表皮干细胞构建组织工程化角膜上皮植片的制备方法及其用途

摘要

本发明公开了一种用表皮干细胞构建的人工角膜上皮植片的制备及用于移植修复因角膜缘干细胞缺损而失明的眼表的用途。表皮干细胞构建的人工角膜上皮植片，无菌采取成人颈部或关中奶山羊耳缘皮肤，用组块培养法和克隆筛选法分离纯化表皮干细胞，用无血清培养基进行扩增，并对所获干细胞进行CK19、P63、integrin－β1等表皮干细胞的标志蛋白免疫组织化学检测；再将纯化的表皮干细胞接种在去上皮细胞的人类羊膜支架上，无血清培养基培养，培养21天后，表皮干细胞在羊膜上分化形成复层，成为表皮干细胞羊膜植片；经透射电镜观察，表皮干细胞分为5－6层细胞；具有正常角膜上皮相似结构。以羊为实验动物模型进行自体或同种异体表皮干细胞羊膜植片移植均取得良好效果。

说明书

                                    技术领域

本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种以皮肤来源的表皮干细胞为种子细胞所构建的组织工程化角膜上皮植片的制备方法，并将该表皮干细胞构建组织工程化角膜上皮植片用于移植修复因角膜缘干细胞缺损而失明的眼表的用途。

                                    背景技术

正常眼表覆盖着高度分化的角膜和结膜上皮，两者分别由形态学上不同的两类上皮细胞构成。结膜上皮由能分泌粘蛋白的杯状细胞组成，且高度血管化。角膜由未角质化的扁平上皮组成，维持眼表完整性和正常视力。角膜上皮细胞来源于角膜缘的角膜干细胞[Schermer A et al，1986.J Cell Biol.103：49-62.Cotsarelis G.1989.Cell，57：201-209]，在临床上各种热、化学烧伤、史蒂文斯-约翰逊综合征(Stevens-Johnson Syndvome，SJS)，眼表瘢痕化天疱疮(Ocular cicatricial pemphigoid.OCP)，在角膜缘进行的各种外科手术及冷疗，角膜接触镜的磨损，以及严重的细菌感染等因素，都会导致角膜和角膜上皮干细胞缺损。邻近的结膜上皮就会侵入角膜引发慢性炎症，基质疤痕化，血管增生，严重影响视力，甚至失明。临床上已有通过手术疗法治疗严重眼表疾病的许多尝试。如羊膜负载角膜上皮细胞植片移植，能有效提高眼表重建效果。近年来，角膜上皮干细胞羊膜植片移植重建由于角膜缘干细胞缺损引发的眼表疾病也多有报道(Pellegrini，G，et al 1997.Lancet，349：990-993；Tsai RJE et al.2000；N Engl J Med.343：86-93，Schwab IR et al，2000，Cornea.19：421-426)。然而，角膜缘干细胞移植仍面临以下难题：1.自体移植时供体组织不足。2.异体移植时会有免疫排斥，术后需使用大量免疫抑制剂。大量免疫抑制剂的使用会引发机体的并发症，严重影响病人生活质量。自体角膜干细胞羊膜植片移植重建受损角膜，虽有成功报道，但对SJS和OCP常导致患者两侧的眼角膜受损，自体角膜上皮干细胞移植则无法进行。日本学者，以兔为模型动物进行了用口腔粘膜上皮羊膜植片重建受损角膜的研究，试图解决这一难题，但只有移植后10天的结果报道，其结果显示：口腔粘膜上皮羊膜植片能重建角膜上皮，但长期移植效果有待进一步观察(Nakamura T et al.2003.Invest Ophthalmol Vis Sci；37：523-533)；Yuan等(2002)将皮肤表皮细胞和角膜上皮细胞在羊膜上共培养，发现表皮细胞在羊膜上培养一定时间后，表达角膜上皮特异性标志蛋白K₃，提示可用表皮细胞替代角膜上皮细胞构建人工角膜，但未进行进一步试验。本发明首次公开一种用皮肤表皮干细胞构建组织工程化角膜上皮的成功方法，并以关中奶山羊为实验动物制作角膜缘干细胞缺损模型，将构建的组织工程化角膜上皮进行自体和同种异体移植。移植后八个月后，效果明显。

                                    发明内容

本发明的目的在于，提供一种用表皮干细胞替代角膜缘干细胞构建组织工程化角膜上皮及其用于重建角膜缘干细胞缺损眼表的用途，以解决临床上因两侧眼晴受损无法进行自体角膜缘干细胞移植的难题，是一种采用表皮干细胞构建组织工程化角膜上皮，治疗角膜缘干细胞缺损的成功方法。

实现上述目的所采用的技术解决方案是，表皮干细胞构建组织工程化角膜上皮植片的制备方法，采用来源于成体皮肤组织的表皮干细胞进行制备，其特征在于，包括以下步骤：

1.表皮干细胞来源于成体皮肤组织。

无菌采取约0.5×0.6cm²大小的成人颈部皮肤或哺乳动物(主要包括宠物，家畜和珍稀野生动物)耳缘皮肤，用组织块培养法和克隆筛选法分离纯化表皮干细胞，用无血清培养基进行扩增，并对所获得干细胞进行CK₁₉、P63、integrin-β₁等表皮干细胞的标志蛋白免疫组织化学检测，均为阳性，证明所使用的细胞具表皮干细胞特征。

2.以一种去上皮细胞的人羊膜支架负载表皮干细胞，用无血清培养基培养，第一周为浸没培养(37℃，5％CO₂，饱和湿度)，每两天换液；第2-3周气-液界面培养(37℃，5％CO₂，饱和湿度)，每天换液。培养21天后，表皮干细胞在羊膜上分化形成复层，即为可用于移植的表皮干细胞羊膜植片。所制做的表皮干细胞羊膜植片经透射电镜观察，表皮干细胞分为5-6层细胞。基底层细胞呈柱状为祖细胞特征，细胞形态正常。细胞间有桥粒结构，细胞与基底膜之间有半桥粒结构，表明表皮干细胞羊膜植片具有正常角膜上皮的相似结构。

1)无血清培养基的制备包括以下步骤：

(1)成纤维细胞条件培养基

A.无菌采取关中奶山羊颈部皮肤，用0.25％Trypsin+0.02％EDTA处理皮肤块，4℃过夜，使表皮与真皮分离；

B.将真皮与表皮间细胞冲洗干净，将真皮切成小块贴于玻璃皿中，每皿3-4块，加培养基：F12+1％BSA+10ng/ml EGF+10ug/ml insulin+10ng/ml IGF-1+青霉素100u/ml+链霉素100ug/ml进行培养；

C.当成纤维细胞铺满平皿后，去组织块，将成纤维细胞消化传代，以1×10⁵/ml，接种在50mm平皿中，培养48小时后收集培养基，在4000r/分条件下离心30分钟，0.22um滤膜过滤除菌，-20℃保存备用，标为GSFCM；

(2)IGF-1、EGF、GSFCM适宜添加浓度的筛选

在F12+1～1.2％BSA为基础培养基中分别添加EGF，IGF-1，GSFCM的不同设计浓度梯度，按正交试验进行分组，培养所分离纯化的表皮干细胞，并进行细胞计数测其生长曲线，克隆形成率和细胞形态学变化，比较不同组合的优缺点；

(3)最后确定培养基配方为：F12+1～1.2％BSA+20～25％GSFCM+20～25ng/mlEGF+5ug/ml insulin+15～20ng/ml IGF-1+0.4～0.6μg/ml氢化可的松+100u/ml青霉素+100ug/ml链霉素。

上述无血清培养基的制备方法已申请国家专利，专利申请号为：200410025938.5。

2)人羊膜(Human amniotic membrane，HAM)支架的制作。

羊膜取自经家属同意的且HIV、甲肝、乙肝以及梅毒等血清学反应显示为阴性的剖腹产分娩产妇的胎儿胎盘。在无菌间内，将带有羊膜的胎膜囊放入加有青霉素、链霉素的生理盐水中，顿性剥离附着在胎膜囊上的羊膜；将剥离下的羊膜用生理盐水反复冲洗，直至血液及其他污物被彻底清洗掉；再用含青霉素、链霉素的PBS冲洗3-5遍；用细胞刮以及角膜镊顿性剥离海绵层。将去除海绵层的羊膜用PBS冲洗，然后用眼科剪分成数小块，分别平铺于玻璃平皿内，加入0.1-0.4％的胰酶(含0.05-0.2％的EDTA)，经8-24小时消化去除上皮细胞；将去除上皮细胞的羊膜基底面向上平铺于玻璃皿内，将醋酸纤维素膜(NC膜)剪成中空的正方形(根据所需确定边长)附于其上，然后翻转，使其羊膜上皮面向上放入另一培养皿内；于恒温箱内放置30-120分钟，即可使用。

本发明所制作的组织工程化角膜上皮，具有透明度良好，弹性好，可操作性强等特点，可用于移植修复人类或动物因角膜缘干细胞缺损导致视力严重下降或失明的眼表，用于因角膜缘干细胞缺损而失明的动物模型的自体移植和同种异体移植均能取得良好的效果。所使用无血清培养基培养表皮干细胞及组织工程化角膜上皮，可减弱种子细胞的免疫记忆，降低同种异体移植时的免疫排斥反应，术后不需使用大量免疫抑制剂，拓宽了本发明在临床上的应用范围，不仅可用于自体移植，也可用于同种异体移植。本发明的最大优点是皮肤表皮干细胞来源丰富、取材方便。

                                附图说明

图1是移植前的碱烧伤模型羊眼睛的图片；

图2是纯化的表皮干细胞的图片；

图3是表皮干细胞在羊膜上正常增殖分化的图片；

图4是表皮干细胞羊膜植片的图片；

图5是表皮干细胞羊膜植片透射电镜照片；

图6是表皮干细胞羊膜植片缝合于植床的图片；

图7是移植245天后羊模型1眼表重建良好的图片；

图8是移植240天后模型2羊眼表重建良好的图片。

                                具体实施方式

以下结合关中奶山羊为实验模型对发明内容作进一步说明。

1.模型动物制作：选3-4岁健康无眼疾的成年关中奶山羊，肌注兽用846合剂2.4ml～2.6ml全麻，眼周用碘酒消毒。侧卧保定，铺手术洞巾，开睑器开睑，双抗生理盐水(硫酸青霉素2×10⁵u/L、链霉素200mg/L)冲洗眼表和结膜囊，2％盐酸利多卡因和1.3％盐酸布比卡因各5ml，球后麻醉。在眼科手术显微镜下，沿术眼角膜缘环形剪开球结膜和结膜下筋膜，暴露巩膜。环形去除角膜缘外1mm的巩膜和残留的结膜及角膜缘和角膜缘内2mm的角膜上皮组织(深约200um)。烧灼止血。然后，用蘸有1N NaOH棉签擦除中央角膜上皮，并烧伤至角膜基质发白。立即用生理盐水冲洗5min。术后术眼用氯霉素眼水滴眼，每日两次。术后每天观察，并详细记录结膜炎症，睑球粘连，角膜基质溶解、穿孔等情况。处理后4周，角膜表面血管化、结膜化，未发生睑球粘连和溃疡性穿孔。并根据角膜混浊度和表面新生血管化、结膜化(细胞压迹学检查出现杯细胞)等指标，来判定属角膜缘干细胞完全缺失病理模型，作为移植的实验动物模型(图1)。

2.表皮干细胞分离扩增与羊膜植片制作培养：无菌采取关中奶山羊耳缘皮肤，在无菌间用PBS冲洗数遍，去污物，在解剖镜下将皮肤与软骨分离，将皮肤切成0.1×0.1cm²大小的小块，按表皮面朝上贴于3.5cm塑料皿中，加适量培养液(M199+15～20％NBS+5～8μg/ml insulin+0.5μg/ml氢化可的松+100u/ml青链霉素+100ug/ml链霉素)，两天换液一次，3-4天后皮肤组织块四周有上皮样细胞铺层生长，7-12d后在上皮层上有表皮干细胞克隆生长，待这些克隆直径达100-150μm时，在解剖镜下挑取这些克隆，用0.2％Trypsin和0.02％EDTA适当处理，用玻璃针(自制)将这些细胞分离并吸入铺有明胶的3.5cm塑料皿中，用自行设计的无血清培养基，待细胞增殖达75％融合时，用0.25％Trypsin+0.02％EDTA进行消化，传代培养。

分离纯化皮肤表皮干细胞的制作包括以下步骤：

1)首先取一块皮肤，置于含青链霉素的生理盐水中，用含青链霉素的PBS(一)冲洗，去血污及毛发；

2)在解剖镜下将皮肤与皮下组织分开，将皮肤切成0.1～0.2×0.1～0.2cm²大小的小块，按表皮面朝上贴于玻璃平皿中，每皿3-4块，加培养基；培养基的配方为：Medium199+15～20％NBS(新生牛血清)+5～8μg/ml insulin(胰岛素)+0.5μg/ml氢化可的松+100u/ml青链霉素+100ug/ml链霉素；

3)置于CO₂培养箱中培养，培养箱内的条件为5％CO₂，饱和湿度，37℃，每两天换液一次；

4)经3天-4天后，从组织块边缘长出上皮样细胞铺路石样生长，7天-12天后，在上皮样细胞层上有小圆形细胞聚集呈克隆样生长，待这些克隆直径达100-150μm时，在解剖镜下挑取这些克隆，用0.20％Trypsin即胰蛋白酶和0.02％EDTA适当处理，用玻璃针将这些细胞吸入铺有明胶的3.5cm塑料皿中，用无血清培养基培养；

无血清培养基的配方为：F12+1～1.2％BSA(牛血清白蛋白)+20～25％GSFCM+20～25ng/ml EGF+5ug/ml insulin+20ng/ml IGF-1+0.4～0.6ug/ml氢化可的松+100u/ml青链霉素+100ug/ml链霉素。

5)待细胞增殖达75％融合时，用0.25％Trypsin+0.02％EDTA进行消化，传代培养，用无血清培养基将关中奶山羊表皮干细胞传25代冻存，将人类表皮干细胞传5代冻存；

6)对所获得细胞进行当前同行公认的表皮干细胞分子标志的检测：CK19，integrin-β₁P₆₃，integrin-α₆均为阳性，即证明所分选的是纯化的表皮干细胞。

上述分离纯化皮肤表皮干细胞的方法，申请人已申请国家专利，申请号为：200410025939.X。

无血清培养基的配方为：F12(Initrogen Corporation Lot1116568)+1～1.2％BSA(牛血清白蛋白Sigma，LOT 716H9310)+20～25％GSFCM(goat skin fibroblast conditionalmedium，GSFCM，山羊成纤维细胞条件培养基)+20～25ng/ml EGF(表皮细胞生长因子，Sigma，E-mail：techserv@sial.com，Product Number E9644)+5ug/ml insulin(胰岛素)+15～20ng/ml IGF-1胰岛素类生长因子-1，SigmaE-mail：techserv@sial.com，product Number I3769)+0.4～0.6μg/ml氢化可的松+100u/ml青链霉素+100ug/ml链霉素；

本发明将3-4代纯化的表皮干细胞(图2)接种在去上皮细胞的人类羊膜支架上，用无血清培养基培养(37℃，5％CO₂，饱和湿度)。第一周为浸没培养(37℃，5％CO₂，饱和湿度)，每两天换液；第2-3周气-液界面培养(37℃，5％CO₂，饱和湿度)，每天换液。

表皮干细胞在羊膜上正常增殖分化(图3)。培养21天后，表皮干细胞在羊膜上分化形成复层，即为可用于移植的表皮干细胞羊膜植片。所制做的表皮干细胞羊膜植片具有透明度良好，弹性好，可操作性强等特点(图4)。经透射电镜观察，表皮干细胞分为5-6层细胞，基底层细胞呈柱状为祖细胞特征，细胞形态正常，细胞间有桥粒结构，细胞与基底膜之间有桥粒结构，表明表皮干细胞羊膜植片具有正常角膜上皮的相似结构(图5)。

3.移植：实验羊移植前绝食一天。手术时846合剂2.4-2.6ml，肌注全麻，侧卧保定于手术床，剪去眼睫毛，碘酒消毒术眼外周皮毛，酒精脱碘。铺羊眼创布、开睑器开睑，双抗生理盐水(硫酸青霉素2×10⁵u/L、链霉素200mg/L)冲洗眼表和结膜囊，2％盐酸利多卡因和1.3％盐酸布比卡因各5ml，球后麻醉眼球。剪开球结膜，暴露巩膜，0.05％丝裂霉素棉花条置结膜下的巩膜上作用5min，用生理盐水反复冲洗。剪除整个角膜和角膜缘表面病变、增生组织，尽量使角膜基质恢复透明、植床平整，并烧灼止血，完全清除淤血，生理盐水反复冲洗后准备移植。移植前，将已培养好的表皮干细胞羊膜植片使用生理盐水冲洗3-5遍，每次5min，消除培养基中异原蛋白对植片的影响。将表皮干细胞羊膜植片上皮面向下覆盖于术部，羊膜四角先缝四针，固定于巩膜上若术眼暴露不良，应于上、下直肌处各固定一根引线，至少每个钟点位结节缝合一针，将羊膜固定于术部(如图6)。用角膜切开刀在已固定粘附好的羊膜上轻轻划开2-4个垂直切口，切口的大小应以不撕裂羊膜为度。2mg地塞米松、40万单位庆大霉素各一支混合结膜囊下注射。角膜宁眼药水点眼，术眼眼睑复位，并用无菌纱布暂时覆盖。术后第一周每天肌肉注射青霉素、链霉素、地塞米松，术后三周内每天0.3％氧氟沙星、地塞米松眼药水点眼2次，并按时观察照相，极时处理不良反应，第二周末拆除部分固定线。此后滴润舒眼药水至第6周，定期观察记录术眼 变化情况。八个月后有3/4的实验羊眼表修复重建效果明显，其中有1号，2号模型羊眼表有明显透明区，并不断扩大(图7-8)。

实验结果显示，以羊膜负载皮肤表皮干细胞构建羊膜植片，能有效重建干细胞缺损的角膜缘，并重建受损眼表，这一发明一旦应用于人类眼科临床能给无数因角膜缘干细胞缺损而致盲的人带来光明，造福于人类社会。同时可用于宠物，珍稀野生动物，珍贵家畜角膜缘干细胞缺损眼表修复。