新的导致禽病的细菌和由其衍生的疫苗

摘要

本发明属于动物健康领域，具体地是涉及一种新的细菌性禽病的致病因子，海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌。本发明提供了所述的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌细菌，一种含有灭活的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的疫苗，以及一种为防止鸡感染所述疾病而对鸡进行免疫的方法。

说明书

发明领域

本发明属于动物健康领域，具体涉及一种新的细菌性禽病的致病因子(Causative agent)，海藻巴斯德氏菌(Pasteurella trehalosi)和/或溶血性曼氏菌(Mannheimia haemolytica)。本发明提供了所述的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌细菌，一种含有灭活的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的疫苗，以及一种为防止鸡感染所述疾病而对鸡进行免疫的方法。

发明背景

在过去的十年中，为提高生产能力而采取的集约化禽类养殖方法使得所有主要禽类生产国的发病率升高。因而亟需新的更好的疫苗及接种方案来控制这类疾病。目前，多数动物都被免疫以抗多种病毒及细菌病源性疾病。

禽类病毒病的实例为新城疫(Newcastle)、传染性支气管炎(InfectiousBronchitis)、禽肺病毒(Avian Pneumovirus)、禽痘(Fowlpox)、传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease)等。

细菌性疾病的实例有由下面所导致的鸡鼻炎(Avian Coryza)、副鸡嗜血杆菌(Haemophilus Paragallinarum)(上呼吸道)、鸟博德特氏菌(Bordetellaavium)(上呼吸道)、鼻腔鸟杆菌(ornithobacterium rhinotracheale)(下呼吸道)，沙门氏菌(Salmonella)感染(消化道)，多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)，其是禽霍乱(败血症的(Septicemic))致病因子，败血症以及大肠杆菌感染。

因此，本发明的首要技术问题是鉴定一种新的细菌性禽病，提供所述疾病的致病因子以及提供一种防止所述疾病的疫苗。

发明内容

说明书使用术语的定义：

在本发明的实施方案之前，必须注意的是本文及所附权利要求书中，除上下文清楚注明之外，其中使用的单数形式“一(“a”、“an”)”和“该(“the”)”将复数情况包括在内。因此，例如，“一种海藻巴斯德氏菌”其中包括多个这样的海藻巴斯德氏菌，提到“该细胞″是指一个或多个细胞及其本领域技术人员已知的等价物，等。一个词大写与否没有区别，因此“Arabinose”和“arabinose”具有相同的含义。除非另有说明，本申请中使用的所有技术及科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员的常规理解相同。尽管与本申请所述方法及材料类似或等同的任一方法及材料都可以使用，但是本文描述了优选的方法、设备及材料。本申请中提到的所有出版物在此引入旨在描述及公开这些出版物中报道的与本发明有关的细胞系、载体及方法学。但是，本申请任何内容都不能理解为本申请由于使用了在前发明就使得本发明在时间上不能早于在前发明的公开内容。

令人惊奇的是，本发明人观察到了一种新的细菌性禽病，该病主要发生于蛋鸡，肉鸡中较少发生。已经接种了抗副鸡嗜血杆菌(鸡鼻炎(avian coryza)致病因子)及多杀性巴氏杆菌(禽霍乱致病因子)的小鸡出现了这种疾病。这种新的疾病的症状不同于鼻炎的特异性症状。如果这种新发现的疾病明显表现出下文所述的上呼吸道临床症状，则可以排除副鸡嗜血杆菌为致病因子的可能。

本发明的第一个实施方案涉及导致一种新的家禽上呼吸道及生殖道疾病的革兰氏阴性、兼性厌氧、多形性杆-状细菌，该细菌选自海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌。

本发明所述细菌可分离自感染后的气管、腭裂、卵巢、肝、心、肾及生殖腺(肉鸡)。根据下列测试它们被鉴定为本发明的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌：

β溶血                +

革兰氏染色            -

氧化酶                +

过氧化氢酶            +

脲酶                  -

硝酸盐                +

吲哚                  -

该细菌分离物可以根据Jaworski et al.(1)所述方法纯化并生物分型。该方法还在实施例中举例说明。细菌分类的重要方法有DNA-DNA杂交、REA(限制酶分析，参见，例如，J.Clinical Microbiol，1993，31：831-835)以及核糖体分型。技术人员可以利用所述方法判明细菌是否在本发明范围之内。一种验证柯赫(koch)法则的攻击(challenge)模型也在实施例中例示说明。

因此，本发明的一个重要实施方案是海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌，其中所述的巴斯德氏和/或曼氏(Pasteurella and/or Mannheimia)菌是贝它(β)-溶血-阳性、革兰氏-阴性、氧化酶-阳性、过氧化氢酶-阳性，脲酶-阴性、硝酸盐-阳性及吲哚-阴性。优选地，本发明所述的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌也是麦氏(MacConkey)-阳性。甚至更优选的，本发明所述的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌另外还是葡萄糖-阳性，蔗糖-阳性，甘露醇-阳性，阿拉伯糖-阴性，纤维二糖-阴性，木糖-阳性，水杨苷-阴性，鸟氨酸-阴性，七叶苷-阴性，α-岩藻糖苷酶-阴性，β-半乳糖苷酶-阳性。最优选的是本发明所述的海藻巴斯德氏菌，其中该巴氏杆菌也是阿拉伯糖-阴性和海藻糖-阳性。还优选的是，本发明所述的海藻巴斯德氏菌还为贝它(β)-葡萄糖苷酶-阴性或-阳性，根据生物分型。另外最优选的是本发明所述的溶血性曼氏菌，其中该曼氏菌进一步还是阿拉伯糖-阴性和海藻糖-阴性。还优选的是，本发明所述的溶血性曼氏菌是β-葡糖苷酶阴性。

本发明所述细菌的这些特征赋予了本发明所述细菌相对于其他已知细菌性禽病原体的新颖性(Diseases of Poultry，Tenth Edition，Edited by B.W.Calnek，lowa State University Press，lowa，U.S.A.1997)。

本发明的另一优选实施方案是本发明所述的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌，其中所述禽类选自鸡、火鸡、鸭、鹅、dove，pigeon以及鹌鹑。

本发明提供了一种新型革兰氏阴性、兼性厌氧、多形性杆-状细菌，所述新型细菌具有保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，1081，UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209，USA，具有下列保藏号的细菌的特征：

-海藻巴斯德氏菌ATCC No.PTA-3667(内部命名为BIV-4985)；

-海藻巴斯德氏菌ATCC No.PTA-3668(内部命名为BIV-AVICOR)；

-溶血性曼氏菌ATCC No.PTA-3669(内部命名为BIV-07990)。

保藏日期为2001年8月22日。

因此，本发明的一个最优选实施方案是保藏号为ATCC No.PTA-3667的海藻巴斯德氏菌。这些细菌另外还例示于实施例1的表3中。

本发明的另一最优选实施方案是保藏号为ATCC No.PTA-3668的海藻巴斯德氏菌。这些细菌另外还例示于实施例1的表2中。

本发明的另一最优选实施方案是保藏号为ATCC No.PTA-3669的溶血性曼氏菌，这些细菌另外还例示于实施例1的表1中。

实施例中A部分和B部分的测试结果(表1，2和3)确证了细菌BIV-4895；ATCC No.PTA-3667和BIV-AVICOR；ATCC No.PTA-3668属于巴斯德氏菌家族(海藻巴斯德氏菌，它们都是海藻糖阳性和阿拉伯糖阴性)，而细菌BIV-07990；ATCC No.PTA-3669属于曼氏菌科(溶血性曼氏菌，它们是海藻糖阴性和阿拉伯糖阴性)。

本发明还涉及含有上述本发明细菌的微生物培养物。该培养物可以通过在35-37℃下培养所述细菌制得。该细菌可在正常大气氧压下生长。该细菌也可生长于本领域技术人员已知的多种不同的常用促进细菌生长的培养基，例如，胰蛋白胨肉汤(TB)、大豆Trypticasein肉汤或脑心灌注液肉汤或任一营养丰富培养基。还可37℃下绵羊血琼脂上孵育24小时培养该细菌。

各种物理及化学的细菌灭活方法已为本领域所知。物理灭活的实例为UV-照射、X-射线照射、γ-射线照射以及加热。灭活用化学药品的实例为β-丙内酯、戊二醛、β-乙烯亚胺及甲醛。

优选地本发明的细菌用甲醛灭活。令人惊奇的是，使用终浓度为0.2％的甲醛仍然是一种灭活本发明所述细菌的极好方法。

因此，另一方面，本发明涉及一种灭活本发明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的方法，其中包括使用终浓度0.2％的甲醛。

用上述方法以及本领域技术人员已知的其他灭活细菌方法灭活的本发明所述细菌具体体现在本发明中。因此，另一重要方面是用本发明方法或本领域已知方法可得到灭活的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌。优选地，本发明所述的灭活的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌选自海藻巴斯德氏菌ATCC No.PTA-3667，海藻巴斯德氏菌ATCC No.PTA-3668和/或溶血性曼氏菌ATCC No.PTA-3669。

因此，另一重要方面是用本领域已知方法可获得的活的减毒海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌。优选地，本发明所述的活的减毒海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌选自海藻巴斯德氏菌ATCC No.PTA-3667，海藻巴斯德氏菌ATCC No.PTA-3668和/或溶血性曼氏菌ATCC No.PTA-3669。本发明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的减毒采用在合适培养基上多次传代或本领域已知的任一其他方法。

本申请中，灭活意指本发明的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌被杀死而不能复制引发临床疾病。

本申请中，减毒意指本发明的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌是活菌能够复制但不能导致临床疾病。

另一重要方面是用本领域已知方法可获得海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的组分或片段。所述片段可以通过用去污剂溶解本发明海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌或者其他任一本领域已知方法制得。

优选地，所述组分或片段是本发明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的纯化抗原。优选地，所述组分/片段是本发明海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的外膜蛋白。

本发明所述的“片段”是本发明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的任一免疫原性亚单位，即任一多肽子集。

因此，本发明涉及含本发明海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌至少一种抗原的片段。最优选地，所述片段含有细菌的至少一种抗原，该细菌选自海藻巴斯德氏菌ATCC No.PTA-3667、海藻巴斯德氏菌ATCC No.PTA-3668和/或溶血性曼氏菌ATCC No.PTA-3669。所述片段可包括所述菌株的整个细菌细胞、细菌提取物、外膜蛋白组分、细菌外-和/或内毒素以及纯化蛋白。其抗原性多肽或片段可例如获自纯化的细菌蛋白或者通过在一些原核或真核表达系统中表达相应遗传物质获得或者通过有机-化学(organo-chemical)合成获得。所述方法已为本领域技术人员已知。

本发明进一步涉及本发明所述活的、和/活的减毒、和/或灭活的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌和/或所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌组分在疫苗中的用途。

本发明进一步提供了一种源自上述新鉴定细菌的疫苗。因此，本发明进一步还涉及一种疫苗组合物，其中含有本发明所述活的、和/或活的减毒、和/或灭活的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌和/或所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌组分。

本申请中的“疫苗“是指兽用疫苗，其中含有抗原物质，施用可诱导抗所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌导致疾病的特异性主动或被动免疫。本发明所述的活的或活的减毒海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌赋予主动免疫，可通过抗其所含免疫原的母源抗体被动转移，并且有时还能抗抗原性相关生物体。本发明所述的灭活的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌和/或所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的组分赋予被动免疫。能够增强免疫应答的其他成分为通常称为佐剂的组分，例如，氢氧化铝、矿物油或其他油或者添加到疫苗的辅助分子或被所述附加成分相应诱导后机体产生的辅助分子，例如但不限于干扰素、白介素或生长因子。

在一个优选实施方案中，所述疫苗包含灭活细菌。优选地，本发明的疫苗是指上述疫苗，其中一种免疫活性成分是活的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌。术语“活疫苗”是指一种含有能分化/增殖的颗粒的疫苗。

还优选地，本发明的疫苗包含减毒后的本发明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌以及一种药物学可接受的载体或赋形剂。所述疫苗还可以联合疫苗的方式施用，其中包含两株或多株活的、和/或活的且减毒后的和/或灭活的本发明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌和/或两株或多株所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的组分。最优选地，疫苗中的活的、和/或活的且减毒后的和/或灭活的本发明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌和/或所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的组分选自海藻巴斯德氏菌ATCC No.PTA-3667，海藻巴斯德氏菌ATCC No.PTA-3668和/或溶血性曼氏菌ATCC No.PTA-3669。

还优选地，本发明的疫苗包含灭活的本发明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌以及药物学上可接受的载体或赋形剂。所述疫苗也可以联合疫苗的形式使用，其中含有两株或多株所述灭活的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌。

另外，也可用全细胞的组分作为本发明疫苗中的相关免疫原。因此，优选地，本发明的疫苗包含本发明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的组分以及一种药物学上可接受的载体或赋形剂。所述疫苗也可以联合疫苗的形式使用，其中含有两株或多株所述灭活的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌。具体而言，本发明涉及含有片段的疫苗，该片段包含本发明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的至少一种抗原。最优选地，本发明涉及一种含有片段的疫苗，该片段包含选自菌株的至少一种抗原，该菌株选自海藻巴斯德氏菌ATCC No.PTA-3667，海藻巴斯德氏菌ATCC No.PTA-3668和/或溶血性曼氏菌ATCC No.PTA-3669。所述片段可以包括全菌体细胞、细菌提取物，外膜成分、菌体外-和/或内毒素，以及纯化蛋白。其抗原多肽或片段可例如获自纯化的细菌蛋白或者通过在一些原核或真核表达系统中表达相应遗传物质获得或者通过有机-化学(organo-chemical)合成获得。所述方法已为本领域技术人员已知。

优选地，本发明的疫苗还包括一种佐剂。因此，本发明进一步涉及一种本发明所述疫苗组合物，该组合物中进一步包括一种或多种合适的佐剂和/或赋形剂和/或载体。

本申请中使用的佐剂包括能激发被注射动物免疫应答的物质。大量不同佐剂已为本领域已知。本申请中使用的佐剂包括氟氏完全(Freund’s Complete)佐剂及氟氏不完全佐剂、维生素E、非-离子嵌段共聚物、胞壁酰二肽、Quil A、矿物及非矿物油、植物油以及Carbopol(一种同聚物)。在一个优选实施方案中，本发明细菌的疫苗包含一种油包水乳剂佐剂。所述疫苗也可称为一种含灭活的(杀死的)本发明所述细菌以及一种油包水乳剂佐剂的菌苗。本发明中还详细公开了其他辅佐菌体的方法。

还优选地，本发明的疫苗可包含一种或多种合适乳化剂，例如Span或Tween。

另外还优选地，疫苗中的所述活的、和/或活的且减毒后的和/或灭活的本发明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌和/或所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的组分选自海藻巴斯德氏菌ATCC No.PTA-3667，海藻巴斯德氏菌ATCC No.PTA-3668和/或溶血性曼氏菌ATCC No.PTA-3669。

优选地，本发明的疫苗含有至少一种细菌抗原，该细菌选自海藻巴斯德氏菌ATCC No.PTA-3667，海藻巴斯德氏菌ATCC No.PTA-3668和/或溶血性曼氏菌ATCC No.PTA-3669。所述疫苗可包括所述菌株的全菌体细胞、细菌提取物、外膜蛋白组分、细菌外-和/或内毒素以及纯化蛋白。其抗原性多肽或片段可例如获自纯化的细菌蛋白或者通过在一些原核或真核表达系统中表达相应遗传物质获得或者通过有机-化学(organo-chemical)合成获得。所述方法已为本领域技术人员已知。

最优选地，本发明进一步涉及一种疫苗组合物，其中进一步含有至少一种其他的源自对禽类致病的病毒或微生物的抗原。优选地，所述抗原为活的、减毒的或灭活的病毒或微生物或其片段。所述片段可以包括全菌体细胞或病毒颗粒、细菌提取物、病毒抗原、病毒亚单位、外膜成分、细菌外-和/或内毒素以及纯化蛋白。其抗原性多肽或片段可例如获自纯化的细菌蛋白或者通过在一些原核或真核表达系统中表达相应遗传物质获得或者通过有机-化学(organo-chemical)合成获得。所述方法已为本领域技术人员已知。

最优选地，本发明进一步涉及一种疫苗组合物，其中含有至少一种其他的源自对禽类致病的病毒或微生物的抗原，其中所述的病毒或微生物选自，但不限于，传染性支气管炎病毒，新城疫病毒、传染性法氏囊病(Bursal)病毒(疾病：Gumboro)，鸡传染性贫血因子(Chicken Anaemia agent)、禽呼肠孤病毒(Avian Reovirus)、鸡败血枝原体(Mycoplasma gallisepticum)、禽肺病毒、副鸡嗜血杆菌(疾病：鼻炎)、鸡痘病毒(chicken poxvirus)、禽脑脊髓炎病毒(AvianEncephalomyelitis)、多杀性巴斯德氏杆菌以及大肠杆菌。

“药物组合物”基本上由一种或多种成分组成，该成分能修饰所给药机体的生物体或者存活于机体之内或之上生物体的生理功能，例如免疫原性。该术语包括，但不限于抗生素或抗寄生剂、以及其他用于实现其他特定目的的其他组分，例如但不限于，加工特性(processing traits)，灭菌，稳定，使得组合物可通过肠道或非胃肠道途径施用如经口、鼻内、静脉内、肌内、皮下、经皮或其他合适途径，施用后耐受、控制释放特性。因此，本发明另一重要方面，本发明涉及一种药物组合物，其中含有活的、和/或活的减毒的、和/或灭活的本发明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌和/或所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的组分。

本发明涉及一种对感染了海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌(例如，上述活细菌)的属于禽类的动物进行治疗的方法，其中将上述本发明的活的、减毒的、灭活的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌以及/或者其组分和/或片段，按本领域技术人员已知的合适剂量施用给需要其的禽类，然后监测由所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌感染所引发症状的减轻情况。所述治疗优选可重复进行。

另一个重要的实施方案是一种免疫禽类抗海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌(例如，上述活细菌)引发的呼吸及生殖道疾病的方法，该方法包括施用免疫学有效量本发明所述疫苗，然后监测由所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌感染所引发症状的减轻情况。

另一个重要实施方案是灭活的本发明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌和/或存活的本发明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌和/或存活但减毒的本发明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌和/或者本发明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的片段或组分在制备用于预防海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌感染疫苗中的用途。

本发明还涉及一种诊断所致疾病的方法，该方法包括：从禽类获取样本，其中所述样本选自全血、血清、血浆、组织刮取物、洗涤物、拭子、组织，然后分析样本中本发明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的存在情况。

在一个优选实施方案中，海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的存在通过免疫试验测定。免疫试验使用海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌特异性单克隆抗体或多克隆抗血清。单克隆抗体的制备已为本领域已知(3，4)。免疫试验包括本领域已知的检测方法，例如ELISA试验(酶联免疫吸附测定)或所谓的夹心-ELISA试验、斑点印迹、免疫印迹、放射免疫试验(放射免疫测定RIA)，二维双向扩散试验(diffusion-based Ouchterlony)或火箭免疫荧光测定)，或者凝集试验(快速平板或微量滴定板凝集试验)。另一种免疫试验是所谓的Western印迹(又称Western转移法或Western转印)。Western印迹的目的是将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后的蛋白或多肽转移至硝酸纤维素滤膜或其他合适载体上，与此同时保持各蛋白或多肽电泳后得到的相对位置。然后，用试验中能特异性结合所述蛋白或抗体的抗体孵育上述Western印迹。这些检测方法可被本领域普通技术人员用来实施本申请所述的发明。本领域技术人员能够从下列参考文献中找到上述方法及其他检测方法：An Introduction toRadioimmunoassay and Related Techniques，Elsevier Science Publishers，Amsterdam，The Netherlands(1986)；Bullock et al.，Techniques inImmunocytochemistry，Academic Press，Orlando，FL Vol.1(1982)，Vol.2(1983)，Vol.3(1985)；Tijssen，Practice and Theory of Enzyme Immunoassays：LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology，Elsevier Science Publishers，Amsterdam，The Netherlands(1985)。

在另一最具体实施方案中，用海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌特异性抗体孵育上述样本，然后测定生成的抗原/抗体复合物。

在本发明所述方法的一具体优选实施方案中，上述样本中海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的存在情况用分子生物学方法测定。本申请中使用的分子生物学方法是指检测方法，包括，例如，聚合酶链反应(PCR)、逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)或者可以是Northem或Southem印迹，本领域技术人员可在常见参考书中找到这些方法(例如Sambrook et al.(1989)MolecularCloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York and Bertram，S.and Gassen，H.G.GentechnischeMethoden，G.Fischer Verlag，Stuttgart，New York，1991)。

本发明还包括诊断试剂盒，其特征为其中含有检测海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌所需的全部组件。

诊断试剂盒是实施本发明诊断方法所用全部成分的集合。实施本发明方法所用其他元件的一些实例(并非穷举)包括：容器例如96-孔平板或微量滴定板、试管、其他合适容器，平面及支持物，膜例如硝酸纤维素滤膜，洗涤试剂及缓冲液。诊断试剂盒还可包括检测结合抗体的试剂，例如标记后的二抗、生色团、酶(例如，与抗体偶联)及其底物或其他能够结合抗体的底物。

本发明进一步还涉及一种诊断试剂盒，其特征为其中含有实施PCR或RT-PCR检测海藻巴斯德氏菌-和/或溶血性曼氏菌-特异性DNA或RNA所需的全部组件。所述试剂盒可包括，但不限于除试管或96-孔平板或微量滴定板外的其他容器，平面及支持物，膜例如硝酸纤维素滤膜，洗涤试剂及反应缓冲液(其可以改变pH值及镁离子浓度)，无菌水，矿物油，BSA(牛血清白蛋白)，MgCl₂，(NH₄)₂SO₄，DMSO(二甲亚砜)，巯基乙醇，核苷酸(dNTPs)，酶例如Taq-聚合酶和逆转录酶，作为DNA基质的，海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌特异性DNA或cDNA，海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌DNA或RNA的特异性寡核苷酸，对照模板，DEPC-水，DNA酶，RNA酶，以及其他本领域技术人员已知化合物。本发明所述的寡核苷酸是长度约15-约100各核苷酸的短核酸分子，其在严谨条件下能与互补于海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌蛋白的核酸序列结合。至于严谨条件，本领域技术人员是指同源性大于85％，优选大于90％选择的条件(参见，Sambrook etal.(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2″d ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York and Bertram，S.and Gassen，H.G.Gentechnische Methoden，G.Fischer Verlag，Stuttgart，New York，1991)。

附图说明

A)自发作部位(field)

图1)肉鸡(Broilers)：鼻腔分泌物及眼周围水肿

图2)肉鸡：心脏及冠状脂肪出血。

图3)肉鸡：结膜炎及眼部周围炎症。

图4)蛋鸡(Layers)：鼻腔分泌物以及鸡冠青紫下垂(displaced comb withcyanosis)。

图5)蛋鸡：眼睛周围炎症并出血。

图6)蛋鸡：耳道入口后皮肤组织出血。

图7)蛋鸡：肾脏炎症

图8)蛋鸡：输卵管出血。

图9)蛋鸡：卵巢卵泡畸形。

图10)蛋鸡：前胃(proventriculus)和腺胃(gizzard)之间结合处出血。

图11)蛋鸡：输卵管充血和出血。

B)实验性感染

图12)蛋鸡：肾脏炎症并出血。

图13)SPF：衰竭(俯卧)。

图14)蛋鸡：关节及肌肉出血。

图15)蛋鸡：鼻腔分泌物及苍白肉冠。

图16)蛋鸡：肌肉出血。

图17)SPF：心脏及冠状动脉脂肪(coronary fat)出血。

图18)蛋鸡：左侧为健康鸡，右侧为羽毛凌乱的病鸡。

图19)蛋鸡：绿色痢疾。

图20)SPF：肌肉出血。

图21)SPF：衰竭(运动障碍)及绿色痢疾。

图22)蛋鸡：肝肿大出血。

下列实施例是为了进一步阐释本发明，绝不应理解为是对本发明范围的限制。

实施例1

与海藻巴斯德氏菌及溶血性曼氏菌相关的野外疾病暴发

临床症状

观察发作部位

蛋鸡肉鸡轻微的上呼吸道/生殖道严重的上呼吸道/生殖道日龄：22周龄日龄：7周龄鼻腔分泌物喷嚏并伴有罗音眼睛周围区域肿胀头部肿胀食物消耗量低食物消耗量低白色痢疾精神萎靡产蛋量降低生长发育参差不齐死亡率低羽毛凌乱鸡冠下垂衰竭(prostration)鸡冠青紫死亡率8％肉眼观察到的病变卵巢萎缩伴有出血和退行性变化生殖腺出血卵泡畸形气管上部出血肝脏增大肝脏增大伴有出血肾炎肺泡炎腹部脂肪出血脾大伴有出血胸腔出血肌肉出血

输卵管出血心脏出血及心包积液冠状动脉脂肪出血胸腔出血

三株新型革兰氏阴性、兼性厌氧、多形性杆-状细菌，保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，1081，University Boulevard，Manassas，VA20110-2209，USA，保藏号：BIV-4985海藻巴斯德氏菌为ATCC No.PTA-3667；BIV-AVICOR海藻巴斯德氏菌为ATCC No.PTA-3668以及BIV-07990溶血性曼氏菌为ATCC No.PTA-3669。保藏日为2001年8月22日。

按照常规测定方法对这些细菌分型，使用Bergey′s Manual ofSystematic Bacteriology Volume I(1984.Williams and Wilkins，428 East PrestonStreet.Baltimore，USA.)

表1

溶血性曼氏菌：BIV-07990(生物1型)；ATCC No.PTA-3669

肉眼观察的形态

在绵羊血琼脂上培养24小时后长成的菌落，直径1.0-1.5mm，光亮半透明，微凸起、光滑、奶油状，β-溶血。

显微镜下观察到的形态

革兰氏-阴性，不运动，多形性杆状，常呈现两极染色。

生化及其他试验

A部分

    试验    反应    氧化酶    +    过氧化氢酶    +    吲哚    -    葡萄糖    +    蔗糖    +    MacConkey    +

    脲酶  -    硝酸盐  +

部分B

 麦芽糖  + 甘露醇  + 阿拉伯糖  - 纤维二糖(celobiose)  - 山梨醇  + 木糖(xilose)  + 海藻糖  - 水杨苷  - 鸟氨酸  - 七叶灵(Esculine)  - β葡萄糖苷酶  - α-岩藻糖苷酶  - β半乳糖苷酶  +

表2海藻巴斯德氏菌BIV-AVICOR(生物2型)；ATCC No.PTA-3668

肉眼观察的形态

在绵羊血琼脂上培养24小时后长成的菌落，直径1.0-1.5mm，光亮半透明，微凸起、表面光滑、奶油状，β-溶血。

显微镜下观察到的形态

革兰氏-阴性，不运动，多形性杆状，常呈现两极染色。

生化及其他试验

A部分

  试验  反应  氧化酶  +  过氧化氢酶  +  吲哚  -  葡萄糖  +

  蔗糖  +  MacConkey  +  脲酶  -  硝酸盐  +

部分B

  麦芽糖    +  甘露醇    +  阿拉伯糖    -  纤维二糖    -  山梨醇    +  木糖    +  海藻糖    +  水杨苷    -  鸟氨酸    -  七叶苷(Esculin)    -  β葡萄糖苷酶    +^α  α-岩藻糖苷酶    -  β半乳糖苷酶    +

^α80％是阳性

表3海藻巴斯德氏菌：BIV-4895(生物4型)；ATCC No.PTA-3667

肉眼观察的形态

在绵羊血琼脂上培养24小时后长成的菌落，直径1.0-1.5mm，光亮半透明，微凸起、干燥微粒状，β-溶血。

显微镜下观察到的形态

革兰氏-阴性，不运动，多形性杆状，常呈现两极染色。

生化及其他试验

A部分

  试验    反应  氧化酶    +  过氧化氢酶    +  吲哚    -  葡萄糖    +  蔗糖    +  MacConkey    +  脲酶    -  硝酸盐    +

部分B

  麦芽糖  -  甘露醇  +  阿拉伯糖  -  纤维二糖  -  山梨醇  +  木糖  +  海藻糖  +  水杨苷  -  鸟氨酸  -  七叶苷  -  β葡萄糖苷酶  -  α-岩藻糖苷酶  -  β半乳糖苷酶  +

A和B部分试验结果(表1，2和3)证实了细菌BIV-4895；ATCC No.PTA-3667和BIV-AVICOR；ATCC No.PTA-3668属于巴斯德氏菌家族(family)(海藻巴斯德氏菌，海藻糖阳性及阿拉伯糖阴性)，而细菌BIV-07990；ATCC No.PTA-3669属于曼氏菌科(溶血性曼氏菌，海藻糖阴性和阿拉伯糖阴性)。

致病因子的鉴定

细菌分离自感染后的气管、腭裂、卵巢、肝、心、肾及生殖腺(肉鸡)。根据下列试验它们被鉴定为海藻巴斯德氏菌和溶血性曼氏菌：

β溶血              +

革兰氏染色          -

氧化酶              +

过氧化氢酶          +

Mac Conkey          +

脲酶                -

硝酸盐              +

吲哚                -

没有分离病毒或任一其他细菌。

生物分型：纯化细菌分离株，并按照Jaworski et al.(1)所述方法进行生物分型。鉴定出三种不同生物型(4，2，1)。

简而言之，从纯化后的分离物中，将单个菌落接种入装有3ml胰蛋白胨肉汤的试管，37℃孵育8小时。然后从试管取一接种环接种物(20μl)转移入含3ml 1％蔗糖的另一试管，37℃孵育7天然后记录结果。

攻击模型(challege mode)：细菌纯化后，将分离物培养于胰蛋白胨培养基获得大量纯化病原体。为了验证柯赫(koch)法则，用每一生物型(0.2ml/鸡；3×10⁸CFU/ml)通过静脉内途径感染三个不同组(每组20只鸡)的13周龄无特定病原体(SPF)鸡。每天观察鸡的发病率和死亡率，共三天。在第三天时，所有鸡全部宰杀，记录尸检病变，收集器官(肝和生殖腺)样本用于重分离。另外还记录死鸡的尸检病变。

结果

临床症状：俯卧(prostration)，跛行，鸡冠下垂，羽毛凌乱，冠顶青紫(cyanosis)。

病变：

病变    BIV-4895(生物4型)    BIV-Avicor(生物2型)    BIV-07990(生物1型)心脏水肿    73％    37％    90％心脏出血    90％    -    70％冠状动脉脂肪出血    90％    37％    50％心包炎    73％    46％    30％胸腔出血    -    19％    40％卵巢出血    64％    9％    20％肾炎    64％    46％    60％肾出血    55％    46％    20％肝脏增大伴有出血    -    73％    -肺泡炎    64％    -    -肌肉出血    -    37％    -死亡率    46％    19％    -

实施例II

本发明细菌的培养、疫苗制备及SPF鸡的接种。

将菌株培养于胰蛋白胨肉汤(TB)。依菌株而定接种后约6-8小时的对数生长期时收获。用滴定用的绵羊血琼脂进行平板计数。用收获产物的1∶10稀释液测定每毫升的菌落形成单位(CFU/ml)。通过加入甲醛至终浓度为0.2％杀死细胞。无菌检验该悬浮液后，将最小滴定量的10⁸CFU/ml加入到疫苗终产物中。

通过把两菌株(BIV-4895，ATCC No.PTA-3667和BIV-AVICOR，ATCC No.PTA-3668)和油佐剂(用矿物油按60％油/40％水的比例的油包水乳液)混合至最小浓度10^7.0CFU/菌株/ml，制备疫苗。

无特定病原体(SPF)鸡在2、5和9周龄时，以在颈部下半部皮下注射0.5ml疫苗的方式接种。

实施例III

攻击菌株的制备以及接种和对照组的攻击。

将菌株BIV-4895、ATCC No.PTA-3667和BIV-AVICOR，ATCC No.PTA-3668在绵羊血琼脂上37℃培养24小时。用胰蛋白胨肉汤(TB)收获细胞直至获得用波长540nm分光光度计测得的光密度为2.0的悬液。为了实施攻击，制备最终攻击-体积中含有下列数目细胞的制剂：

3×10⁹CFU/ml BIV-AVICOR；ATCC No.PTA-3668

1.45×10¹⁰CFU/ml BIV-4895；ATCC No.PTA-3667

在13周龄时，20只接种后的和20只未-接种的鸡通过静脉途径0.2ml接种物(至少10⁸CFU/鸡)攻击。观察三天内鸡的发病率和死亡率。观察3天后，将剩下的鸡全部宰杀，从每只鸡的肝和生殖腺中重-分离细菌。将死鸡的尸检病变也记录了下来。

结果

鸡的分组      攻击接种                死亡率+重分离    保护％

阴性对照      N/A                     0                N/A

阳性对照      ATCC No.PTA-3667        77               23

阳性对照      ATCC No.PTA-3668        54               46

接种          ATCC No.PTA-3667        0                100

接种          ATCC No.PTA-3668        5                95

实施例IV

本发明细菌的培养、疫苗制备及SPF鸡的接种。

将菌株培养于胰蛋白胨肉汤(TB)。依菌株而定接种后约6-8小时的对数生长期时收获。用滴定用的绵羊血琼脂进行平板计数。用收获产物的1∶10稀释液测定每毫升的菌落形成单位(CFU/ml)。通过加入甲醛至终浓度为0.2％杀死细胞。无菌检验该悬浮液后，将最小滴定量的10⁸CFU/ml加入到疫苗终产物中。

通过把三个菌株(BIV-4895，ATCC No.PTA-3667和BIV-AVICOR，ATCCNo.PTA-3668和BIV-07990，ATCC No.PTA-3669)和油佐剂(用矿物油按60％油40％水的比例的油包水乳液)混合至最小浓度10^7.0CFU/菌株/ml，制备疫苗。

无特定病原体(SPF)鸡在2、5和9周龄时，以在颈部下半部皮下注射0.5ml疫苗的方式接种。

实施例V

攻击菌株的制备以及接种和对照组的攻击。

将菌株BIV-4895、ATCC No.PTA-3667，BIV-AVICOR、ATCC No.PTA-3668和BIV-07990，ATCC No.PTA-3669在绵羊血琼脂上37℃培养24小时。用胰蛋白胨肉汤(TB)收获细胞直至获得用波长540nm分光光度计测得的光密度为2.0的悬液。为了实施攻击，制备最终攻击-体积中含有下列数目细胞的制剂：

8.3×10⁹CFU/ml BIV-AVICOR；ATCC No.PTA-3668

2.2×10⁹CFU/ml BIV-4895；ATCC No.PTA-3667

1.0×10¹⁰CFU/ml BIV-07990；ATCC No.PTA-3669

在13周龄时，20只接种后的和20只未-接种的鸡通过静脉途径0.2ml接种物(至少10^8.0CFU/鸡)攻击。观察三天内鸡的发病率和死亡率。观察3天后，将剩下的鸡全部宰杀，从每只鸡的肝和生殖腺中重-分离细菌。将死鸡的尸检病变也记录了下来。

结果

鸡的分组          攻击接种            死亡率+重分离    保护％

接种阴性对照      N/A                 0                N/A

未接种阴性对照    N/A                 0                N/A

接种              ATCC No.PTA-3669    27.3             72.7

接种              ATCC No.PTA-3668    20.9             79.1

接种              ATCC No.PTA-3667    16.7             83.7

阳性对照          ATCC No.PTA-3669    53.3             46.7

阳性对照          ATCC No.PTA-3668    53.3             46.7

阳性对照          ATCC No.PTA-3667    64.3             35.7

血清学试验

按照Biberstein et.al.(2)中的方法，用兔子制备代表各生物型的分离株的高免血清。

分离株用血琼脂培养基过夜培养，然后收获于含0.3％的福尔马林的盐水中。细胞洗涤一次，调节至575nm处透光度为10％用于注射。按照下列方案静脉内(IV)注射：

0.5ml、1.0、2.0、3.0、3.0、3.0，时间间隔为4天，最后一次注射后4天对所有兔子放血。

用3个生物型毒株测试高免血清的特异性，并通过快速平板凝集与同源及异源抗血清(2倍稀释)反应。

对每一生物型的抗血清进行稀释直至能测得阳性结果的最大稀释程度为止。

                                          稀释(log²)

                                          抗原生物型1

  抗血清  1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  1  +  +  +  +  +  +  +  +  +  +  +  2  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  3  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -

                                          稀释(log²)

                                          抗原生物型4

  抗血清  1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  1  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  2  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  3  +  +  +  +  +  +  +  +  +  +  +

                                          稀释(log²)

                                          抗原生物型2

  抗血清  1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  1  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  2  +  +  +  +  +  +  +  +  +  +  +

  3-----------

然后用生物型特异性高免血清作为微量-滴定板血清凝集试验的阳性对照。

实施例VI

攻击菌株的制备以及接种和对照组的攻击。

将菌株BIV-4895、ATCC No.PTA-3667，BIV-AVICOR、ATCC No.PTA-3668和BIV-07990，ATCC No.PTA-3669在绵羊血琼脂上37℃培养24小时。用胰蛋白胨肉汤(TB)收获细胞直至获得用波长540nm分光光度计测得的光密度为2.0的悬液。为了实施攻击，制备最终攻击-体积中含有下列数目细胞的制剂：

1.5×10¹⁰CFU/ml BIV-AVICOR；ATCC No.PTA-3668

1.7×10¹⁰CFU/ml BIV-4895；ATCC No.PTA-3667

1.6×10¹⁰CFU/ml BIV-07990；ATCC No.PTA-3669

在13周龄时，20只接种后的和20只未-接种的鸡通过静脉途径0.2ml接种物(至少10^8.0CFU/鸡)攻击。观察三天内鸡的发病率和死亡率。观察3天后，将剩下的鸡全部宰杀，记录死后损伤并从每只鸡的肝、心和生殖腺中重-分离细菌。

结果

表1.根据死亡率和重-分离情况评估疫苗的效用

鸡的分组          攻击接种         死亡率+        保护％

重分离

未接种阴性对照    N/A              N/A            N/A

阳性对照          BIV-4895         70             30

阳性对照          BIV-AVICOR       80             20

阳性对照          BIV-07990        88.8           11.2

接种              BIV-4895         10             90

接种              BIV-AVICOR       10             90

接种              BIV-07990        15             85

表2.根据攻击后肉眼观察病变评估疫苗的效用

鸡的分组                攻击接种物         病变％       保护％

未接种的阴性对照        N/A                N/A          N/A

阳性对照                BIV-4895           74.4         25.6

阳性对照                BIV-AYICOR         27.0         73.0

阳性对照                BIV-07990          7.0          93.0

接种                    BIV-4895           4.0          96.0

接种                    BIV-AYICOR         1.1          99.0

接种                    BIV-07990          2.4          98.0

参考文献

1)Jaworski M.D.，D.L.Hunter，A.C.S.Ward.Biovariants of isolates of Pasteurellafrom domestic and wild ruminants.J.Vet.Invest.1988，10：49-55.

2)Biberstein EL.，Meyer M.E.，and Kenedy P.C.Colonial variation of Pasteurellahaemolytica isolated from sheep.J.Bact.1958，76：445-452.

3)Kearney，J.F.，Radbruch A.，Liesegang B.，Rajewski K.A new mouse myelomacell line that has lost imunoglobulin expression but permits construction ofantibody-secreting hybrid cell lines.J.Immunol.1979，123：1548-1550.

4)K_hler，G.，Milstein，C.Continous culture of fused cells secreting antibody ofpredefined specifity.Nature 1975，265：495-497.

PCT原始文件(用于提交)---2002年10月23日09:05:55印制1-1265-PCT

 0-10-1-1    PCT/RO/134表(PCT.EASY格式)对保藏的微生物或其它生物材料的说明(PCT细则13之二)备用    PCT-EASY版本2.92(2002年1月10日更新) 0-2    国际申请号    PCT-EP02/11899 0-3    申请人或代理人档案号    1-1265-PCT  11-11-2    以下说明是针对在说明书被提及材料保藏的微生物或其它生物材料：页数行数154  1-31-3-11-3-21-3-31-3-4    保藏证明保藏机构保藏机构的地址保藏日期保藏编号美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)10801，University Blvd.，Manassas，Virginia 20110-2209美国2001年8月22日(22.08.2001)ATCC PTA-3667  1-4    补充说明    BIV-4895 Avian Pasteurella trehalosi  1-5    本说明所针对的指定国    所有指定国  1-6    分别提供的说明本说明将于后些时候提交到国际局    没有 22-12-2  以下说明是针对在说明书被提及保藏的微生物或其它生物材料：页数行数143 2-32-3-1  保藏证明保藏机构美国典型培养物保藏中心

2-3-22-3-32-3-4保藏机构的地址保藏日期保藏编号    (American Type Culture Collection)10801，University Blvd.，Manassas，Virginia 20110-2209美国2001年8月22日(22.08.2001)ATCC PTA-3668 2-4    补充说明    BIV-AVICOR Avian Pasteurellatrehalosi 2-5    本说明所针对的指定国    所有指定国 2-6    分别提供的说明本说明将于后些时候提交到国际局    没有 3    以下说明是针对在说明书被提及保藏的微生物或其它生物材料： 3-1    页数    13 3-2    行数    11 3-3    保藏证明 3-3-1    保藏机构    美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection) 3-3-2    保藏机构的地址    10801，University Blvd.，Manassas，Virginia 20110-2209美国 3-3-3    保藏日期    2001年8月22日(22.08.2001) 3-3-4    保藏编号    ATCC PTA-3669 3-4    补充说明    BIV-07990 Avian Mannheimiahaemolytica 3-5    本说明所针对的指定国    所有指定国 3-6    分别提供的说明本说明将于后些时候提交到国际局    没有

                                          由受理局填写

0-4本表格已经和国际申请一起收到(是或否)    是0-4-1受理官员    Y.Marinus-v.d.Nouweland

                           由国际局填写

0-5    国际局收到本表格日期0-5-1    受理官员

                     美国典型培养物保藏中心

                     10801 University Blvd.

                     Manassas，VA 20110-2209

                       电话：703-365-2700

                       传真：703-365-2745

                           此为传真件

日期：2001年9月12日

收件人：Abelardo Aquilar

收件人传真号码：52 3 668 80 80

发件人：ATCC专利保藏处                     传真页数：1(包括此首页)

题由：专利保藏

Avian Pasteurella trehalosi：BIV-4895被给予ATCC保藏号：PTA-3667；

Avian Pasteurella trehalosi：BIV-AVICOR被给予ATCC保藏号：PTA-3668；

Avian Mannheimia haemolytica：BIV-07990被给予ATCC保藏号：PTA-3669。

保藏日期：2001年8月22日。纸件将于几天后转达给您。关于收费的收据将分别寄出：

标准保藏/通知                               $3450.00

存活实验                                    480.00

PTA-3667至PTA-3669的总价款                  $3930.00

Marie Harris，专利专家

ATCC专利保藏处

请注意：从2001年1月1日起关于专利保藏的收费价格上涨。保藏表格也于2000年2月进行了更改。有关目前使用的保藏表格和收费说明的信息可以从我们的网站获得：www.atcc.org

生物保藏布达佩斯条约

美国典型培养物保藏中心

10801 University Blvd.Manassas，VA 20110-2209

                                                  ATCC

电话：703-365-2700；传真：703-365-2745；email：

applied-sci@atcc.org

本表格用于专利目的的保藏或对保藏类型的转换，以使之满足布达佩斯条约关于微生物保藏的国际认可的要求

所有问题必须有英文作答。一张表格只能填写一种菌株。

1.保藏物名称。如果是保藏物是微生物，请给出其科学命名法的全称，包括属名，种名和该材料的分离来源；如果保藏物是病毒，请给出其命名，并明确是来源于植物还是动物，其来源地，包括其地理位置；如果保藏物是细胞系，请给出其组织和种名，分离来源的地理位置，以及任何与其相关的危害(HIV，EBV，等)；如果保藏物是基因材料，请给出衍生其的载体，克隆或文库的生物名称，请给出由物种(例如，人，鼠)鉴定的DNA插入的来源或其科学命名，基因的名称，以及对宿主生物的同一性；如果保藏是聚生体(consortia)或混合培养的，请明确每一种成分；如果保藏物是种子，胚胎，虫卵等，请给出俗名，科学名以及地理来源。

Avian Mannheimia haemolytica(以前被称为Pasteurella haemolytica)

2.菌株命名(即，数字，符号等)(该菌株命名必须与其贮藏瓶上的标签一致)

   BIV-07990                                               

3.这是布达佩斯条约下的首次保藏吗？    是                          

4.这是否是将ATCC的已有保藏转为满足布达佩斯条约要求的保藏？如果是请给出ATCC命名。

不适用于该情况。                                                  

5.该保藏物是微生物或细胞的混合物吗？    不是                      

6.请提供关于对该保藏物的培养，存活检测及储存保藏物的详细条件。如果是混合物，请对各个成分给予说明并提供鉴别其存在的方法。如果是质粒，请提供其宿主名称以及抗生素抗性。

  见附件3                                                         

7.请提供能让ATCC确证保藏物特性的足够信息(例如，革兰氏阴性杆状)

  见附件3                                                      

a.如果保藏物是一种细胞培养物，其是否要在抗生素存在条件下培养？如果是，请列出所述抗生素。

不适用于该情况。                                               

b.如果保藏物是一种杂交瘤，其所产生抗体的同种型是什么？    不适用于该情况             

8.该菌株对人有害吗？是□，否动物呢？是否□植物呢？是□，否如果答案是“是”，请推荐对此菌株操作时所需遵循的生物安全级别？    1                                                      

9.保藏物的可获得性：在相关的美国专利被授予之前，只有在接到保藏人或是相关专利局的指示时，ATCC才能向外提供该保藏物。接到布达佩斯条约参加国的专利局的指示后，ATCC必须将保藏物样品提供给某一特定的调查人。以下的请保藏人务必回答：

a)自满足布达佩斯条约的要求的保藏之日起，或是自保藏的类型转为满足布达佩斯条约要求的保藏之日起，您是否愿意任何人在提出要求后可以获得您的保藏物？如果答案是肯定的，那么提出要求想获得您的保藏物的人是没有限制的。如果答案是否定的，在相应的美国专利被授予之后才能保证此保藏物为公众所得到。是□，否

b)自满足布达佩斯条约的要求的保藏之日起，或是自保藏的类型转为满足布达佩斯条约要求的保藏之日起，您是否愿意让不属于布达佩斯条约，但是满足国家条件的专利局请求得到您的保藏物？

是□，否如果是肯定的，请给出您指定的国家＿＿＿＿＿＿＿＿＿

请注意，如果您希望将保藏的类型转为满足布达佩斯条约要求的保藏，而您的保藏物因为相应的美国的授权而向公众公开发售，您将不能对其的进一步发售作出限制。

在相应的美国专利被授权并且ATCC被通知后，根据美国专利局条约和细则(37CFR 1.808[a][2])，任何人向ATCC请求得到该保藏物都将被允许。

10.在存活实验完全之后ATCC将告知您该保藏物的ATCC保藏号。

被告知人＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿

传真：52 3 668 80 80    电话：52 3 668 8038        E-mail：baguilar@gua.boehringer-ingelheim.com

11.除非事先对付帐事宜有约定，使用支票或信用卡(Mastercard，VISA或American Express)时必须出示保藏。ATCC也接受正确帐户中的订单。

订单号＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿    支票号＿＿＿＿＿＿

信用卡号(请注明是Master卡，VISA卡还是AE卡)＿＿＿＿＿＿＿＿＿

到期日＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿   卡上名字(请清晰

书写或打印)＿＿＿＿＿    持卡人签名 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿

支付：ATCC必须要有一个寄帐单的地址，请注明负责所有保藏物的联系人，电话和传真号码。

联系人：Abelardo Aguilar                                    

Calle 30 No.2614 Zonal Industrial 44940                     

Guadalajara，Jalisco，Mexico                                

传真：52 3 668 80 80                     电话：52 3 668 8038

12.您的律师的姓名，地址，电话和传真号码

13.必填项

此保藏是在Boehringer Ingelheim Vetmedica，S.A.de C.V.的名义下。

我明白并且同意此保藏物在布达佩斯条约规定的一段时间(自保藏日起30年内或自对该保藏物的最近一次请求之日内5年内，取上述两者中长者，)能被我撤消。如果在相应的专利期限或规定的一段时间内保藏物死亡或被毁坏，提供相同生物的活的培养或病毒情况下为，细胞培养物，质粒，胚胎和种子将是我的责任。在规定的一段时间内提供足够量的保藏物也将是我的责任。

Ing.Jorge Suchil B.                     2001年5月24日

打印的                      签名        日期

地址Calle 30 No.2614 Zona Industrial 44940 Guadalajara，Jalisco，Mexico

传真：523 668 80 80  电话：523 668 8038 E-mail：

jsuchil@gua.boehringer-ingelheim.com

保藏物和表格需要寄给如下地址：

                    Patent Depository

                    American Type Culture Collection

                    10801 University Blvd.Manassas，VA

                    20110-2209，USA

保藏：正如大多数国家的专利局所要求的，保藏日期是自保藏日起30年内或自对该保藏物的最近一次请求之日内5年内，取上述两者中长者。

收费：请登陆我们的网站www.atcc.org，或是通过电邮applied-sci@atcc.org，或是打电话至703-365-2700来索取我们的收费单，收费价格可能浮动。

由ATCC填写

ATCC指定国＿＿＿＿＿＿是否收到＿＿＿＿＿＿＿＿存活实验结果＿＿＿＿

保藏物名称＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿菌株指定国＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿

对此表格的不正确填写将会延误申请                                                请打印或清楚书写

只有在填写了此表格并且其中的信息    根据1995年的Paperwork Reduction法案，当用于收集信被证实了之后(9CFR 94，95和122)，此  息的表格上没有显示有效OMB控制号码时，任何人可以拒     此表格的申请中的受监控的物质，生物或载体    绝填写该表格。此信息表格的OMB控制号码为0579-0015。    OMB许可才能进入美国或在各州之间流动        针对每一表格上的信息，本机构的工作时间大约为1.6-3     号小时，包括阅读说明，搜索现有的数据库，收集并维持所    0579-0015需的数据，以及完成和阅读所收集到的信息。    美国农业部动植物健康检查服务中心兽医服务中心国家进出口中心，产品项目4700 River Road，Unit 40 Riverdale，MO 20737-1231应用于：进口和运输受监控材料或生物体或载体    1.运输方式□空运  □海运  □陆运  □其他    2.进入的美国海关    3.进口者：美国典型培养物保藏中心10801，University Bvd.Manassas VA 20110-2209电话：(703)365-2700，传真：365-2745    4.发货人    5.对入关物品的描述(请尽可能地提供下列信息：动物种类，动物产品源的组织，此动物的原动物产品起源国家，对此动物的处理国家，重组系统，基因插入片段，抗体免疫原，稳定剂，动物源在培养基中的营养因子)25个玻璃瓶，其中装有冻干的Avian Manheimia haemolytica以前被称为Pasteurella haemolytica，被鉴定为BIV-07990    6.进口的数量，次数，以及预期的结束日期    7.该进口物品的预期使用目的(对于动物病原体或载体，请描述其实验室/生物安全过程)    8.如果是被用于动物，请说明具体动物物种    9.在该物品被进口至美国之前对其进行的处理(对其的处理纯化方法，包括处理时间，温度，pH值，其它处理，疾病安全等级等)请见附件6    10.对该进口材料或衍生物的最后处理方法    由我所代表的公司/机构的授权，我证明此物品的使用将遵守所有限定和规定    11.申请人签字    12.打印清楚的名字和头衔    13.日期    14.付款方式(请注明信用卡类型及到期日)

Vs表格16-3(99年11月)

                          附件3

                    布达佩斯条约保藏

对问题6的回答

培养特性  该菌株能够生长于心脑浸出液肉汤(Brain Heart Infusionbroth)(Difco)或胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptose Soy broth)。37℃下孵育约6-8小时达到对数生长期。

在血琼脂平板中，生长峰值出现于37℃孵育24小时后，这种方法的优点是能够观察到溶血现象。

冻干保存.细菌在心脑浸出液肉汤(Difeo)中生长6-8小时。用Bacto SkimMilk(Difco)的10％无菌溶液，按1∶1(v/v)比例作为稳定剂。

存活力试验.取一小瓶冻干物，用1ml无菌PBS 1X，pH 7.2重配。用无菌PBS，pH 7.2作10倍系列稀释。每一稀释度各取100μl接种于血琼脂平板。37℃孵育24小时。用菌落计数方法检验存活力。

对问题7的回答

7.3.BIV-0799

肉眼观察的形态

在绵羊血琼脂上培养24小时后长成的菌落，直径1.0-1.5mm，光亮半透明，微凸起、表面光滑、奶油状，β-溶血。

显微镜下观察到的形态

革兰氏-阴性，不运动，多形性杆状，常呈现两极染色。

生化及其他试验

    试验    反应    氧化酶    +    过氧化氢酶    +    吲哚    -    葡萄糖    +    蔗糖    +    MacConkey    +    脲酶    -    硝酸盐    +    麦芽糖  +    甘露醇  +    阿拉伯糖  -    纤维二糖  -    山梨醇  +    xilose  +    海藻糖  -    水杨苷  -    鸟氨酸  -    七叶苷  -    β葡萄糖苷酶  -    α-岩藻糖苷酶  -    β半乳糖苷酶  +

                         附件6

                        进入许可

对问题6的回答(进入美国前材料的处理)

BIV-07990菌株

1.从产蛋鸡输卵管中分离

2.器官浸软(Maceration)

3.接种于营养肉汤(20ml购自Difco的BHI)

4.37℃孵育24小时

5.接种于绵羊血琼脂平板

6.分离β溶血菌落

7.接种于绵羊血琼脂平板

8.鉴定(生化及其他试验)

9.接种于购自Difco的BHI

10.细菌在心脑浸出液肉汤(Difco)中培养6-8小时

11.用Bacto Skim Milk(Difco)的10％无菌溶液，按1∶1(v/v)比例作为稳定剂。

12.样本冻干

13.生存力、纯度及生化试验

生物保藏布达佩斯条约

美国典型培养物保藏中心

10801 University Blvd.Manassas，VA 20110-2209

                                                   ATCC

电话：703-365-2700；传真：703-365-2745；email：applied-sci@atcc.org

本表格用于专利目的的保藏或对保藏类型的转换，以使之满足布达佩斯条约关于微生物保藏的国际认可的要求

所有问题必须有英文作答。一张表格只能填写一种菌株。

1.保藏物名称。如果是保藏物是微生物，请给出其科学命名法的全称，包括属名，种名和该物质的分离来源；如果保藏物是病毒，请给出其命名，并明确是来源于植物还是动物，其来源地，包括其地理位置；如果保藏物是细胞系，请给出其组织和种名，分离来源的地理位置，以及任何与其相关的危害(HIV，EBV，等)；如果保藏物是基因材料，请给出衍生其的载体，克隆或文库的生物名称，请给出由物种(例如，人，鼠)鉴定的DNA插入的来源或其科学命名，基因的名称，以及对宿主生物的同一性；如果保藏是聚生体(consortia)或混合培养的，请明确每一种成分；如果保藏物是种子，胚胎，虫卵等，请给出俗名，科学名以及地理来源。

Avian Pasteurella(以前被称为Pasteurella haemolvtica)

2.菌株命名(即，数字，符号等)(该菌株命名必须与其贮藏瓶上的标签一致)

BIV-AVICOR                                          

3.这是布达佩斯条约下的首次保藏吗？       是         

4.这是否是将ATCC的已有保藏转为满足布达佩斯条约要求的保藏？如果是请给出ATCC命名。

不适用于该情况。                                    

5.该保藏物是微生物或细胞的混合物吗？      不是      

6.请提供关于对该保藏物的培养，存活检测及储存保藏物的详细条件。如果是混合物，请对各个成分给予说明并提供鉴别其存在的方法。如果是质粒，请提供其宿主名称以及抗生素抗性。

见附件2                                                

7.请提供能让ATCC确证保藏物特性的足够信息(例如，革兰氏阴性杆状)

见附件2                                                

a.如果保藏物是一种细胞培养物，其是否要在抗生素存在条件下培养？如果是，请列出所述抗生素。

不适用于该情况。                                       

b.如果保藏物是一种杂交瘤，其所产生抗体的同种型是什么？    不适用于该情况              

8.该菌株对人有害吗？是□，否动物呢？是否□植物呢？是□，否如果答案是“是”，请推荐对此菌株操作时所需遵循的生物安全级别？1(Refer to Biosafety in Microbiological and BiomedicalLaboratories，4^th ed.US Dept.of Health and human serviceswww.cdc.gov./od/ohs/biosftv/bmbl4toc.htm)

9.保藏物的可获得性：在相关的美国专利被授予之前，只有在接到保藏人或是相关专利局的指示时，ATCC才能向外提供该保藏物。接到布达佩斯条约参加国的专利局的指示后，ATCC必须将保藏物样品提供给某一特定的调查人。以下的请保藏人务必回答：

a)自满足布达佩斯条约的要求的保藏之日起，或是自保藏的类型转为满足布达佩斯条约要求的保藏之日起，您是否愿意任何人在提出要求后可以获得您的保藏物？如果答案是肯定的，那么提出要求想获得您的保藏物的人是没有限制的。如果答案是否定的，在相应的美国专利被授予之后才能保证此保藏物为公众所得到。是□，否

b)自满足布达佩斯条约的要求的保藏之日起，或是自保藏的类型转为满足布达佩斯条约要求的保藏之日起，您是否愿意让不属于布达佩斯条约，但是满足国家条件的专利局请求得到您的保藏物？

是□，否如果是肯定的，请给出您指定的国家

请注意，如果您希望将保藏的类型转为满足布达佩斯条约要求的保藏，而您的保藏物因为相应的美国的授权而向公众公开发售，您将不能对其的进一步发售作出限制。

在相应的美国专利被授权并且ATCC被通知后，根据美国专利局条约和细则(37CFR 1.808[a][2])，任何人向ATCC请求得到该保藏物都将被允许。

10.在存活实验完全之后ATCC将告知您该保藏物的ATCC保藏号。

被告知人    Abelardo Agualar                                

传真：52 3 668 80 80    电话：52 3 668 8038        E-mail：baguilar@gua.boehringer-ingelheim.com

11.除非事先对付帐事宜有约定，使用支票或信用卡(Mastercard，VISA或American Express)时必须出示保藏。ATCC也接受正确帐户中的订单。

订单号＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿    支票号＿＿＿＿＿＿信用卡号(请注明是Master卡，VISA卡还是AE卡)＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿到期日＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿    卡上名字(请清晰书写或打印)＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 持卡人签名＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿

支付：ATCC必须要有一个寄帐单的地址，请注明负责所有保藏物的联系人，电话和传真号码。

联系人：Abelardo Aguilar                                        

Calle 30 No.2614 Zonal Industrial 44940                         

Guadalajara，Jalisco，Mexico                                    

传真：52 3 668 80 80                       电话：52 3 668 8038

12.您的律师的姓名，地址，电话和传真号码＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿

13.必填项

此保藏是在Boehringer Ingelheim Vetmedica，S.A.de C.V.的名义下。

我明白并且同意此保藏物在布达佩斯条约规定的一段时间(自保藏日起30年内或自对该保藏物的最近一次请求之日内5年内，取上述两者中长者，)能被我撤消。如果在相应的专利期限或规定的一段时间内保藏物死亡或被毁坏，提供相同生物的活的培养或病毒情况下为，细胞培养物，质粒，胚胎和种子将是我的责任。在规定的一段时间内提供足够量的保藏物也将是我的责任。

Ing.Jorge Suchil B.                              2001年5月24日    

打印的签名                      签名             日期

地址Calle 30 No.2614 Zona Industrial 44940 Guadalajara，Jalisco，Mexico                                                             

传真：52 3 668 80 80    电话：52 3 668 8038        E-mail：jsuchil@gua.boehringer-ingelheim.com

保藏物和表格需要寄给如下地址：Patent Depository

                              American Type Culture Collection

                              10801 University Blvd.Manassas，VA

                              20110-2209，USA

保藏：正如大多数国家的专利局所要求的，保藏日期是自保藏日起30年内或自对该保藏物的最近一次请求之日内5年内，取上述两者中长者。

收费：请登陆我们的网站www.atcc.org，或是通过电邮applied-sci@atcc.org，或是打电话至703-365-2700来索取我们的收费单，收费价格可能浮动。

由ATCC填写

ATCC指定国＿＿＿＿＿＿ 是否收到 ＿＿＿＿＿＿存活实验结果＿＿＿＿＿＿

保藏物名称＿＿＿＿＿＿＿＿菌株指定国＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿

对此表格的不正确填写将会延误申请                                                 请打印或清楚书写

只有在填写了此表格并且其中的信息    根据1995年的Paperwork Reduction法案，当用于此表格的被证实了之后(9CFR 94，95和122)，此  收集信息的表格上没有显示有效OMB控制号码时，任何人      OMB许可申请中的受监控的物质，生物或载体    可以拒绝填写该表格。此信息表格的OMB控制号码为          号才能进入美国或在各州之间流动        0579-0015。针对每一表格上的信息，本机构的工作时间大    0579-0015约为1.6-3小时，包括阅读说明，搜索现有的数据库，收集并维持所需的数据，以及完成和阅读所收集到的信息。    美国农业部动植物健康检查服务中心兽医服务中心国家进出口中心，产品项目4700 River Road，Unit 40 Riverdale，MO20737-1231应用于：进口和运输受监控材料或生物体或载体    1.运输方式□空运  □海运  □陆运  □其他    2.进入的美国海关    3.进口者：美国典型培养物保藏中心10801，University Bvd.Manassas VA 20110-2209电话：(703)365-2700，传真：365-2745    4.发货人    5.对入关物品的描述(请尽可能地提供下列信息：动物种类，动物产品源的组织，此动物的原动物产品起源国家，对此动物的处理国家，重组系统，基因插入片段，抗体免疫原，稳定剂，动物源在培养基中的营养因子)25个玻璃瓶，其中装有冻干的Avian Pasteurella trehalosi以前被称为Pasteurella haemolytica，被鉴定为BIV-AVICOR    6.进口的数量，次数，以及预期的结束日期    7.该进口物品的预期使用目的(对于动物病原体或载体，请描述其实验室/生物安全过程)    8.如果是被用于动物，请说明具体动物物种    9.在该物品被进口至美国之前对其进行的处理(对其的处理纯化方法，包括处理时间，温度，pH值，其它处理，疾病安全等级等)请见附件5    10.对该进口材料或衍生物的最后处理方法由我所代表的公司/机构的授权，我证明此物品的使用将遵守所有限定和规定    11.申请人签字    12.打印清楚的名字和头衔    13.日期    14.付款方式(请注明信用卡类型及到期日)

VS表格16-3(99年11月)

                          附件2

                    布达佩斯条约保藏

对问题6的回答

培养特性该菌株能够生长于心脑浸出液肉汤(Brain Heart Infusionbroth)(Difco)或胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptose Soy broth)。37℃下孵育约6-8小时达到对数生长期。

在血琼脂平板中，于37℃孵育24小时后出现生长峰值，这种方法的优点是能够观察到溶血现象。

冻干保存.细菌在心脑浸出液肉汤(Difco)中生长6-8小时。用Bacto SkimMilk(Difco)的10％无菌溶液，按1∶1(v/v)比例作为稳定剂。

存活力试验.取一小瓶冻干物，用1ml无菌PBS 1X，pH 7.2重配。用无菌PBS，pH 7.2作10倍系列稀释。每一稀释度各取100μl接种于血琼脂平板。37℃孵育24小时。用菌落计数方法检验存活力。

对问题7的回答。

7.2.BIV-AVICOR

肉眼观察的形态

在绵羊血琼脂上培养24小时后长成的菌落，直径1.0-1.5mm，光亮半透明，微凸起、表面光滑、奶油状，β-溶血。

显微镜下观察到的形态

革兰氏-阴性，不运动，多形性杆状，常呈现两极染色。

生化及其他试验

    试验    反应    氧化酶    +    过氧化氢酶    +    吲哚    -    葡萄糖    +    蔗糖    +    MacConkey    +    脲酶    -    硝酸盐    +    麦芽糖    +    甘露醇    +    阿拉伯糖    -    纤维二糖    -    山梨醇    +    xilose    +    海藻糖    +    水杨苷    -    鸟氨酸    -    七叶苷    -    β葡萄糖苷酶    +^α    α-岩藻糖苷酶    -    β半乳糖苷酶    +

^α80％是阳性

                         附件5

                        进入许可

对问题6的回答(进入美国前材料的处理)

BIV-AVICOR菌株

1.从产蛋母鸡心脏中分离

2.器官浸软

3.接种于营养肉汤(20ml购自Difco的BHI)

4.37℃孵育24小时

5.接种于绵羊血琼脂平板

6.分离β溶血菌落

7.接种于绵羊血琼脂平板

8.鉴定(生化及其他试验)

9.接种于购自Difco的BHI

10.细菌在心脑浸出液肉汤(Difco)中培养6-8小时

11.用Bacto Skim Milk(Difco)的10％无菌溶液，按1∶1(v/v)比例作为稳定剂

12.样本冻干

13.生存力(viability)、纯度及生化试验

生物保藏布达佩斯条约

美国典型培养物保藏中心

10801 University Blvd.Manassas，VA 20110-2209

                                                  ATCC

电话：703-365-2700；传真：703-365-2745；email：applied-sci@atcc.org

本表格用于专利目的的保藏或对保藏类型的转换，以使之满足布达佩斯条约关于微生物保藏的国际认可的要求

所有问题必须有英文作答。一张表格只能填写一种菌株。

1.保藏物名称。如果是保藏物是微生物，请给出其科学命名法的全称，包括属名，种名和该物质的分离来源；如果保藏物是病毒，请给出其命名，并明确是来源于植物还是动物，其来源地，包括其地理位置；如果保藏物是细胞系，请给出其组织和种名，分离来源的地理位置，以及任何与其相关的危害(HIV，EBV，等)；如果保藏物是基因材料，请给出衍生其的载体，克隆或文库的生物名称，请给出由物种(例如，人，鼠)鉴定的DNA插入的来源或其科学命名，基因的名称，以及对宿主生物的同一性；如果保藏是聚生体(consortia)或混合培养的，请明确每一种成分；如果保藏物是种子，胚胎，虫卵等，请给出俗名，科学名以及地理来源。

Avian Pasteurella trehalosi(以前被称为Pasteurella haemolytica)    

2.菌株命名(即，数字，符号等)(该菌株命名必须与其贮藏瓶上的标签一致)

BIV-4895                                                          

3.这是布达佩斯条约下的首次保藏吗？    是                          

4.这是否是将ATCC的已有保藏转为满足布达佩斯条约要求的保藏？如果是请给出ATCC命名。

不适用于该情况。                                                  

5.该保藏物是微生物或细胞的混合物吗？    不是                      

6.请提供关于对该保藏物的培养，存活检测及储存保藏物的详细条件。如果是混合物，请对各个成分给予说明并提供鉴别其存在的方法。如果是质粒，请提供其宿主名称以及抗生素抗性。

见附件1                                                    

7.请提供能让ATCC确证保藏物特性的足够信息(例如，革兰氏阴性杆状)

见附件1                                                    

a.如果保藏物是一种细胞培养物，其是否要在抗生素存在条件下培养？如果是，请列出所述抗生素。

不适用干该情况。                                           

b.如果保藏物是一种杂交瘤，其所产生抗体的同种型是什么？    不适用于该情况             

8.该菌株对人有害吗？是□，否动物呢？是否□植物呢？是□，否如果答案是“是”，请推荐对此菌株操作时所需遵循的生物安全级别？    1                                                  

9.保藏物的可获得性：在相关的美国专利被授予之前，只有在接到保藏人或是相关专利局的指示时，ATCC才能向外提供该保藏物。接到布达佩斯条约参加国的专利局的指示后，ATCC必须将保藏物样品提供给某一特定的调查人。以下的请保藏人务必回答：

a)自满足布达佩斯条约的要求的保藏之日起，或是自保藏的类型转为满足布达佩斯条约要求的保藏之日起，您是否愿意任何人在提出要求后可以获得您的保藏物？如果答案是肯定的，那么提出要求想获得您的保藏物的人是没有限制的。如果答案是否定的，在相应的美国专利被授予之后才能保证此保藏物为公众所得到。是□，否

b)自满足布达佩斯条约的要求的保藏之日起，或是自保藏的类型转为满足布达佩斯条约要求的保藏之日起，您是否愿意让不属于布达佩斯条约，但是满足国家条件的专利局请求得到您的保藏物？

是□，否如果是肯定的，请给出您指定的国家

请注意，如果您希望将保藏的类型转为满足布达佩斯条约要求的保藏，而您的保藏物因为相应的美国的授权而向公众公开发售，您将不能对其的进一步发售作出限制。

在相应的美国专利被授权并且ATCC被通知后，根据美国专利局条约和细则(37CFR 1.808[a][2])，任何人向ATCC请求得到该保藏物都将被允许。

10.在存活实验完全之后ATCC将告知您该保藏物的ATCC保藏号。

被告知人    Abelardo Agular                                   

传真：52 3 668 80 80    电话：52 3 668 8038        E-mail：baguilar@gua.boehringer-ingelheim.com

11.除非事先对付帐事宜有约定，使用支票或信用卡(Mastercard，VISA或American Express)时必须出示保藏。ATCC也接受正确帐户中的订单。

订单号＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿    支票号＿＿＿＿＿＿

信用卡号(请注明是Master卡，VISA卡还是AE卡)＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿

到期日 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿    卡上名字(请清晰书写或打印)＿＿＿＿＿＿＿＿

持卡人签名＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿

支付：ATCC必须要有一个寄帐单的地址，请注明负责所有保藏物的联系人，电话和传真号码。

联系人：Abelardo Aguilar                                       

Calle 30 No.2614 Zonal Industrial 44940                        

Guadalajara，Jalisco，Mexico                                   

传真：52 3 668 80 80                       电话：52 3 668 8038

12.您的律师的姓名，地址，电话和传真号码

13.必填项

此保藏是在Boehringer Ingelheim Vetmedica，S.A.de C.V.的名义下。

我明白并且同意此保藏物在布达佩斯条约规定的一段时间(自保藏日起30年内或自对该保藏物的最近一次请求之日内5年内，取上述两者中长者，)能被我撤消。如果在相应的专利期限或规定的一段时间内保藏物死亡或被毁坏，提供相同生物的活的培养或病毒情况下为，细胞培养物，质粒，胚胎和种子将是我的责任。在规定的一段时间内提供足够量的保藏物也将是我的责任。

Ing.Jorge Suchil B.                              2001年5月24日    

打印的签名                      签名             日期

地址Calle 30 No.2614 Zona Industrial 44940 Guadalaiara，Jalisco，Mexico                                                             

传真：52 3 668 80 80  电话：52 3 668 8038        E-mail：jsuchil@gua.boehringer-ingelheim.com

保藏物和表格需要寄给如下地址：

                  Patent Depository

                  American Type Culture Collection

                  10801 University Blvd.Manassas，VA 20110-2209，

                  USA

保藏：正如大多数国家的专利局所要求的，保藏日期是自保藏日起30年内或自对该保藏物的最近一次请求之日内5年内，取上述两者中长者。

收费：请登陆我们的网站www.atcc.org，或是通过电邮applied-sci@atcc.org，或是打电话至703-365-2700来索取我们的收费单，收费价格可能浮动。

由ATCC填写

ATCC指定国＿＿＿＿＿＿＿是否收到＿＿＿＿＿＿＿存活实验结果＿＿＿＿＿

保藏物名称＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿菌株指定国＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿

对此表格的不正确填写将会延误申请                                               请打印或清楚书写

  只有在填写了此表格并且其中的    根据1995年的Paperwork Reduction法案，当用于收集信息信息被证实了之后(9CFR 94，95    的表格上没有显示有效OMB控制号码时，任何人可以拒绝填    此表格的和122)，此申请中的受监控的物    写该表格。此信息表格的OMB控制号码为0579-0015。针对     OMB许可质，生物或载体才能进入美国或在  每一表格上的信息，本机构的工作时间大约为1.6-3小时，    号各州之间流动                    包括阅读说明，搜索现有的数据库，收集并维持所需的数据， 0579-0015以及完成和阅读所收集到的信息。    美国农业部动植物健康检查服务中心兽医服务中心国家进出口中心，产品项目4700 River Road，Unit 40 Riverdale，MO 20737-1231应用于：进口和运输受监控材料或生物体或载体    1.运输方式□空运  □海运  □陆运  □其他    2.进入的美国海关    3.进口者：美国典型培养物保藏中心10801，University Bvd.Manassas VA 20110-2209电话：(703)365-2700，传真：365-2745    4.发货人    5.对入关物品的描述(请尽可能地提供下列信息：动物种类，动物产品源的组织，此动物的原动物产品起源国家，对此动物的处理国家，重组系统，基因插入片段，抗体免疫原，稳定剂，动物源在培养基中的营养因子)25个玻璃瓶，其中装有冻干的Avian Pasteurella trehalosi以前被称为Pasteurella haemolytica，被鉴定为BIV-4895    6.进口的数量，次数，以及预期的结束日期    7.该进口物品的预期使用目的(对于动物病原体或载体，请描述其实验室/生物安全过程)    8.如果是被用于动物，请说明具体动物物种    9.在该物品被进口至美国之前对其进行的处理(对其的处理纯化方法，包括处理时间，温度，pH值，其它处理，疾病安全等级等)请见附件4    10.对该进口材料或衍生物的最后处理方法由我所代表的公司/机构的授权，我证明此物品的使用将遵守所有限定和规定    11.申请人签字    12.打印清楚的名字和头衔    13.日期    14.付款方式(请注明信用卡类型及到期日)

Vs表格16-3(99年11月)

                         附件1

                    布达佩斯条约保藏

对问题6的回答

培养特性该菌株能够生长于心脑浸出液肉汤(Brain Heart Infusionbroth)(Difco)或胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptose Soy broth)。37℃下孵育约6-8小时达到对数生长期。

在血琼脂平板中，于37℃孵育24小时后出现生长峰值，这种方法的优点是能够观察到溶血现象。

冻干保存.细菌在心脑浸出液肉汤(Difco)中生长6-8小时。用Bacto SkimMilk(Difco)的10％无菌溶液，按1∶1(v/v)比例作为稳定剂。

存活力试验.取一小瓶冻干物，用1ml无菌PBS 1X，pH 7.2重配。用无菌PBS，pH 7.2作10倍系列稀释。每一稀释度各取100μl接种于血琼脂平板。37℃孵育24小时。用菌落计数方法检验存活力。

对问题7的回答。

7.1.BIV-4895

肉眼观察的形态

在绵羊血琼脂上培养24小时后长成的菌落，直径1.0-1.5mm，光亮半透明，微凸起、低溶解度、干燥，β-溶血。

显微镜下观察到的形态

革兰氏-阴性，不运动，多形性杆状，常呈现两极染色。

生化及其他试验

    试验    反应    氧化酶    +    过氧化氢酶    +    吲哚    -    葡萄糖    +    蔗糖    +    MacConkey    +    脲酶    -    硝酸盐    +    麦芽糖  -    甘露醇  +    阿拉伯糖  -    纤维二糖  -    山梨醇  +    xilose  +    海藻糖  +    水杨苷  -    鸟氨酸  -    七叶苷  -    β葡萄糖苷酶  -    α-岩藻糖苷酶  -    β半乳糖苷酶  +

                           附件4

                          进入许可

对问题6的回答(进入美国前材料的处理)

BIV-4895菌株

1.从产蛋母鸡腭裂中分离

2.接种于营养肉汤(20ml购自Difco的BHI)

3.37℃孵育24小时

4.接种于绵羊血琼脂平板

5.分离β溶血菌落

6.接种于绵羊血琼脂平板

7.鉴定(生化及其他试验)

8.接种于购自Difco的BHI

9.细菌在心脑浸出液肉汤(Difco)中培养6-8小时

10.用Bacto Skim Milk(Difco)的10％无菌溶液，按1∶1(v/v)比例作为稳定剂

11.样本冻干

12.生存力、纯度及生化试验