一种适用于流式细胞术检测倍性的贝类样品制备方法

摘要

本发明公开一种适用于流式细胞术检测倍性的贝类样品制备方法。它从幼虫、稚贝、幼贝或成贝获取生物样品；往生物样品中加入细胞核分离液，振荡、研磨或剁切制备成匀浆状，静置沉淀得上清悬浮液；将上清悬浮液转移到离心管，离心去除上清液，收集游离的单细胞核；再往单细胞核中加入细胞核固定液I，重新悬浮细胞核；然后离心去除上清液，收集游离的单细胞核；再往单细胞核中加入细胞核固定液II，悬浮细胞核，制成可在常温下保存或长途运输，以备用于流式细胞仪检测的单细胞核样品。本发明适用于流式细胞仪的检测，具有稳定的高检出率。

说明书

技术领域

本发明涉及贝类的倍性检测技术，特别提供了适用于流式细胞术检测倍性的贝类样品的制备方法。

背景技术

海洋贝类是我国海水养殖的主导种类，在我国的海水养殖业中占有举足轻重的地位。目前我国海水养殖的贝类基本上都是野生型的，难以适应逐渐恶化的养殖环境。因此，利用生物技术培育优良的养殖品种，是当前乃至未来发展海水贝类养殖亟待解决的关键问题之一。以多倍体诱发技术为主的贝类细胞遗传技术是目前贝类遗传育种中最活跃和最具应用价值的一个领域。三倍体贝类具有许多优良生产性状，是一类很有价值的养殖贝类新品系。目前通常采用理化方法人工诱导多倍体，倍化率很难达到100％，并且因各种环境和生物因子不同，多倍体的倍化率差异很大。因此，多倍体的检测和鉴定是多倍体培育研究必不可少的关键一环。在贝类多倍体诱导的各个阶段都需要快速准确的倍性鉴定，以判明人工诱导是否有效。比如，在幼虫或幼体的培育过程中是否发生生物污染或其他事件而导致多倍体的比例下降等；多倍体成体在海上养殖过程中，是否因发生异常死亡或海区的自然种苗的附着等导致多倍体组成比例下降等。倍性的检测需要贯穿多倍体研究的整个过程，因此高效倍性检测技术具有极端重要性。

在我国绝大部分从事海洋生物技术研发的高校或科研机构，基本上采用染色体计数方法进行人工诱导多倍体的倍性鉴定。但这一方法样品制备过程复杂，费时费力，制备的样品经过显微观察才能评定样品质量，经常由于样品质量不佳而无法获得足够的染色体分裂相，导致样品的倍性鉴定失败。

流式细胞术是对单个细胞或其他生物微粒进行快速定量分析与分选的一门新技术。其原理是将悬浮在液流中的单细胞逐个通过测量区，用仪器检测细胞的光学参数而达到快速、大量地测定细胞的一系列物理特性和生化特性。自20世纪80年代以来，流式细胞术在国际贝类多倍体研究得到广泛利用。这一技术的最显著的优势是能快速准确地分析大量样品的DNA含量，其检测速度之快，统计学精度之高，是染色体计数等其他方法无法比拟的，已成为贝类多倍体研究的最有效的研究手段之一。

影响流式细胞术分析成败的关键因素之一是样品制备质量。用于流式细胞仪分析的样品必须是单细胞悬液，因此在检测前就需要将待检测的生物材料(幼虫、幼体或成体)制成单细胞悬液。样品制备过程发生细胞粘连、团块及细胞重叠等都严重影响检出率和分析结果的精确性。样品若在制备保存过程中因发生降解而产生过多杂质碎片，则会造成分析失败。流式细胞仪价格昂贵，目前国内仅屈指可数几家科研单位拥有该设备，其他单位必须将制备的样品送交拥有流式细胞仪的科研机构进行检测。另一方面，海洋贝类的多倍体诱导培育研究，多数是在偏远的海滨实验场或苗种培育场进行，需要将样品送回科研机构检测。近年来，由于样品制备质量不佳导致分析失败屡屡发生，未能充分发挥流式细胞术的优越性，严重影响了多倍体诱导研究的开展。国外多倍体研究也面临类似的问题。

目前流式细胞术样品的制备，要求活体样品或冷冻保存的固定样品，对幼虫或幼体来说，要保持其活力需要苛刻的运输条件，包括用海水作媒介、充氧、低温等，为运送样品造成了很大的局限性。国外学者尝试利用甲醇/冰醋酸固定液或乙醇固定样品，在常温下运输，研究发现运输费时3～5天的这些固定样品在流式细胞仪上的检出率很低，通常为10～30％，对发育后期的眼点幼虫等样品，基本上无法检测。由此可见，普通的固定方法制备的生物样品，远达不到流式细胞术对检测样品的要求。国内外海洋水产界都迫切需要一种新的流式细胞术样品制备方法，实现在常温长时间保存下的高检出率。到目前为止国内外还未见成熟可行的适用于贝类的流式细胞术常温保存样品的制备方法的报道。

发明内容

为了解决上述贝类流式细胞术分析样品的制备方法问题，本发明的目的是提供了一种适用于利用流式细胞术进行贝类的倍性检测的样品制备方法，实现贝类各类样品在常温下保存和长途运输，样品在流式细胞仪上具有稳定的高检出率。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

从待检测的贝类获取生物样品，制备贝类样品的单细胞核悬浮液，进行细胞核固定；具体按如下步骤操作：

1)从幼虫、稚贝、幼贝或成贝获取生物样品；

2)往生物样品中加入每毫克1～3mL细胞核分离液，振荡、研磨或剁切5～10min，制备成匀浆状，静置沉淀5～15min，得上清悬浮液；

3)将所述上清悬浮液转移到离心管，以1000～3000r/min离心1～5min，去除上清液，收集游离的单细胞核；

4)往所述单细胞核中加入细胞核固定液I，加入量为每毫克单细胞核5～15mL，重新悬浮细胞核；

5)以1000～3000r/min离心1～5min，去除上清液，收集游离的单细胞核；

6)往步骤5)所述单细胞核中加入细胞核固定液II，加入量为每毫克单细胞核5～15mL，悬浮细胞核，制成的单细胞核样品可在常温下保存或长途运输，以备用于流式细胞仪的检测。

其中：检测的对象(生物样品)包括贝类的幼虫、稚贝、幼贝或成贝的全部软体部或部分组织，适用的组织包括鳃组织、闭壳肌以及外套膜；获取幼虫样品采用筛绢网过滤和离心的方法，所用的筛绢网的孔径为20～100μm；获取幼贝或成贝的组织采用解剖方法，所用解剖工具可以为解剖剪或解剖镊；当获取的生物样品为幼虫、稚贝时，获取的过程中每1毫克样品加入等渗缓冲液0.2～1mL；

所述细胞核分离液，按体积百分比计，其成分为每100份等渗缓冲液中含有1～10份Triton X-100；所述等渗缓冲液PBS，按体积百分比计，其成分由70～85份Na₂HPO₄和15～30份NaH₂PO₄组成；所述细胞核固定液I，按体积百分比计，其成分为70～90份80～95％体积百分比浓度的乙醇水溶液和10～30份等渗缓冲液组成；酸碱度(pH值)为7.0～8.0；所述细胞核固定液II，按体积百分比计，其成分为60～80％浓度的乙醇水溶液。

本发明具有如下优点：

1.本发明方法简便可行，所用的均为常见的试剂、器材等，适用于实验条件相对较差的贝类种苗培育场。

2.采用本发明所制备的贝类样品，实现了在常温下长期保存和运输，并且样品在流式细胞仪上的检出率高且稳定(实施例可以证明，保存6个月时检出率可达100％)，灵敏度高。本发明彻底克服了普通方法制备的样品需要冷冻保存和运输的局限性。

3.应用范围广。本发明适用于各种贝类以及贝类各个发育阶段的样品。可应用于包括牡蛎、扇贝、蚶、青蛤、硬壳蛤、鲍等种类，包括各个发育期的幼虫、稚贝、幼贝和成贝。

4.采用本发明制备的生物样品可以满足批量样品的倍性检测；可以对成贝实施活体倍性检测，本发明提供了进行贝类多倍体倍性鉴定的高效手段。

具体实施方式

以下给出几个典型实施例，但本发明并不局限在以下实施例中。

实施例1

利用本发明方法，进行长牡蛎的多倍体幼虫样品制备，具体操作为：

1)采用孔径为80μm的筛绢过滤，去除大部分的海水，分别获取牡蛎二倍体和人工诱导三倍体的眼点幼虫各60000个，分别盛于1.5mL离心管，以2000rpm离心4min，去除上清的海水；加入按每5毫克样品1mL量的等渗缓冲液PBS 1mL(其成分为：70～85份Na₂HPO₄和15～30份NaH₂PO₄，本实施例采用Na₂HPO₄ 85份，NaH₂PO₄ 15份)，以2000rpm离心4min，去上清，收集幼虫。

2)加入按每1毫克样品2mL量的细胞核分离液10mL(每100份等渗缓冲液中含有Triton X-100 1～10份，本实施例为含Triton X-100 1％的PBS)，采用研磨器、组织匀浆器研磨、或振荡、或解剖刀片剁切5～10min，本实施采用研磨器研磨5min，进行组织和细胞分离，静置沉淀15min，上清悬浮液；

3)而后将所述上清悬浮液转移到15mL离心管，以2000r/min离心5min，去除上清液，获得游离单细胞核；

4)往所述收集到的每1毫克游离单细胞核加入细胞核固定液I(成分为：70～90份80～95％体积百分比浓度的乙醇水溶液和10～30份等渗缓冲液PBS，pH值为7.0～8.0，本实施例采用80％乙醇的水溶液90份，PBS 10份，调整pH值为7.0，)5mL，重新悬浮细胞核；

5)以2000r/min离心5min，去除上清，再次收集单细胞核；

6)往所述步骤5)中收集到的每1毫克游离单细胞核加入细胞核固定液II(成分为：成分为60～80％体积百分比浓度的乙醇水溶液，本实施例采用75％的乙醇水溶液)5mL，重新悬浮细胞核。即可获得适用于流式细胞术检测倍性的、可在常温下保存或长途运输的贝类样品。

所述样品保存6个月后，利用流式细胞仪上机检测，样品的检出率为100％。

实施例2

利用本发明方法，进行栉孔扇贝的多倍体幼虫样品制备，具体操作为：

1)采用20μm筛绢过滤海水，收集浓缩的扇贝面盘幼虫，二倍体和人工诱导三倍体的幼虫各500000个，分别盛于2.0mL离心管，以3000rpm离心5min，去上清的海水；按每5毫克样品1mL的量加入等渗缓冲液PBS3mL(其成分为：Na₂HPO₄ 80份，NaH₂PO₄ 20份)，以3000rpm离心5min，去上清，收集幼虫。

2)往所述收集的幼虫按每1毫克样品1mL的量加入细胞核分离液15mL(本实施例为含Triton X-100 5％的PBS)，在涡旋振荡器上振荡6min，而后静置沉淀15min，得上清悬浮液；

3)而后将所述上清悬浮液转移到15mL离心管，以3000r/min离心5min，去除上清液，获得游离单细胞核；

4)往所述收集到的每1毫克游离单细胞核加入细胞核固定液I(成分为：90％乙醇的水溶液80份，PBS 20份，调整pH值为7.5)12mL，重新悬浮细胞核；

5)以3000r/min离心5min，去除上清，再次收集单细胞核；

6)往所述步骤5)收集到每毫克的游离单细胞核加入细胞核固定液II(成分为：70％的乙醇水溶液)12mL，重新悬浮细胞核。即可获得适用于流式细胞术检测倍性的、可在常温下保存或长途运输的贝类样品。

样品保存6个月。利用流式细胞仪上机检测，样品的检出率为100％。

实施例3

利用本发明方法，进行皱纹盘鲍的多倍体幼贝的样品制备，具体操作为：

1)分别获取皱纹盘鲍二倍体和人工诱导三倍体的幼贝各30个样品；

2)往幼贝中按每1毫克2mL量加入细胞核分离液20mL(本实施例为含Triton X-100 2％的PBS)，采用解剖刀片剁切幼贝10min，进行组织和细胞分离，静置沉淀10min，得上清悬浮液；

3)而后将所述上清悬浮液转移到15mL离心管，以1000r/min离心2min，去除上清液，获得游离单细胞核；

4)往所述收集的每1毫克游离单细胞核加入细胞核固定液I(成分为：95％乙醇的水溶液90份，PBS 10份，调整pH值为8.0)10mL，重新悬浮细胞核；

5)以1000r/min离心2min，去除上清，再次收集单细胞核；

6)往步骤5)收集到的每1毫克游离单细胞核加入细胞核固定液II(成分为：60％的乙醇水溶液)10mL，重新悬浮细胞核。即可获得适用于流式细胞术检测倍性的、可在常温下保存或长途运输的贝类样品。

所述样品保存6个月后，利用流式细胞仪上机检测，样品的检出率为100％。

实施例4

利用本发明方法，进行硬壳蛤的多倍体稚贝样品制备，具体操作为：

1)采用孔径为100μm的筛绢过滤去除大部分的海水，分别获取硬壳蛤稚贝二倍体和人工诱导三倍体各200个，盛于1.5mL离心管，以1500rpm离心3min，去除上清的海水；按每5毫克1mL的量加入等渗缓冲液PBS 1mL，(其成分为：70～85份Na₂HPO₄和15～30份NaH₂PO₄，本实施例采用Na₂HPO₄ 70份，NaH₂PO₄ 30份)，以1500rpm离心3min，去上清，收集幼虫。

2)按每1毫克2mL的量加入细胞核分离液10mL(本实施例为含TritonX-100 3％的PBS)，采用组织匀浆器研磨7min，进行组织和细胞分离，静置沉淀12min，得上清悬浮液；

3)而后将所述上清悬浮液转移到15mL离心管，以1500r/min离心3min，去除上清液，获得游离单细胞核；

4)往所述收集的每1毫克游离单细胞核加入细胞核固定液I(成分为：85％乙醇的水溶液70份，PBS 30份，调整pH值为7.0)15mL，重新悬浮细胞核；

5)以1500r/min离心3min，去除上清，再次收集单细胞核；

6)往步骤5)所收集到的每1毫克游离单细胞核加入细胞核固定液II(采用70％的乙醇水溶液)15mL，重新悬浮细胞核。即可获得适用于流式细胞术检测倍性的、可在常温下保存或长途运输的贝类样品。

所述样品保存6个月后，利用流式细胞仪上机检测，样品的检出率为100％。

实施例5

利用本发明方法，进行泥蚶的多倍体成贝样品制备，具体操作为：

1)使用解剖剪和解剖镊，分别从泥蚶二倍体和人工诱导三倍体的各20个成贝中获取鳃组织；

2)往获得的鳃组织按每1毫克3mL的量加入细胞核分离液15mL(本实施例为含Triton X-100 5％的PBS)，采用解剖刀片剁切10min，进行组织和细胞分离，静置沉淀5min，得上清悬浮液；

3)而后将所述上清悬浮液转移到15mL离心管，以2000r/min离心3min，去除上清液，获得游离单细胞核；

4)往所述收集的每1毫克游离单细胞核加入细胞核固定液I(成分为：90％乙醇的水溶液70份，PBS 30份，调整pH值为7.8)8mL，重新悬浮细胞核；

5)以2000r/min离心3min，去除上清，再次收集单细胞核；

6)往步骤5)所收集到的每1毫克游离单细胞核加入细胞核固定液II(成分为：成分为60～80％浓度的乙醇水溶液，本实施例采用75％的乙醇水溶液)8mL，重新悬浮细胞核。即可获得适用于流式细胞术检测倍性的、可在常温下保存或长途运输的贝类样品。

所述样品保存6个月后，利用流式细胞仪上机检测，样品的检出率为100％。