从蛇毒中提取降纤酶及降纤酶水针制剂的制备方法

摘要

本发明公开了一种从蛇毒中提取降纤酶及降纤酶水针制剂的制备方法，从蛇毒中提取降纤酶的制备方法，它包括下述步骤：单克隆抗体的制备；降纤酶粗品的制备；抗体亲和层析柱的制备；降纤酶的制备；降纤酶水针制剂的制备方法，它包括下述步骤：取纯化的降纤酶，将其加入到适量的注射用水中溶解，得溶解液，在每1000ml溶解液中加入5－20g氯化钠稳定剂，分装，即得降纤酶水针制剂。本发明降纤酶制备工艺简单，适合规模化生产，水针制剂稳定性高，并可长期保存。

说明书

技术领域

本发明涉及一种从蛇毒中提取具有溶栓作用的降纤酶及降纤酶水针制剂的制备方法，尤其涉及一种采用单克隆抗体亲和层析技术进行高纯度生物活性酶的提取方法和高稳定性水针制剂的制备工艺。

背景技术

降纤酶为蛋白水解酶，能溶解血栓，抑制血栓形成，改善微循环。在临床上用于急性脑梗死，包括脑血栓、脑栓塞、短暂性脑缺血发作(TIA)以及脑梗死再复发的预防；心肌梗死、不稳定性心绞痛以及心肌梗死再复发的预防；四肢血管病，包括股动脉栓塞，血栓闭塞性脉管炎，雷诺氏病；还适用血液呈高黏状态、高凝状态、血栓前状态；突发性耳聋；肺栓塞等症。

从各种蛇毒中提取的具抗凝溶栓作用的蛇毒类凝血酶制剂，在国内、外已广泛使用多年。传统的降纤酶分离纯化采取多步柱层析，包括离子交换层析和分子筛凝胶层析，甚至采取高效液相制备等手段，这样取得微量单组分的药用酶是可行的，但是大量规模化生产取得单一组分药用酶类几乎没有可能，而且还存在所得制品纯度低的问题。而采用多糖为配基的亲和层析，制备工艺可达十几毫克样品，但必须采取多步骤操作才能得到单一组份。

目前，国外的蛇毒类凝血酶制剂均为水针剂，因受制剂水平的限制，处方中均含防腐剂成分以保持制剂的稳定性，如Ancrod、Batroxobin、日本东菱克栓酶等；我国为保证长期保存过程中效价的稳定性，均制成冻干粉针，降低了制品的比活性，同时也增大聚合体产生的可能性。

发明内容

本发明就是为了解决上述技术问题而提供的一种从蛇毒中提取降纤酶及降纤酶水针制剂的制备方法，它工艺简单，适合规模化生产，并可长期保存。

为了解决上述技术问题，本发明是这样实现的：

从蛇毒中提取降纤酶的方法，它包括下述步骤：

1).单克隆抗体的制备：将纯化并定性的从蛇毒中提取的降纤酶(1g/L)与等体积的完全佐剂混合乳化后，给动物免疫；然后用Koher方法取免疫的动物的脾细胞，将所取的免疫动物脾细胞制成细胞悬液；将所得的细胞悬液与相同动物的骨髓瘤细胞按(8-15)∶1的比例混合，在30-80％聚乙二醇作用下融合得融合体；将融合体进行选择性培养，首先筛出能分泌与预定抗原起反应的单抗的杂交瘤细胞，进而从中筛出有预定特异性的杂交瘤细胞，最终选出可供实际应用且具有稳定生长和功能特异的均一细胞克隆，以腹水法获得单克隆抗体，纯化后备用；

2).降纤酶粗品的制备：取蛇毒，将蛇毒经离子交换层析法初步纯化，得初步纯化的降纤酶粗品，备用；

3).抗体亲和层析柱的制备：

3.1取琼脂糖作为亲和层析的载体，用适量的溴化氰活化该载体，得活化的琼脂糖；

3.2取已纯化的单克隆抗体溶于硼酸缓冲液中，过滤后加入亲和层析柱内，然后加入活化的琼脂糖，在5-20℃下搅拌反应15-25小时，得具有特异亲和能力的分离介质；

3.3装柱即得到抗体亲和层析柱，备用；

4).降纤酶的制备：

将经离子交换层析法初步纯化的降纤酶粗品逐渐加入到抗体亲和层析柱中，待流出液在检测仪上绘出稳定的基线后，改用亲和层析洗脱液洗脱活性组分，收集洗脱峰，使被吸附的生物活性物质从亲和介质上解吸下来，测定酶活性，冷冻干燥后即得纯化的降纤酶成品。

一种降纤酶水针制剂的制备方法，它包括下述步骤：

取纯化的降纤酶，将其加入到适量的注射用水中溶解，得溶解液，在每1000ml溶解液中加入5--20g氯化钠稳定剂，分装，即得降纤酶水针制剂。

所述的降纤酶水针制剂的制备方法，它包括下述步骤：取纯化的降纤酶5000u，将其加入到1000ml适量的注射用水中溶解，得溶解液，在每1000ml溶解液中加入9--15g氯化钠稳定剂，无菌分装成1000支制剂，每支含量5u，即得降纤酶水针制剂。

本发明的优点和效果：

本申请人首次将单克隆抗体亲和层析技术应用于降纤酶产品的纯化，操作步骤简单，所得制品纯度高，一次处理蛇毒量大，每次可制备上百毫克降纤酶样品。国内该类产品生产采用多糖为配基的亲和层析，制备工艺可达十几毫克样品，但必须采取多步骤操作才能得到单一组份。

抗体是指能与相应抗原特异结合具有免疫功能的球蛋白。它是机体免疫系统受抗原刺激后，B淋巴细胞活化、增殖并分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的对该抗原有特异亲和力的免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)。

由于免疫刺激物一般是含有多种抗原决定簇的抗原物质，因此这些抗体也是多种抗体的混合物，通常叫多克隆抗体。这种多抗原决定簇的多克隆抗体在抗原抗体反应中会发生交叉反应，出现假阳性结果。随着现代生物技术的发展，发生了分子生物学上的革命，出现了单克隆抗体。

单克隆抗体是将产生抗体的细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆技术，使融合的单一细胞形成单克隆细胞系。由单克隆细胞系产生的这种抗体是针对一个抗原决定簇的免疫细胞分泌的，由于该免疫细胞是单一的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞克隆(融合)产生的可无限传代的细胞系，因而由此产生的抗体叫单克隆抗体。单克隆抗体技术由于具有高度的特异性、亲和性及可工业化大量生产的特点，在医疗方面显示出重要价值。

本发明将单克隆抗体作为一种生物技术手段，利用抗体和抗原的高亲和性和高选择性的特点，将单克隆抗体联接到载体上，对目的物进行特异性亲和层析，即单克隆抗体亲和层析技术。该技术可从生物毒素或生物材料中分离纯化特定的蛋白质或其它不易纯化的物质。

本发明采用的单克隆抗体亲和层析与其它生物分离纯化手段相比具有明显的优势：

·由于单克隆抗体的高度特异性，因而很少造成杂蛋白污染。

·单克隆抗体和与所分离的蛋白质具有特异的亲和力，因此可以在单一的蛋白峰中洗下所分离的蛋白质，避免分离物的稀释或变性。

·对所分离物的浓度要求低，即使该蛋白质在原料中仅占很低的浓度，也可以得到较好地纯化。

·适合大规模工业化生产。

目前，国外的蛇毒类凝血酶制剂均为水针剂，我国现阶段由于制剂水平的限制，为保证长期保存过程中效价的稳定性，均制成冻干粉针，国外同类商品有Ancrod、日本东菱克栓酶等，国外开发蛇毒制剂较我国为早，其单组分类凝血酶的提纯工艺也早就开始应用，并且其制剂水平也明显高于我国，目前国外同类产品的剂型多为注射液，但含防腐剂成分，长期使用对人身健康不利，本

申请人水针剂型的研制成功，表明我国该产品的制剂水平与国际水平的接轨并超过同类产品。

经室温放置3年的稳定性考察，结果表明不加稳定剂的降纤酶水针制剂，3年后的实际效价测定结果已远远达不到质量标准的要求，加入5--20g稳定剂的降纤酶水针制剂，效价测定结果可以达到质量标准的要求，随着稳定剂用量的加大，降纤酶水针制剂的效价越稳定，加入20g以上的稳定剂对实际效价测定与加入20g稳定剂一致。其中以加入9-15g稳定剂为最适范围。

水针剂型的降纤酶与冻干粉针剂型及进口水针制剂东菱克栓酶相比，优势明显，对比结果如下表：

本发明降纤酶水针制剂与冻干粉针剂型及进口水针制剂东菱克栓酶对比表

      制剂降纤酶水针制剂冻干粉针制剂东菱克栓酶原料来源东北白眉蝮蛇白眉蝮蛇或尖吻蝮蛇巴西矛头蝮蛇原料提取工艺特异性亲和层析非特异性亲和层析非特异性亲和层析原料提取周期7天15天原料一次性处理量20g蛇毒5g蛇毒原料收率40万单位/g蛇毒5万单位/g蛇毒原料纯度＞95＞90比活性＞1800u/mg＞1200u/mg赋形剂右旋糖酐保护剂氯化钠三氯叔丁醇多聚体无在冻干及放置中产生无致敏性无有产生的可能性无稳定性室温3年低温2年低温5年

1.保降纤酶水针制剂在保存过程中，无多聚体的产生，更好的避免了过敏性反应产生的可能性；

2.避免了赋形剂对效价测定的影响及冻干过程的效价损失，降纤酶在冻干过程中损失约50％(冻干中投料量为160-200％)，这无形中降低了制品的比活性，增加了患者在使用产品过程中，对异体蛋白的加大注射剂量，同时也增大聚合体产生的可能性，相对容易产生大分子量蛋白的过敏反应；

3.水针剂型的降纤酶中高浓度氯化钠的加入，是本品较加入叔丁醇等防腐剂的制剂具有更好的安全性与稳定性，长期放置3年以上无降解产物与聚合物的产生；

4.原料完全来源于白眉蝮蛇，降纤、溶栓作用缓和，毒性低，安全性更好。

具体实施方式

实施例一

从蛇毒中提取降纤酶的方法包括下述步骤：

1).单克隆抗体的制备：将纯化并定性的从蛇毒中提取的降纤酶(1g/L)与等体积的弗氏佐剂混合乳化后，对7周龄的Balb/C小鼠皮下注射每次0.2ml，2周1次，共免疫3次；融合前3天以0.2ml静脉注射；然后用Koher方法取免疫小鼠脾细胞，将所取的免疫小鼠脾细胞加入1640培养液，得细胞悬液；将所得的细胞悬液与鼠SP2/10骨髓瘤细胞按10∶1比例混合，在50％聚乙二醇作用下融合得融合体；将融合体进行选择性培养，首先筛出能分泌与预定抗原起反应的单抗的杂交瘤细胞，进而从中筛出有预定特异性的杂交瘤细胞，最终选出可供实际应用且具有稳定生长和功能特异的均一细胞克隆，以腹水法获得单克隆抗体，纯化后备用；

2).降纤酶粗品的制备：取由白眉蝮蛇中提取的蛇毒，将蛇毒经离子交换层析法初步纯化，得初步纯化的降纤酶粗品，备用；

3).抗体亲和层析柱的制备：

3.1以琼脂糖4B作为亲和层析的载体，用溴化氰活化该载体，得活化的琼脂糖4B；

3.2取100mg已纯化的单克隆抗体溶于20ml硼酸缓冲液中，过滤，滤液加入亲和层析柱内，然后加入上述活化的琼脂糖4B，在10℃下搅拌反应18小时，得具有特异亲和能力的分离介质；

3.3用10倍柱体积的pH10.2的硼酸缓冲液以5ml/min流速洗涤亲和层析柱柱体，然后再依次用5倍柱体积的pH10.0、0.1mol/L的乙醇胺溶液及pH8.0、0.1mol/L的硼酸缓冲液充分洗涤，最后用pH7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲液平衡，即得到抗体亲和层析柱，备用。该柱可重复使用200次以上，用20％的乙醇可长期保存；

4).降纤酶的制备：

将经离子交换层析法初步纯化的降纤酶粗品逐渐加入到抗体亲和层析柱中，经上述硼酸缓冲液溶解，磷酸盐缓冲液平衡后，利用抗体亲和层析柱的具有特异亲和能力的分离介质的特异选择性吸附生物活性物质，由于杂质与层析介质没有亲和作用，故不能被吸附而洗脱除去；待流出液在检测仪上绘出稳定的基线后，改用亲和层析洗脱液(pH7.8，0.1％Tris-Hcl缓冲液)洗脱活性组分，收集洗脱峰，使被吸附的生物活性物质从亲和介质上解吸下来，测定酶活性，冷冻干燥后即得纯化的降纤酶成品；

5).降纤酶水针制剂的制备：

取上述纯化的降纤酶5000u，将其加入到1000ml的注射用水中溶解，得溶解液，在溶解液中加入10g氯化钠为稳定剂，无菌分装成1000支制剂，每支

含量5u，实测效价4.94u。

本制剂室温放置3年，测定效价4.82u。

实施例二

从蛇毒中提取降纤酶的方法包括下述步骤：

1).单克隆抗体的制备：将纯化并定性的从蛇毒中提取的降纤酶(1g/L)与等体积的弗氏佐剂混合乳化后，对小鼠免疫；然后用Koher方法取上述免疫的脾细胞，将所取的脾细胞加入1640培养液，得细胞悬液；将所得的细胞悬液与SP2/10骨髓瘤细胞按8∶1比例混合，在80％聚乙二醇作用下融合得融合体；将融合体进行选择性培养，首先筛出能分泌与预定抗原起反应的单抗的杂交瘤细胞，进而从中筛出有预定特异性的杂交瘤细胞，最终选出可供实际应用且具有稳定生长和功能特异的均一细胞克隆，以腹水法获得单克隆抗体，纯化后备用；

2).降纤酶粗品的制备：取由白眉蝮蛇中提取的蛇毒，将蛇毒经离子交换层析法初步纯化，得初步纯化的降纤酶粗品，备用；

3).抗体亲和层析柱的制备：

3.1琼脂糖4B作为亲和层析的载体，用溴化氰活化该载体，得活化的琼脂糖4B；

3.2取100mg已纯化的单克隆抗体溶于18ml硼酸缓冲液中，过滤，滤液加入亲和层析柱内，然后加入上述活化的琼脂糖4B，在20℃下搅拌反应小时，得具有特异亲和能力的分离介质；

3.3用10倍柱体积的pH10.2的硼酸缓冲液以6ml/min流速洗涤亲和层析柱柱体，然后再依次用5倍柱体积的pH10.0、0.1mol/L的乙醇胺溶液及pH8.0、0.1mol/L的硼酸缓冲液充分洗涤，最后用pH7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲液平衡，即得到抗体亲和层析柱，备用，该柱可重复使用200次以上，用20％的乙醇可长期保存。

4).降纤酶的制备：

将经离子交换层析法初步纯化的降纤酶粗品逐渐加入到抗体亲和层析柱中，经上述硼酸缓冲液溶解，磷酸盐缓冲液平衡后，利用抗体亲和层析柱的具有特异亲和能力的分离介质的特异选择性地吸附生物活性物质，由于杂质与层析介质没有亲和作用，故不能被吸附而洗脱除去；待流出液在检测仪上绘出稳定的基线后，改用亲和层析洗脱液(pH7.8，0.1％Tris-Hcl缓冲液)洗脱活性组分，收集洗脱峰，使被吸附的生物活性物质从亲和介质上解吸下来，测定酶活性，冷冻干燥后即得纯化的降纤酶成品；

5)、降纤酶水针制剂的制备：

取降纤酶5000u，将其加入到1000ml的注射用水中溶解，得溶解液，在溶解液中加入9g氯化钠为稳定剂，无菌分装成1000支制剂，每支含量5u，实测效价4.97u。

本制剂室温放置3年，测定效价4.69u。

实施例三

从蛇毒中提取降纤酶的方法包括下述步骤：

1).单克隆抗体的制备：将纯化并定性的从蛇毒中提取的降纤酶(1g/L)与等体积的弗氏佐剂混合乳化后，对小鼠免疫；然后用Koher方法取上述免疫的小鼠的脾细胞，将所取的免疫小鼠的脾细胞加入1640培养液，得细胞悬液；将所得的细胞悬液与小鼠SP2/10骨髓瘤细胞按15∶1比例混合，在30％聚乙二醇作用下融合得融合体；将融合体进行选择性培养，首先筛出能分泌与预定抗原起反应的单抗的杂交瘤细胞，进而从中筛出有预定特异性的杂交瘤细胞，最终选出可供实际应用且具有稳定生长和功能特异的均一细胞克隆，以腹水法获得单克隆抗体，纯化后备用；

2).降纤酶粗品的制备：取由白眉蝮蛇中提取的蛇毒，将蛇毒经离子交换层析法初步纯化，得初步纯化的降纤酶粗品，备用；

3).抗体亲和层析柱的制备：

3.1琼脂糖4B作为亲和层析的载体，用溴化氰活化该载体，得活化的琼脂糖4B；

3.2取100mg已纯化的单克隆抗体溶于18ml硼酸缓冲液中，过滤，滤液加入亲和层析柱内，然后加入上述活化的琼脂糖4B，在20℃下搅拌反应小时，得具有特异亲和能力的分离介质；

3.3用10倍柱体积的pH10.2的硼酸缓冲液以6ml/min流速洗涤亲和层析柱柱体，然后再依次用5倍柱体积的pH10.0、0.1mol/L的乙醇胺溶液及pH8.0、0.1mol/L的硼酸缓冲液充分洗涤，最后用pH7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲液平衡，即得到抗体亲和层析柱，备用。该柱可重复使用200次以上，用20％的乙醇可长期保存；

4).降纤酶的制备：

将经离子交换层析法初步纯化的降纤酶粗品逐渐加入到抗体亲和层析柱中，经上述硼酸缓冲液溶解，磷酸盐缓冲液平衡后，利用抗体亲和层析柱的具有特异亲和能力的分离介质的特异选择性地吸附生物活性物质，由于杂质与层析介质没有亲和作用，故不能被吸附而洗脱除去；待流出液在检测仪上绘出稳定的基线后，改用亲和层析洗脱液(pH7.8，0.1％Tris-Hcl缓冲液)洗脱活性组分，收集洗脱峰，使被吸附的生物活性物质从亲和介质上解吸下来，测定酶活性，冷冻干燥后即得纯化的降纤酶成品。

5).降纤酶水针制剂的制备：

取降纤酶5000u，将其加入到1000ml的注射用水中溶解，得溶解液，在溶解液中加入5g氯化钠为稳定剂，无菌分装成1000支制剂，每支含量5u，实测效价4.89u。

本制剂室温放置3年，测定效价4.28u。

实施例四

降纤酶水针制剂的制备：取降纤酶5000u，将其加入到1000ml的注射用水中溶解，得溶解液，在溶解液中加入15g氯化钠为稳定剂，无菌分装成1000支制剂，每支含量5u，实测效价4.92u。

本制剂室温放置3年，测定效价4.93u。

实施例五

降纤酶水针制剂的制备：取降纤酶5000u，将其加入到1000ml的注射用水中溶解，得溶解液，在溶解液中加入12g氯化钠为稳定剂，无菌分装成1000支制剂，每支含量5u，实测效价4.91u。

本制剂室温放置3年，测定效价4.88u。

实施例六

降纤酶水针制剂的制备：取降纤酶5000u，将其加入到1000ml的注射用水中溶解，得溶解液，在溶解液中加入20g氯化钠为稳定剂，无菌分装成1000支制剂，每支含量5u，实测效价4.99u。

本制剂室温放置3年，测定效价4.96u。