种子和果实中分离的三萜糖苷被认为抑制人体组胺的释放和乙醇的吸收(Yoshikawa，K.T.等，(1995)Chem.Pharm.Bull.Tokyo，43(3)，第532-534页)；枳椇的果实被发现可抑制由四氯化碳或D-半乳糖胺/脂多糖引起的对肝脏的伤害(Hase K.等，(1997)Chem.Pharm.Bull.Tokyo，20(4)，第381-385页)。上述和其它现有技术文献描述了毛枳椇(日本品种)和枳椇(中国品种)的果实或种子的多种提取物的药理学活性；但是，却没有关于枳椇的醇不溶性提取物或从中分离的多糖在保护肝脏和消除宿醉中的应用的报告。

发明概述

因此本发明的一个目的就是提供一种从枳椇中提取的药物活性物质，该物质显示肝脏保护和宿醉消除活性。

本发明的另一个目的是提供一种从枳椇中分离所述物质的方法。

本发明的另一个目的是提供一种抑制乙醇脱氢酶和乳酸脱氢酶的药物组合物，该组合物包含药用载体和上述从枳椇中分离的物质。

本发明另一目的是提供一种用于防止或抑制肝脏相关疾病并可治疗宿醉的药物组合物，其包含药用载体和从枳椇中分离的多糖。

本发明还有一个目的是提供一种包含所述物质和/或来源于枳椇的多糖的保健食品。

依照本发明的一个方面，提供一种用低级醇处理干枳椇的热水提取物获得的低级醇不溶性级分。

依照本发明的另一个方面，还提供一种从所述低级醇不溶性级分中分离的具有有效的肝脏保护活性的多糖。

附图简述

当结合附图时，本发明的上述及其它目的和特征将从本发明的下列描述中变得明显，这些附图分别表示：

图1：枳椇的果梗提取物的甲醇不溶性级分和从中分离的多糖的制备流程示意图；

图2：甲醇不溶性级分的DSC扫描；

图3：甲醇不溶性级分的MALLS谱；

图4：甲醇不溶性级分的IR光谱；

图5：甲醇不溶性级分的UV光谱；

图6：甲醇不溶性级分的GC谱；

图7：甲醇不溶性多糖MALLS谱；

图8：甲醇不溶性级分的IR光谱；

图9：甲醇不溶性级分的NMR谱；

图10：甲醇不溶性级分对四氯化碳诱导的肝脏切片培养物的体外蛋白合成活性；

图11：甲醇不溶性级分对半乳糖胺/LPS诱导的肝脏切片培养物的体外蛋白合成活性；

图12：甲醇不溶性级分对溴苯诱导的肝脏切片培养物的体外蛋白合成活性；

图13：甲醇不溶性级分对溴苯诱导的肝脏切片培养物的LDH释放抑制活性；

图14：图7中显示的多糖对溴苯诱导的肝脏切片培养物的体外蛋白合成活性；

图15：甲醇不溶性级分和图7中显示的多糖降低血液中乙醇浓度的活性；和

图16：甲醇不溶性级分和图7中显示的多糖的乙醇脱氢酶活性。

发明详述：

本发明中枳椇的热水提取物的不溶于低级醇的级分可以通过两步制备。首先，干枳椇的热水提取物是用高压提取方法获得的，然后不溶性级分用低级醇处理如此获得的热水提取物来获得。

在第一步中，将枳椇的果梗切片并在阴凉处干燥。向枳椇果梗的干燥切片中加入适量水，所得的混合物保存在温度110-150℃，优选120-125℃，1-3atm，优选1.5atm的压力下15分钟-48小时，优选30分钟-12小时的时期。然后将混合物冷却至室温并过滤，滤液依照常规冻干方法冻干以获得热水提取物。

热水提取物在室温下进一步干燥，在一个减压下如-1.5atm下蒸发，用低级醇，优选甲醇，乙醇或丁醇，最优选100％的甲醇提取，以去除其中的低级醇可溶解的级分获得想要的低级醇不溶性级分。

上述枳椇选自Hovenia dulcis Thunb.var.Koreana NAKAI，Hoveniadulcis Thunb.var.tomentella Makino和Hovenia dulcis Thunb。

如此得到的低级醇不溶性级分具有以下特征：凝胶渗透层析(GPC)的峰值在平均分子量为1,330,000道尔顿(Da)，142,800 Da，70,540 Da和102,400 Da处；IR(KBr，nm)吸收带在1000-1300nm(醚，酚，亚砜，乙烯基的峰)；UV吸收在200-300nm(环状环的峰)处。

一种具有高肝脏保护和宿醉消除活性的多糖可以通过以下步骤从低级醇不溶性级分中分离出来。

将低级醇不溶性级分溶解在蒸馏水中，将所得溶液填充离子交换柱，用具有0-5M渐增NaCl浓度的溶液逐步洗脱多糖组分洗脱，透析，浓缩并冻干(见图1)。

在进行离子交换的过程中，可以使用阳离子交换树脂或阴离子交换树脂。可被用作此目的的交换树脂的例子有：强酸性离子交换树脂如AG50W-x8，Amberlite IR-120和Dowex 50W-x8；弱酸性离子交换树脂如Amberlite IRC-50，Bio-Rex 70和Duolite-436；弱碱性离子交换树脂如Amberlite IRA-67和Dowex 3-x4A；强碱性离子交换树脂如AG 2x8，Amberlite IRA-400和Dowex 2-x8；改性的纤维素阳离子交换树脂如CM-Cellulose和SE-Cellulose；一种改性的纤维素阴离子交换树脂如DEAE纤维素；阳离子交联葡聚糖类型的树脂如G-25和G-50珠类型的交联葡聚糖树脂；和由琼脂糖制备的改性的珠类型的离子交换树脂如CepharoseCL，Biogel A Cepharose树脂，Fractogels和Toyopearl。。优选ToyopearlDEAE类型的交换树脂，最优选Toyoprearl DEAE-650C类型的交换树脂。

按照上述的分离方法可获得多种多糖级分，用0.2M NaCl溶液洗脱的一种多糖显示最高的肝脏保护活性。按照上述步骤从韩国本土的枳椇中获得的多糖表现出以下的特性：它由甘露糖，葡萄糖，半乳糖，鼠李糖(rhamanose)和阿拉伯糖组成，其比例为1∶2.51∶12.53∶187∶13.43；绝对分子量为114,500 Da；IR(KBr，nm)光谱在3550-3450 Da(宽，OH)，1660-1600 Da (C＝C)，和1290-1420 Da(＝CH-OH)处显示峰；¹H-NMR(600MHz，D₂O)的峰值在4.4-4.8ppm(糖峰)处。此外，在中国本土的枳椇中获得的多糖表现出以下特性：它由包含半乳糖，鼠李糖，葡糖醛酸，半乳糖醛酸，木糖，甘露糖和葡萄糖组成，其比例为1∶0.84∶1.05∶0.87∶0.89∶2.05。

各种实验清楚地说明低级醇不溶性级分和从其中分离的多糖具有高肝脏保护和消除宿醉活性，并对预防和治疗肝病和宿醉有效。

因此，本发明中的低级醇不溶性级分和多糖可以被用作预防或治疗肝毒性和肝病如肝炎，脂肪肝和肝硬化的保健食品和药剂。

因此，本发明还提供了一种抑制乙醇脱氢酶和乳酸脱氢酶的药物组合物，该组合物包含与药用赋形剂、载体或稀释剂相结合的枳椇的低级醇不溶性级分或者从甲醇不溶性级分中的级分3中分离出的多糖作为活性成分。

此外，本发明提供了一种包含上述提取物和/或多糖的保健食品。

同样，本发明也提供了一种预防和治疗肝病及宿醉的药物组合物，该组合物包含与药用赋形剂、载体或稀释剂相结合的枳椇的低级醇不溶性级分和从中分离的多糖作为活性成分。此外，本发明提供了一种包含上述提取物和/或多糖的保健食品。

本发明的药物制剂可以按照任何常规方法制备。在制备制剂的过程中，活性组分优选和载体混合或稀释，或者被包封在载体里，该载体可以是胶囊，药囊或其它容器的形式。当载体用作稀释剂时，它可以是作为活性成分的载体、赋形剂或介质的固体、半固体或液体物质。因此，该制剂可以是片剂、丸剂、散剂、药囊、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液、糖浆、气雾剂、软胶囊和硬胶囊，无菌注射液，无菌包装散剂等。

适当的载体，赋形剂或稀释剂的例子为乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。该制剂可以还含有填料、抗凝集剂、润滑剂、湿润剂、调味剂、乳化剂、防腐剂等。通过使用本领域公知的任何一种方法可以配制本发明的组合物，以便在将它施用于患者以后提供快速，持续或延迟的活性成分的释放。

本发明的药物组合物可以通过多种途径施用，包括口服，经皮，皮下，静脉内和肌内导入。对人类患者的治疗而言，从枳椇中分离的上述级分和多糖的典型日剂量为约0.01-10g/kg体重，优选1-5g/kg体重，并且可以单剂量或分剂量施用。但是，应当理解实际施用的活性成分的量应该依照各种相关因素包括将处理的症状，选择的给药途径，个体患者的年龄、性别和体重，以及病人症状的严重性来决定；因此，上述的剂量应该不被用来以任何方式限制本发明的范围。

上述的低级醇不溶性级分和从中分离的多糖可以被加入到食品或饮料中来预防各种肝病和宿醉。为预防各种肝病或宿醉而可以加入到食品或饮料中的所述级分和/或多糖的量可以通常为基于食品总重量的0.1-15w/w％，优选1-10w/w％，和基于100ml饮料1-30g，优选3-10g。

本发明的保健饮料组合物可以含有其它组分，例如，像常规饮料中的除臭剂和天然的碳水化合物。这种碳水化合物的实例是单糖如葡萄糖和果糖；二糖如麦芽糖和蔗糖；常规糖如糊精和环状糊精；以及糖醇如木糖醇，山梨糖醇和赤藓糖醇。作为除臭剂，一种天然的除臭剂如taumatin，levaudioside A和甘草皂苷，或者合成除臭剂如糖精和天冬甜精(aspartam)可能被用到。上述天然碳水化合物的用量通常为基于100ml饮料的约1-20g，优选5-12g。

其他可能被加到本发明食品或饮料组合物中的组分是各种养分，维生素，矿物质，合成调味剂，着色剂，果胶酸及其盐，海藻酸及其盐，有机酸，保护性的胶状粘合剂，pH调节剂，稳定剂，防腐剂，甘油，醇，碳化剂(carbonizing agent)，果汁和蔬菜汁。

下列的参考实施例，检验实施例和配制实施例意欲进一步举例说明本发明而不限制其范围。

参考例1：通过Gel渗透层析测定绝对分子量

分子量的测量是使用装有泵(光谱系统，p2000型)，保护柱(TSKPWH，Tosoh公司)，RI-探测器(Shodex SE71型)，SEC(大小排除层析)柱(TSK凝胶3000pw，4000pw，5000pw(7.8×300mm，Tosoh公司)和MALLS(多角度激光分散Dawn DSP-F，Wyatt技术公司)探测器的GPC设备，用0.02％叠氮化钠作为显影溶剂，其包含0.15 M NaNO₃，在流速为0.5ml/min下来进行的。

参考例2：试剂和材料

LDH(乳酸脱氢酶)的量是用340-UV分光计(Sigma公司，美国)测定的。用来测定合成的具有被肝毒性物质损害后肝脏愈合活性的蛋白的量的³H-亮氨酸(5.Ci/板)同位素和用来测定合成RNA的量的³H-尿苷同位素都是从Sigma公司购买的。吸收变化的测量是使用气相色谱顶空(head-space)分析装置，装有FID(火焰离子化检测器)的HP 5890气相色谱法来进行的，以测定乙醇脱氢酶活性。

实施例1：韩国本土枳椇的低级醇不溶性级分的制备

将干燥和切片的韩国本土枳椇梗(1.5kg)进行在120℃，高压(1.5atm)下的提取3小时。所得的提取溶液过滤通过Wattman纸。将韩国本土枳椇的滤液(218.5g)冻干，所得的粉末经过3个循环的回流提取，每个用31HPLC-级的纯甲醇1小时，剩余的粉末被干燥以获得韩国本土枳椇的甲醇不溶性级分(干重65.71g，产率：4.3％w/w)。此外，合并提取物并冻干以获取溶于甲醇的级分(干重152.29g，产率：10.27％w/w)。

实施例2：枳椇甲醇不溶性级分的分析

实施例1中获得的甲醇不溶性级分的性质分析如下。(1)熔解温度和熔融焓(entalphy)的测定

熔解温度和熔融焓的测定是通过DSC(差示扫描量热计，Seiko株式会社DSC6100)测定的。

韩国本土枳椇的甲醇不溶性级分的样品被放入一个铝盘内，密封，然后以10℃/min的速率从20℃加热到200℃，分别获得熔化热吸收曲线和熔解温度并从中测得样品的结晶度。

韩国本土的甲醇不溶性级分的DSC扫描显示主峰始于164.9℃，在185.3℃达到最大熔解温度。将甲醇不溶性级分制成数种碳水化合物(mp：60-100℃)和少量蛋白质(mp：60-100℃)(图2)。

(2)糖链的分析

为检测上述的主峰组分中是否含有糖链，依照Hakomori等(J.Biochem.Tokyo，55，205-209，1964)和Waeghe T.J.等(Carbohydrate Research，123，281-304，1983)所述方法进行甲基化分析。

将500.g的样品甲基化，然后甲基化的产物使用乙醇吸附的C₁₈ 8×10筒柱(Sep-Pak)被收集。甲基化的产物的酸性糖部分使用THF中的LiB(C₂H₅)₃D(Super-Deupride，1ml，Aldrich公司)还原，还原产物使用C₁₈ 8×10筒柱(Sep-Pak)来回收。随后，处理过的样品依次进行：在1.0 M TFA中121℃下水解2个小时；NaBD₄还原；乙酰化。得到的部分甲基化的醋酸糖醇通过GLC和GC-EIMS分析，峰面积是用FID(火焰离子化检测器)来测量的。

(3)通过GPC测定分子量

如参考例1中进行的GPC测定的结果显示甲醇不溶性级分是由如图3和表1中所示的4个峰值组分组成的。

                   表1.甲醇不溶性级分的峰值组分

    组分  峰1  峰2  峰3  峰4  平均分子量  (Da)  1,330,000  142,800  70,540  102,400

(4)IR谱(图4)

样品通过IR光谱(Vector 22型，Bruker Analytische Messtechnik GMBH)分析：分辨率，4.0；来源，球面；速率，6，10KHz；捕获模式，双重墙(dual wall)/往返条件)

IR(KBr，cm^-1)：醚，酚，亚砜和乙烯基峰(1000-1300nm；主要1039nm)，芳香环峰(665，939，1313，1663)，羟基峰(3435nm)。

(5)UV光谱(图5)

样品是通过UV-Vis光谱学(HP 8453型，Hewlett Packard公司)来分析的，结果显示最大吸收在200-300nm，提示存在环状环。

实施例3：具有肝脏保护和宿醉消除活性的多糖的分离

为从实施例1中获得的甲醇不溶性级分中分离具有肝脏保护和宿醉消除活性的活性化合物，将200mg的甲醇不溶性级分在蒸馏水中溶解，填充到Toyopearl^DEAE-650C柱(4.0×30cm)中，依次用0，0.1，0.2，0.3和3M NaCI溶液洗脱。洗脱后的级分用对分子量1000和以下通透的透析膜透析，浓缩，然后冻干以获得重量分别为38mg，64mg，73mg，5mg和4mg的纯化级分。

实施例4：韩国本土枳椇中分离级分的定性

实施例3中经过0，0.1，0.2，0.3和3M NaCl洗脱后获得的分离级分分别被称为级分1-5。对每个组分，总糖和多酚组分的含量通过苯酚-硫酸方法(Dubois M.等，Anal.Chem.28，350-356，1956)测定，由此获得的结果显示在表2中。

            表2：总糖和多酚组分的含量

  组成                         含量(ppm)  级分1  级分2  级分3  级分4  级分5  总糖  248.79  231.21  122.76  51.81  2.33  多酚  0  0.0245  0  0  0

进行GC分析(Varian CP-3800型，设定条件；检测器：FID，柱：SP-2380(30m×0.25mm×0.2μm)，柱温：230℃，注射器温度：250℃，检测器温度：250℃，流动相：N₂气(1.0ml/min))来鉴别上述级分中的糖组分，测定每个级分中的甘露糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木糖的相对量。结果显示在表3中。

                表3：糖组分的量(相对于甘露糖)

  组分1  组分2  组分3  组分4  组分5  甘露糖    1    1    1    1    1  葡萄糖    6    3.29    2.51    1.13    3.05  半乳糖    3.1    2.04    12.53    7.81    -  鼠李糖    -    0.32    187    3.64    -  阿拉伯糖    1.58    1.93    13.43    5.86    1.93  木糖    -    0.26    -    0.75    -

级分3在以上的级分中显示出最高的肝脏保护和宿醉消除活性，以下对其进行进一步地表征。

级分3的表征

由参考例1中的方法测定的级分3的绝对分子量是114,500 Da(图7)。IR分析(KBr)显示峰(cm^-1)在3550-3450(宽，OH)，1660-1600(C＝C)和1290-1420(＝CH-OH)处(图8)。¹H-NMR(600MHz，D₂O)在4.4-4.8ppm处显示了一个峰(糖峰)(图9)。

实施例5：中国本土枳椇分离级分的表征

重复实施例1中的步骤以从中国本土枳椇的果梗中获得甲醇不溶性级分(干重61.5g，产率：4.1％w/w)和溶于甲醇的级分(干重133.5g，产率：8.9％w/w)。将甲醇不溶性级分依照实施例3的方法进行离子交换层析，经0，0.1，0.2，0.3和3M NaCl洗脱后得到的分离级分分别被称为级分1’-5’。

将级分1’-5’依照实施例4中的方法表征。糖组分通过GC分析鉴定，结果显示在表4中。

                表4.糖组分的量(相对于半乳糖)

级分1’  级分2’  级分3’  级分4’  级分5’  半乳糖  1.00    1.00    1.00    1.00    1.00  鼠李糖  0.58    0.57    0.84    0.77    -  葡糖醛酸  0.87    0.78    1.05    1.47    0.87  半乳糖醛酸  0.88    0.30    0.87    0.97    0.98  木糖  0.55    -    -    -    -  甘露糖  0.91    -    0.89    -    1.09  葡萄糖  1.50    0.41    2.05    4.00    1.88

SEC-RI峰和绝对分子量是依照参考例1中的步骤测定的。结果分别显示在表5和6中。

        表5通过SEC-RI检测器的甲醇不溶性级分的峰组分比例

  级分1’   级分2’  级分3  级分4’  级分5’  峰1  13％    35％  5％    2％    3％  峰2  64.6％    60％  89％    92％    89％  峰3  15％    1％  5％    4％    4％  峰4  7％    3％  -    2％    4％

           表6通过SEC-MALLS测量甲醇不溶性级分的绝对分子量

  级分1’  级分2’  级分3  级分4’  级分5’  峰1  151,500  37,750  4,132,000  573,500  258,900  峰2  87,930  74,770  516,500  518,900  35,630  峰3  ND  ND  23,350  ND  ND  峰4  ND  ND  ND  ND  ND   ND：未检测到

检验实施例1：枳椇的甲醇不溶性级分的肝脏保护功能

(1)对被四氯化碳破坏的肝脏的保护活性

将从五周龄的Sprague-Dawley大鼠中取出的肝脏用组织切片机(美国Brendel/Vitron公司)切成圆盘状的样品，每个的直径约为0.8mm厚度为200.m(湿重：18-22mg)。切好的样品被分成四组，其中两组(组3和组4)分别用实施例1中准备的甲醇不溶性级分和溶于甲醇的级分处理，每组的浓度为200.g/ml。然后，4个切好的样品在O₂/CO₂＝95％/5％的气氛下在热动力器官组织切片培养仪(日本Sankyo公司)中表面培养。1小时后，向组3、组4和剩余两组中的一个(组2)中每组加入四氯化碳至浓度为4mM。另一组(组1)用蒸馏水替代四氯化碳进行处理(对照)。然后所有组保存5小时来诱导肝损伤。

其后，枳椇提取级分的肝解毒功效通过依照Bonney等(“SomeCharacteristics and Function of Adult Rat Liver Pimary Culture，in GeneExpression and Carcinogenesis in Cultured Liver”，(1975)Gerschenson，E和Thompson，E.B.(Eds)，Academic Press，New York，第24-45页)描述的方法测量合成蛋白的量来评估。如图1Oa所示，证明甲醇不溶性级分较溶于甲醇的级分有高得多的活性。

此外，图10b中的结果是通过按照上述方法用实施例5中制备的甲醇不溶性级分或溶于甲醇的级分来获得的，其中甲醇不溶性级分表现出比溶于甲醇的级分高很多。

(2)恢复被D-半乳糖胺/LPS损伤的肝脏功能的活性

已经知道D-半乳糖胺和细菌的脂多糖(LPS)一起施用引起肝损伤，这种损伤在生物化学和组织学上与人类肝炎引起的肝损伤是相似的。枳椇的甲醇不溶性级分对该损伤的肝脏的解毒作用检测如下：

用500.M的D-半乳糖胺和1.g/ml的LPS替代四氯化碳，重复检验实施例1中的步骤，来测量修复损伤肝脏的活性。如图11a所示，甲醇不溶性级分和溶于甲醇的级分都有显著的修复活性。此外，图11b中的结果显示实施例5中获得的甲醇不溶性级分和溶于甲醇的级分也显示出显著的修复活性。

(3)修复溴苯损伤的肝脏

除用1mM的溴苯代替四氯化碳外，韩国或中国本土枳椇提取物的解毒活性通过(1)中描述的步骤评估。图12a(韩国)和12b(中国)中显示的结果提示甲醇不溶性级分比溶于甲醇的级分在修复受损肝脏方面更有效。

此外，从培养基中释放的LDH(乳酸脱氢酶)的量通过使用Sigma试剂盒340-UV装置测定，结果，图13a(韩国)和13b(中国)，显示甲醇不溶性级分比溶于甲醇的级分在诱导由溴苯引起的LDH的释放方面更有效。

检验实施例2：枳椇的甲醇不溶性级分中分离的多糖的肝脏保护活性。

用组织切片机(美国Brendel/Vitron公司)将从五周龄的Sprague-Dawley大鼠中摘取的肝脏切片以获得直径约为0.8mm，厚度为200.m(湿重：18-22mg)的圆盘状样品。切好的样品被分成7组，其中的5组分别用实施例4中制备的五个多糖级分来处理，每个的浓度为200.g/ml(分别为组1-组5)。然后，切好的样品在O₂/CO₂＝95％/5％的气氛下，在热动力器官组织培养仪(日本Sankyo公司)里表面培养1个小时。然后，向组1-5和剩余两组中的一个(组6)中的每个样品加入溴苯至浓度为4mM。最后剩余的一组(组7)用蒸馏水替代溴苯进行处理(对照)。

其后，韩国土产枳椇的每个多糖级分的肝脏解毒功效通过依照Bonney等(见上)描述的方法测定的合成蛋白的量来评估。图14中显示的结果证明级分3的多糖有最高的活性。

检验实施例3：枳椇不溶性级分中分离的多糖的宿醉消除活性

为了测量检验实施例1中得到的枳椇的甲醇不溶性级分的宿醉消除活性，15只三周龄的Sprague-Dawley大鼠被分成了3组，禁食24小时但是允许摄入水。然后，2ml 40％的乙醇用不锈钢探头(长度：10cm)通过口服施用于每只大鼠。1小时后，将2ml，500mg/ml的甲醇不溶性级分或从中分离的多糖(级分3)施用于实验组(组2和组3)的每只大鼠，对照的大鼠(组1)施用2ml水。4小时后，从每只大鼠心脏采取的血样中的乙醇含量按照Bergmeyer描述的方法(In Methods of EnzymaticAnalysis，第3版，598-6062，1984)测量。

结果(图15)显示，从组1-组3中采取的血样的乙醇浓度分别为0.058％，0.032％和0.028％。即与对照组相比，枳椇的甲醇不溶性级分和从中分离的多糖将血液的乙醇浓度分别降低了44.8％和51.7％。这个结果证明了枳椇的醇不溶性级分和从中分离的多糖具有显著降低血液中的乙醇浓度的能力。

受损肝脏的乙醇脱氢酶活性的检测如下。

大鼠被CO₂窒息，从中取出其肝脏，用蒸馏水洗涤。每个肝脏样品被放入10倍体积的含有0.154 M KCl的0.1 M磷酸钾缓冲液(pH 7.4)中，并用聚四氟乙烯玻璃匀浆器搅匀。将均化的溶液在4℃下在9,000xg下进行离心30分钟，得到的上清液在4℃下在110,000xg下进行超速离心1小时，以获得上清液胞质级分。将2-3mg的胞质级分加到包含55mM焦磷酸钠缓冲液(pH 7.4)，20mM乙醇和0.2mM NAD的反应混合物中。反应混合物中用到的NAD的浓度在0.025mM-2mM之间变化。测量反应混合物在340nm处的吸光度变化3min，通过吸收曲线的斜率计算乙醇脱氢酶的活性。

如图16所示，甲醇不溶性级分和从甲醇不溶性级分的级分3中分离的多糖表现出增大的乙醇脱氢酶活性，由此证明了它们优越的宿醉消除活性。

如以下所例举，本发明的低级醇不溶性级分和从中分离的多糖可以按照任何一种已知的常规方法用于制备在药理学上有效的散剂，片剂，胶囊，注射剂或液体组合物。

[配制实施例1]

将实施例1中得到的2g干燥提取物与1g乳糖混合来获得散剂，其被填充和密封在密闭的包装中。

[配制实施例2]

将100mg实施例1中得到的干燥提取物，100mg玉米淀粉，100mg乳糖和2mg硬脂酸镁混合并压片以获得片剂制剂。

[配制实施例3]

将100mg实施例1中得到的干燥提取物，100mg玉米淀粉，100mg乳糖，2mg硬脂酸镁混合装入明胶胶囊中以获取胶囊制剂。

[配制实施例4]

将100mg实施例5中得到的干燥提取物，蒸馏水和适量的pH调节剂溶解以获取注射制剂，该制剂被装入2ml的安剖(ample)中并依照常规的注射剂制备方法灭菌以获得注射制剂。

保健食品可依照下列方法典型地制备：

[保健食品的制备]

将糙米，大麦，糯米和薏苡(Job′s-tears)的烘焦干燥的膳食混合物粉碎并过筛以获得60目或以下的谷物颗粒。此外，黑豆，黑芝麻和野生芝麻的混合物被蒸制、干燥、烘焦，粉碎，并过筛以得到60目或以下的种子微粒。

实施例1中得到的干燥的枳椇的甲醇不溶性级分被粉碎并过筛以得到60目及以下的颗粒，将其与谷物颗粒和种子颗粒以下述比例混合来制备颗粒型的保健食品。

谷物：糙米30w％，薏苡15w％，大麦20w％，

种子：野生芝麻7w％，黑豆8w％，黑芝麻7w％，

韩国土产枳椇的干燥粉末：3w％，

花菇(Shiitake mushroom)0.5w％，地黄根(rehmania root)0.5w％

尽管已经参照上述具体实施方案描述本发明，应当理解本领域技术人员可以对本发明进行各种改进和变化，其也属于后附权利要求所限定的本发明的范围内。