五元硫杂环类化合物及其用于制备治疗和预防肥胖相关疾病的药物的用途

摘要

本发明涉及通式I的反式五元硫杂环类化合物，其消旋体或旋光异构体或其可药用的盐或水合物或含有所述化合物的药物组合物，式中I各取代基团的定义如权利要求书所述。本发明还涉及通式I化合物的制备方法以及这些化合物用于制备减肥及抗肿瘤药物的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及通式I的五元硫杂环类化合物及其制备方法，包含上述化合物的药物组合物，以及该化合物用于制备治疗和/或预防肥胖症、非胰岛素依赖型糖尿病及其并发症、冠心病、高血压、高血脂等肥胖并发症以及肿瘤及其并发症的药物的用途。

背景技术

肥胖症是受生物行为和环境等因素共同影响的一种多因素的慢性疾病。当人体进食热量多于消耗的热量时，多余热量以脂肪形式储存于体内，因体脂增加使体重指数(BMI)增大。BMI的定义为：BMI＝体重(kg)/身高²(m²)，BMI大于24者为肥胖症患者。随着经济的发展，人们生活水平的提高，近年来全世界肥胖症患者正以每5年增长一倍的趋势日益增多，目前全球至少有肥胖症患者2.5亿，约占总人口总数的7％(Claude B.，The New England Journal ofMedicine，2000，343：1888-1889)。肥胖症不仅影响美观，还可以引发冠心病、高血压、高血脂、非胰岛素依赖型糖尿病和某些恶性肿瘤(Must A，et al.，J.Am.Med.Assos，1999，282：1523)。因此，对肥胖症的预防和治疗具有十分重要的临床意义。目前治疗肥胖症的药物按其作用机制主要分为三大类。第一类是食欲抑制剂，代表药物是西布曲明(Sibutramine)，它是中枢性食欲抑制剂，抑制去甲肾上腺素和5-羟色胺的再摄取，使人产生饱胀感，降低食欲，减少进食。其常见的副作用有口干、恶心、厌食、腹痛、便秘、失眠等，且有轻度的增加血压和心率作用。第二类是消化吸收阻滞剂，代表药物是奥利司他(Olistat)，它通过抑制胰脂肪酶，阻断脂肪被分解成小分子的甘油三脂。其常见的副作用包括引起病人胃肠功能紊乱、降低病人对脂溶性维生素的吸收。第三类是代谢刺激剂，如甲状腺素、β3受体激动剂等(周予昭，黄仲义，中国药房，2000，11(4)，168-169)。

最近的研究表明，以脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase，FAS)为靶标，通过抑制脂肪酸的合成和抑制食欲可以达到减肥的目的，同时还可以改善非胰岛素依赖的糖尿病，降低高血压，冠脉栓塞及其它肥胖并发症的发病率(Loftus TM，Jaworsky DE，Frehywot GL，Townsend CA，Ronnett GV，Lane MD，Kuhajda FP，Reduced foodintake and body weight in mice treated with fatty acidsynthase inhibitors，Science，2000，288：2379-81)。对脂肪酸合成酶特异性抑制剂的作用机理研究表明，脂肪酸合成酶抑制剂可减少脂肪酸的合成，由于脂肪酸合成受阻，导致其底物丙二酰辅酶A(malonyl-CoA)浓度升高，丙二酰辅酶A可以直接作用于下丘脑的进食中枢，抑制促进摄食的神经肽Y(NPY)的分泌，从而导致进食抑制。另一方面，在外周组织如肝脏和脂肪组织中，脂肪酸合成酶抑制剂可以提高肉毒碱软脂酰转移酶-1(O-carnitinepalmitoyltransferase-1，CPT-1)的活性，从而增强脂肪酸的氧化和能量的消耗。药理学实验还显示，脂肪酸合成酶特异性抑制剂的毒副作用较小，并且对食欲的抑制可产生自身的反馈调节(Thupari JN，Landree LE，Ronnett GV，Kuhajda FP，C75 increases peripheralenergy utilization and fatty acid oxidation in diet-inducedobesity，Proc Natl Acad Sci，USA，2002，99：9498-502)。

发明内容

本发明的目的是寻找并且开发作用于脂肪酸合成酶(FAS)的小分子抑制剂，通过其抑制脂肪酸合成酶，一方面减少脂肪酸的合成和富集；一方面可增加底物丙二酰辅酶A的浓度，直接作用于下丘脑的进食中枢，抑制进食，通过代偿性消耗体内过多的脂肪从而达到减肥的目的。同时还可改善非胰岛素依赖的糖尿病，降低高血压、冠脉栓塞及其它肥胖并发症的发病率。由于FAS酶在某些肿瘤组织，如结肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌等高表达，因此，本发明还可进一步作为抗癌药物。另外本发明化合物应用于家畜、家禽的饲养，可以减少其肉类中的脂肪含量。

本发明涉及通式I反式五元硫杂环类化合物，其消旋体或旋光异构体或其可药用盐或水合物。本发明已经发现通式I化合物可以用于治疗肥胖症及由其引起的多种并发疾病。

其中：

R₁为C₃～C₁₈直链或支链烷基，C₃～C₁₈直链或支链烯基，

R₂为H，C₁～C₄直链或支链烷基，CF₃，

R₃为H，＝CH₂，＝CX₂，＝CHX，

X为C₁～C₃直链或支链烷基，F，Cl，Br。

本发明另一方面涉及药物组合物，其包括至少一种通式I化合物的消旋体或旋光异构体或者其药用盐或其水合物以及药用载体或赋形剂。

本发明另一方面还涉及制备通式I和/或通式II化合物的新的合成方法。

本发明另一方面还涉及至少一种式I化合物的消旋体或旋光异构体或者其药用盐或水合物用于制备预防和/或治疗肥胖及由其所导致的各种疾病的药物的用途。

本发明涉及的式I化合物对有高度的脂肪酸合成酶表达的某些肿瘤细胞有一定的抑制或细胞毒作用，因此，式I化合物或者其药用盐或其水合物可用于如结肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌等肿瘤或其症状的缓解或治疗。

本发明所公开的化合物可作用的脂肪酸合成酶不局限于人体，还包括动物体内的脂肪酸合成醇，它可导致鸡、鸭等家禽和猪等家畜的脂肪水平降低，因而本发明公开的化合物及含有该化合物的组合物可以用于饲养低脂高瘦肉型的家禽和家畜。

更具体地，本发明涉及通式I的反式五元硫杂环类化合物，包括其消旋体或旋光异构体或其可药用盐或水合物。

其中：

R₁为C₃～C₁₈直链或支链烷基，C₃～C₁₈直链或支链烯基，

R₂为H，C₁～C₄直链或支链烷基，CF₃，

R₃为H，CH₂，＝CX₂，＝CHX，

X为C₁～C₃直链或支链烷基，F，Cl，Br。

本发明优选的化合物为通式II所代表的反式异构体，包括其消旋体或旋光异构体或其可药用盐或水合物，

其中：

R₁为C₃～C₁₈直链或支链烷基，C₃～C₁₈直链或支链烯基。

本发明特别优选的化合物或其药用盐或水合物为，

反式-2-氧代-3-亚甲基-5-正己基-四氢噻吩-4-甲酸

反式-2-氧代-3-亚甲基-5-正庚基-四氢噻吩-4-甲酸

反式-2-氧代-3-亚甲基-5-正辛基-四氢噻吩-4-甲酸

反式-2-氧代-3-亚甲基-5-正壬基-四氢噻吩-4-甲酸

反式-2-氧代-3-亚甲基-5-正癸基-四氢噻吩-4-甲酸

反式-2-氧代-3-亚甲基-5-正十一基-四氢噻吩-4-甲酸

本发明另一方面还涉及制备通式I和/或通式II化合物的新的合成方法，按照下述的合成反应方案，由已知的起始原料可方便地制备出本发明的化合物。

1).将式III的膦酸酯衍生物与式IV的烷基或烯基醛衍生物反应，

R₁CHO_IV

其中R₁的定义同通式I化合物，

得到式V的化合物，

其中R₁的定义同通式I化合物。

2).将式V化合物与硫代乙酸、盐酸及三氟醋酸反应得到式VI化合物，此反应为包括一立体选择性的合环过程，可得到反式异构体VI。

其中R₁的定义同通式I化合物。

3).将式VI化合物与镁甲基碳酸酯试剂(CH₃OCO₂MgOCH₃)反应，得到通式VII化合物，

再将通式VII的化合物与由醋酸、甲醛、N-甲基苯胺和无水醋酸钠组成的Stock溶液反应，分离得到通式II反式异构体化合物。

4).将通式II化合物在二氯亚砜(SO₂Cl₂)或DCC等催化剂作用下，与烷基或烯基醇R2OH进行酯化反应，分离纯化得到其中R3为＝CH₂的通式I反式异构体化合物，

其中R₁和R₂的定义同通式I的定义。

通式I和通式II化合物的合成反应方案详见下列反应路线，

其中R1和R2取代基的定义同通式I。

反应步骤1：

在惰性气体如氮气的保护下，将磷酸三乙酯(Acros试剂)、氢化钠(NaH 60％；北京试剂公司购买)的干燥四氢呋喃的混悬液与溴代乙酸乙酯(BrCH₂CO₂Et，北京试剂公司购买)反应，0℃-50℃搅拌2-48小时，用乙酸乙酯提取，有机层干燥，浓缩。将得到的桔黄色液体III与烷基或烯基醛(Acros试剂，或按照文献Jendralla H，etal，Tetrahedron Lett，1990，31：2545提供的方法制备)在二异丙基氨基锂(LDA，Aldrich试剂)或氢化钠催化下搅拌2-48小时。经处理浓缩得淡黄色液体。依次与三氟醋酸/水(1∶1～20∶1)、氢氧化钠的水溶液反应。经酸化、分液提取、干燥、浓缩，得到的粗产品经闪式柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯/冰醋酸系统)，得化合物V(反式/顺式＝2/1)。其中R1的定义同通式I。

反应步骤2：

将化合物V与硫代乙酸(Acros试剂)于60～90℃反应30分钟～48小时，产物在氮气存在下，分别与盐酸水溶液和三氟醋酸回流，经后处理得黑色油状液，闪式柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯/冰醋酸系统)得化合物VI。其中R1的定义同通式I。

反应步骤3：

将化合物VI与镁甲基碳酸酯试剂(Aldrich试剂，CH₃OCO₂MgOCH₃ 2.0M/DMF)在氮气流中共同于135-140℃反应24小时～168小时，在二氯甲烷存在下与盐酸反应，得到的粗品在氮气保护下加入Stock溶液(20ml醋酸、15ml 37％的甲醛液、5.2ml N-甲基苯胺、600mg无水醋酸钠)于0～40℃反应20分钟～4小时。反应液用乙醚提取，醚层干燥、浓缩。得到的粗品经闪式柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯/冰醋酸系统)，得通式化合物II。其中R1的定义同通式I。

反应步骤4：

将通式II的化合物在二氯亚砜(SO₂Cl₂)或DCC等催化剂作用下，与烷基或烯基醇R2OH(Aldrich试剂)进行酯化反应，分离纯化得到其中R3为＝CH₂的通式I的反式异构体化合物，其中R₁和R₂的定义同通式I的定义。

我们出乎意料地发现，在通式VI化合物的合成过程中，涉及一步立体选择性的关环的环化过程，可立体选择性地得到以反式异构体为主要产物的通式VI化合物。按照本发明提供的制备通式I和通式II化合物的新的合成方法，可立体选择性地合成通式I和II化合物的反式异构体。

本发明可以采用不对称合成得到单一的旋光异构体。但是对外消旋体的拆分是获得光学纯化合物的主要手段。拆分方法主要有以下四种：结晶法、层析法、动力学法和酶法。对于本发明涉及的化合物消旋体的拆分，优选有实用价值的结晶法：向消旋体的水、有机溶剂或水和有机溶剂形成的混合溶剂的溶液中加入一种手性碱(拆分剂)，形成非对映异构体，利用非对映异构体在溶剂中的溶解度不同而使其中之一优先析出。优选的手性碱可以是麻黄碱等，而层析法主要使用HPLC手性柱进行分离得到单一光学纯度的化合物。

本发明的另一个方面涉及药物组合物，其含有本发明化合物的消旋体或旋光异构体和至少一种药学上可接受的载体，其可用于体内治疗并具有生物相容性。所述药物组合物可以根据不同给药途径而制备成各种形式。本发明所提及的化合物也可以被制备成各种药学可接受的盐。

本发明的药物组合物包括有效剂量的本发明式I化合物或其可药用盐或水合物和一种或多种适宜的可药用载体。这里的药用载体包括但不限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白如人血白蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘油，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜂蜡，羊毛脂。

本发明化合物是一类脂肪酸合成酶抑制剂，与美国专利US5981575中提及的化合物C75相比，本发明化合物具有更好的脂肪酸合成酶的抑制活性及更加明显的减肥效果和更好的稳定性，特别适合工业化生产和长期储存。本发明的化合物可以用作但不局限于治疗肥胖症、II型糖尿病及其并发症、冠心病、高血压以及高血脂等肥胖并发症。

本发明也可以扩展应用于制备抗肿瘤及其并发症药物的用途。由于某些肿瘤细胞有高度的FAS表达，本发明涉及的化合物对某些肿瘤细胞有一定的抑制或细胞毒作用，因此，式I化合物或者其药用盐或其水合物可用于如结肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌等肿瘤或其症状的缓解或治疗。另外含有本发明公开的化合物及其组合物可以用于降低鸡、鸭等家禽和猪等家畜的脂肪水平，饲养低脂高瘦肉型的家禽和家畜。含有本发明的化合物的用药方案可以根据所涉及的用途进行变化。

本发明化合物的药物组合物可以以下面的任意方式施用：口服，喷雾吸入，直肠用药，鼻腔用药，颊部用药，局部用药，非肠道用药，如皮下，静脉，肌内，腹膜内，鞘内，心室内，胸骨内和颅内注射或输入，或借助一种外植储器用药。其中优选口服、腹膜内或静脉内给药方式。

当口服用药时，本发明化合物可制成任意口服可接受的制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊、水溶液或水悬浮液。其中，片剂使用的载体一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬脂酸镁。胶囊制剂使用的稀释剂一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。水悬浮液制剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用。如果需要，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。

当局部用药时，特别是治疗局部外敷容易达到的患面或器官，如眼睛、皮肤或下肠道神经性疾病时，可根据不同的患面或器官将本发明化合物制成不同的局部用药制剂形式，具体说明如下：

当眼部局部施用时，本发明化合物可配制成一种微粉化悬浮液或溶液的制剂形式，所使用载体为等渗的一定pH的无菌盐水，其中可加入也可不加防腐剂如氯化苄基烷醇盐。对于眼用，也可将化合物制成膏剂形式如凡士林膏。

当皮肤局部施用时，本发明化合物可制成适当的软膏、洗剂或霜剂制剂形式，其中将活性成分悬浮或溶解于一种或多种载体中。软膏制剂可使用的载体包括但不限于：矿物油，液体凡士林，白凡士林，丙二醇，聚氧化乙烯，聚氧化丙烯，乳化蜡和水；洗剂或霜剂可使用的载体包括但不限于：矿物油，脱水山梨糖醇单硬脂酸酯，吐温60，十六烷酯蜡，十六碳烯芳醇，2-辛基十二烷醇，苄醇和水。

本发明化合物还可以无菌注射制剂形式用药，包括无菌注射水或油悬浮液或无菌注射溶液。其中，可使用的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。

另外需要指出，本发明化合物的使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、化合物的活性强度、服用时间、代谢速率、病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。优选的使用剂量介于0.01～100mg/kg体重/天，其中最优剂量在1mg/kg-50mg/kg体重/天。

附图说明

图1化合物S8抑制FAS活性量-效曲线

图2化合物S8抑制FAS活性时-效曲线

图3化合物S8对前脂肪细胞3T3-L1中ATP含量的影响

图4.化合物S8对(DIO)小鼠摄食的影响 

图5.化合物S8对(DIO)小鼠体重变化的影响

具体实施方式

下面的实施例是本发明说明性优选实施方案，对本发明不构成任何限制。

化合物熔点由SRY-1型熔点仪测定，温度未经校正。¹H-NMR光谱由BrukerARX400或US Varian ^UnityInova600型核磁仪测定，FAB质谱由Zabspect高分辨质谱仪测定。

实施例1：反式-2-氧代-3-亚甲基-5-正辛基-四氢噻吩-4-甲酸(化合物S8)

制备1，2-辛烯-衣康酸的合成：

氮气保护下，将磷酸三乙酯(22.4g，0.1mol，Acros试剂)溶于50ml干燥的四氢呋喃溶液，于0℃下缓慢滴入氢化钠(60％ 5.0g0.125mol北京试剂公司购买)于120ml无水THF的混悬液中，升温至室温，搅拌过夜。将反应液降至0℃，将溴代乙酸乙酯(BrCH₂CO₂Et16.7g，0.1mol北京试剂公司购买)滴入上述反应液，升温至室温，搅拌24小时，将反应液减压浓缩，加适量水使固体溶解，用乙酸乙酯提取三次，有机层用盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，浓缩得桔黄色液体(化合物III)23.7g，产率76.5％。

取4.70g化合物III(15mmol)，于0℃及氮气保护下滴入30ml氢化钠(60％ 0.6g)的无水四氢呋喃溶液，保持0℃反应2小时。将壬醛(C₉H₁₈O，2.13g，15mmol，Acros试剂)溶于10ml无水四氢呋喃，滴入上述反应液，升温至室温搅拌过夜。加水约10ml终止反应，减压蒸去溶剂，加水使固体溶解，用乙酸乙酯提取，有机层用无水硫酸镁干燥，浓缩得淡黄色液体。加入约2.2ml三氟醋酸/水(9∶1)，室温搅拌3小时，减压蒸去三氟醋酸，将所得到的黑色液体加入10％的NaOH溶液25ml及乙醇约20ml，回流过夜，反应液冷却，浓盐酸酸化后，用乙醚提取，醚层用无水硫酸镁干燥、浓缩，闪式柱层析(石油醚∶乙酸乙酯∶冰醋酸/10∶3∶0.07)，得化合物V(反式/顺式＝2/1)为白色固体1.97g，产率57％。

反式化合物V：MS[M]+＝242.3m/e；¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ7.12(t 1H)；3.36(s 2H)1.1-1.6(m 14H)0.88(t 3H)。

顺式化合物V：MS[M]+＝242.3m/e；¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ6.23(t 1H)3.30(s 2H)1.1-1.6(m 14H)0.88(t 3H)。

制备2，反式-2-正辛基-5-O-3-羧酸-四氢噻吩的合成

将化合物V(2.42g，10mmol)与硫代乙酸3ml(Acros试剂，远远过量)共于85-90℃反应过夜，减压蒸去过量的硫代乙酸，在氮气保护下，加入6M的盐酸约20ml回流6-8小时，冷却，用乙酸乙酯提取水层，合并有机层并用饱和食盐水洗至中性，用无水硫酸镁干燥，浓缩后得黑色油状液，加三氟醋酸5ml回流2-4小时，蒸干三氟醋酸，并加氯仿20ml×3次，带去残留的水及溶剂，得黑色油状液，闪式柱层析(洗脱剂 石油醚∶乙酸乙酯∶冰醋酸/10∶2∶0.07)得白色固体化合物VI，703mg，产率48.5％。

MS[M]+＝258.4m/e；¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ4.12(m，1H)；3.10(dt，1H)2.84-3.04(m，2H)1.1-2.1(m，14H)0.86(t，3H)。

反式-2-氧代-3-亚甲基-5-正辛基-四氢噻吩-4-甲酸(S8)的制备

将化合物VI(200mg，0.78mmol)与镁甲基碳酸酯试剂(CH₃OCO₂MgOCH₃，1.8M/DMF，15ml，Adlrich试剂)在氮气流中共同于135-140℃反应72小时，冷却，在二氯甲烷存在下加入10％ aq.的盐酸，分出二氯甲烷层，用饱和食盐水洗涤，低于30℃减压蒸去二氯甲烷，得到的粗品VII在氮气保护下加入5ml Stock溶液(20ml醋酸、15ml 37％的甲醛液、5.2ml N-甲基苯胺、600mg无水醋酸钠)于20℃反应2小时。反应液用乙醚提取，醚层用无水硫酸镁干燥，浓缩得S8粗品203mg，经闪式柱层析(洗脱剂  石油醚∶乙酸乙酯∶冰醋酸/10∶2∶0.07)得白色S8固体110mg，产率52.4％，mp：79-81.5℃。

MS[M]+＝270.4m/e；¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ6.16(d，1H)；5.58(d，1H)4.08(dt，1H)3.70(m，1H)1.1-2.1(m，14H)0.86(t，3H)。

实施例2：反式-2-氧代-3-亚甲基-5-正己基-四氢噻吩-4-甲酸

采用实施例1的制备方法，将其中的壬醛改为正庚醛(Acros试剂)，得反式-2-氧代-3-亚甲基-5-正己基-四氢噻吩-4-甲酸化合物，mp：77-79℃。

MS[M]+＝242.4m/e；¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ6.18(d，1H)；5.61(d，1H)4.08(dt，1H)3.71(m，1H)1.1-2.1(m，10H)0.88(t，3H)。

实施例3：反式-2-氧代-3-亚甲基-5-正壬基-四氢噻吩-4-甲酸

采用实施例1的制备方法，其中的壬醛改为正癸醛(Acros试剂)，得反式-2-氧代-3-亚甲基-5-正壬基-四氢噻吩-4-甲酸化合物：mp：81-82.5℃。

MS[M]+＝284.4m/e；¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ6.17(d，1H)；5.59(d，1H)4.08(dt，1H)3.72(m，1H)1.1-2.1(m，16H)0.88(t，3H)。

实施例4：反式-2-氧代-3-亚甲基-5-正癸基-四氢噻吩-4-甲酸

采用实施例1的制备方法，其中的壬醛改为正十一醛(Acros试剂)，得反式-2-氧代-3-亚甲基-5-正癸基-四氢噻吩-4-甲酸化合物：mp：83-85℃。

MS[M]+＝298.4m/e；¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ6.18(d，1H)；5.61(d，1H)4.08(dt，1H)3.71(m，1H)1.1-2.1(m，18H)0.89(t，3H)。

实施例5：反式-2-氧代-3-亚甲基-5-正十一基-四氢噻吩-4-甲酸

采用实施例1的制备方法，其中的壬醛改为正十二醛(Acros试剂)，得反式-2-氧代-3-亚甲基-5-正十一基-四氢噻吩-4-甲酸化合物：mp：85.5-87℃。

MS[M]+＝312.4m/e；¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ6.18(d，1H)；5.59(d，1H)4.08(dt，1H)3.71(m，1H)1.1-2.1(m，20H)0.86(t，3H)。

实施例6：反式-2-氧代-3-亚甲基-5-正辛基-四氢噻吩-4-甲酸(化合物S8)对脂肪酸合成酶(FAS)的抑制试验

大鼠肝脏中脂肪酸合成酶(FAS)的纯化

SD大鼠(200-250g)禁食两天后喂以无脂高糖饲料，诱导肝脏中FAS高表达，3天后急性处死大鼠，将肝脏置于冰冷的0.1M磷酸钾缓冲液(PB含1mmol/L MgCl2，0.1mmol/L EDTA，10％甘油，pH7.5)中，洗去血液，并剪去多余的结缔组织，加入5倍体积的0.1mol/L PB(含2％兔血清，1mmol/LDTT)以Polytron匀浆5min。加入25％PEG，使之终浓度为5％，搅拌10min，4℃下9000r/min离心30min。收集上清，加入25％PEG使之终浓度为11％，搅拌10min，4℃下9000r/min离心15min。保留沉淀，加入0.1mol/LPB(含2％兔血清，1mmol/LDTT，2mg/ml BSA)二次匀浆。在匀浆液中加入硫酸铵(25g/ml)搅拌30min，4℃下9000r/min离心30min。弃上清，用0.05mol/L PB(1mmol/L DTT，2mg/ml BSA)重悬沉淀，再次匀浆。加入25％PEG使之终浓度为10％，搅拌10min，4℃下9000r/min离心30min，收集上清，重复一次上面的操作，合并两次上清液，加入35％PEG，使之终浓度为15％，搅拌10min，4℃下9000r/min离心30min，收集沉淀，以小体积的双蒸水小心洗沉淀。加入0.05mol/L PB(含2mmol/L DTT)重悬沉淀，4℃下9000r/min离心10min，取上清进行离子交换柱层析(DEAE.FF，Pharmacia)，用含有NaCl(0-1mol/L)的0.05mol/L PB(pH7.5)进行梯度洗脱，收集含有FAS的洗脱峰，经硫酸铵(21.5g/ml)浓缩，离心收集蛋白，以0.1mol/LPB重悬后进行ACA-34(Sigma试剂)凝胶柱层析分离。收集活性组分。以PAGE电泳鉴定FAS的大小为260KD，Lowery法定蛋白含量，并以分光光度法测定FAS的活性，结果证实，获得了具有相当纯度和一定活性的FAS，用于药物的筛选。纯化的FAS于-70℃分装保存。

化合物S8对FAS的抑制作用

化合物S8与23.2μg FAS、乙酰辅酶 A(acetyl-CoA，Sigma 试剂)15μmol/L及还原性辅酶II(NADPH，Roche试剂)72.5μmol/L在0.1mol/L K₂PO4(pH7.6)，37℃下共同孵育30分钟，加入52μmol/L丙酰辅酶A(malonyl-CoA，Sigma试剂)起始反应，UV(340nm)检测NADPH的氧化数，并计算出FAS的活性。根据FAS的活性变化做出化合物S8(0-50μg/mL)量效曲线(图1)，求得化合物S8的IC₅₀为6.0±0.1μg/mL。根据化合物S8 10μg/mL的时效曲线，发现化合物S8对FAS的抑制在0-15min内随着时间的增加而增强，当在15-30min时到达一个平台期(图2)，试验表明化合物S8与FAS的结合附和慢速反应的特点。

实施例7：化合物S8抑制HL60细胞内源性脂肪酸的合成

人前髓细胞白血病细胞株(HL60)在1640培养液无血清条件下培养，细胞密度为5×10⁵个细胞/ml。实验分组：溶剂对照组，化合物S8(2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml)。加入化合物S8后于37℃、5％CO₂孵育2h，加入2μCi[U-¹⁴C]乙酸钠(Sigma)于37℃，5％CO₂继续孵育2h。弃去培养液，加入2∶1的氯仿∶甲醇混合液2ml，匀浆5min，离心(700转/分，15min)收集上清。加入初提液体积的20％的水混匀，离心(2000转/分，10min)，除去上清，并用洗液200μl沿管壁洗下，不干扰下层液，轻轻转动试管使洗液和余下的上层液混匀后移去，重复两次。洗液配制：氯仿、甲醇、水按3∶48∶47的体积比混匀，并使洗液中含0.02％CaCl₂，0.017％MgCl₂和0.29％NaCl。取上述提取的脂质150μl加入6ml二甲苯闪烁液(含0.5％PPO和0.03％POPOP)中，混匀，在液体闪烁计数器中计数。FAS抑制剂S8对HL60细胞内源性脂肪酸合成的影响如表1所示，结果表明化合物S8可以剂量依赖地抑制HL60细胞内源性脂肪酸的合成。

      表1.FAS抑制剂对HL60细胞内源性脂肪酸合成的影响

                    (cpm/5×10⁵cells)

溶剂对照    S8(10μg/ml)    S8(5μg/ml)    S8(2.5μg/ml)

21586±1411    33±5          100±18         150±20

实施例8：化合物S8对前脂肪细胞3T3-L1中ATP含量的影响试验绘制ATP标准曲线

荧光素酶-荧光素(上海中科院植物研究所)溶液的配制，取荧光素酶缓冲液粉剂1支，用蒸馏水50ml溶解即成内含50mM甘氨酰甘氨酸(pH7.6)，10mmol/L MgSO₄，1mmol/LEDTA-Na²的缓冲液。以荧光素酶系缓冲液溶解荧光素酶-荧光素，浓度为3mg/mL。标准曲线的绘制，取新鲜配制的不同浓度的ATP工作液40μl，放入到96孔荧光板中，迅速加入新鲜配制的虫荧光素酶溶液160μl，扫描并记录发光强度。取发光强度为纵坐标，ATP溶液的浓度为横坐标即为标准曲线。

测定化合物S8对前脂肪细胞3T3-L1中ATP含量

在含10％小牛血清的DMEM中培养3T3-L1细胞成单层，然后加入药物处理2h，实验分组：溶剂对照组，S8(10μg/ml，25μg/ml，50μg/ml)。胰酶消化收集细胞，取细胞悬液50μl，加入煮沸得450μl 100mM Tris-HCl，继续煮沸2min，4℃，1000g离心2min，取上清液于试管中待测。取40μl待测ATP样品于96孔荧光板中，迅速加入新配制的虫荧光素酶溶液160μl，扫描并记录发光强度。每个样本测试6次取其平均值作为这一样本的发光值。根据标准曲线计算出各组ATP的含量，结果显示药物S8在浓度为10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml组均可显著增加3T3-L1细胞中ATP的生成，试验结果如图3所示。

实施例9：化合物S8减肥作用实验结果

C57BL/6J雄性小鼠(4-6周龄，购自军事医学科学院实验动物中心)给予营养性饲料3个月，使其造成单纯性营养性肥胖(DIO)模型。营养饲料的配比组成：奶粉5％，猪油20％，蛋黄粉10％，蔗糖10％，花生粉5％，食盐2％，浓缩鱼肝油1mL/Kg，基础饲料48％，自由饮水。实验中给药剂量为10mg/Kg，腹腔注射(ip)，连续给药5天，观察药物对(DIO)小鼠每24h内摄食及体重的影响。结果显示，S8可明显抑制小鼠的进食(图4)，并使小鼠体重持续下降，第6天，小鼠体重下降了17.3％(图5)。