长的正五聚蛋白PTX3在制备预防和治疗自身免疫性疾病的药物中的用途

摘要

本发明公开了长的正五聚蛋白PTX3(PTX3)或其功能性衍生物在制备预防和治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。

说明书

本发明涉及长的正五聚蛋白(pentraxin)PTX3(PTX3)或其功能性衍生物在制备预防和治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。

接触炎性细胞因子白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)后，在多种细胞类型中表达PTX3(Bottazzi等人，J.，Biol.Chem.1997，272：32817-32823)，尤其是单核吞噬细胞和内皮细胞。

迄今尚未了解PTX3的生物学功能。

PTX3由两个结构域组成，N端结构域与任何已知分子无关，C端结构域类似于短的正五聚蛋白，例如C-反应蛋白(CRP)(BreviarioF.等人，J.Biol.Chem.267：22190，1992)。

已经发现人PTX3(hPTX3)和动物PTX3之间的高度相似性。特别是小鼠PTX3(mPTX3)，其DNA序列以及基因组织和定位与hPTX3非常相似。人和小鼠PTX3基因的一致性程度为82％，如果考虑保守性置换则达到90％(Introna M.等人，Blood 87(1996)1862-1872)。小鼠PTX3基因位于小鼠染色体3上的类似于人3q(q24-28)的区域，与文献记载的hPTX3在3q 25区的位置相一致(Introna M.等人，Blood87(1996)1862-1872)。

hPTX3和mPTX3序列的高度相似性表明正五聚蛋白在进化过程中高度保守(Pepys M.B.，Baltz M.L.：Adv.Immunol.34：141，1983)。

有关正五聚蛋白的综述参见H.Gewurz等人，Current Opinionin Immunology，1995，7：54-64。

在接触由细胞因子和脂多糖(LPS)提供的促炎信号的组织中产生长的正五聚蛋白PTX3。

这些促炎化合物促进炎症过程涉及的细胞凋亡，并促进树突细胞(DC)生理成熟。

细胞死亡通常在体内炎症过程中发生。

生物体从活组织中去除凋亡细胞。在过度、混乱的凋亡过程中，大量死细胞阻碍了生物体清除细胞群的能力。这些细胞聚集在组织中，经由非常规吞噬细胞(例如不成熟的DC)的吞噬作用，增加了促进自身免疫过程的可能性(Cell Death Diff.1998；5：563-568)。

自身免疫过程的发展和维持需要将不成熟DC呈递的自身抗原(自我抗原)识别为对该生物体有害(外来或非我)的抗原。在不成熟DC去除凋亡细胞群的过程中发生这种识别错误。

胞内的自身抗原在凋亡过程中修饰，以及因凋亡压力所致激酶活化引起的蛋白质酯化作用，产生新的构象表位(1998 J.Exp.Med.187：547-560)。

细胞死亡并且细胞核破裂，随之自身抗原被特异性蛋白酶(天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，caspases)破坏1996 J.Exp.Med.184：765-770；1996 J.Exp.Med.183：1957-1964，并产生核小体，是原型系统性自身免疫性疾病，系统性红斑狼疮(SLE)的主要抗原(1993 J.Exp.Med 177：1367-1381；1999；1999 ArthritisRheum.42：833-843。

一些自身抗原通常与细胞骨架的内质网和质膜关联；这些抗原在凋亡早期分离。

与凋亡晚期产生的凋亡细胞群分离的细胞核自身抗原从凋亡细胞中排除1994 J.Exp.Med.179：1317-1330；1997 Exp.Cell Res.234：512-520。

相反，加工内在化死亡(凋亡)细胞产生T细胞表位1997 J.Immunol.159：5391-5399。

缺乏引发免疫应答能力的特异性或半特异性清除吞噬细胞，清除体内大部分的死亡细胞1998 Cell Death Diff.5：563-568。然而，最有效力的抗原递呈细胞(APC)是DC 1997 Curr.Opin.Immunol.9：10-16；1998 Nature 392：245-252，这些细胞使死亡细胞内在化，并将其加工的表位呈递给MHC I类和II类限制性T淋巴细胞1998 Nature 392：86-89；1998 J.Immunol.159：5391-5399；1998J.Exp.Med.188：2163-2173；1999 Nat Med 5：1249-1255；1999Nat Med 5：1232-1233。

DC来源于骨髓CD34+祖细胞1992 Nature.360：258-261。

DC前体进入血液，到达外周的器官，在那里发育为不成熟的DC。

不成熟的DC通过巨胞饮作用(macropinocytosis)捕获可溶性抗原1994 J.Exp.Med.179：1109-1118，通过吞噬作用捕获微粒1993 J.Exp.Med.178：479-488。

基本促炎信号，如IL-β和TNF-α，促进DC生理性成熟以及抗原呈递功能1999 Curr.Opin.Immunol.11：308-313。

因为细胞(定义为″自身″抗原储库)在发育和正常组织更新过程中连续死亡，DC呈递死亡细胞抗原为严谨性调节的。

在缺少导致DC成熟的炎症信号时发生经由凋亡而致的正常细胞死亡。

因此死亡细胞和成熟DC共存，影响对外周抗原的耐受1999 Nat.Med.5：1232-1233。但是自身免疫通常与炎症无关。

在生理情况下，只有少数凋亡细胞被不成熟的DC细胞吞噬。

环境因子(可能由炎症信号自身补充)，必定会阻止不成熟DC吞噬死亡细胞。

只有在严重失调的炎症过程中，细胞死亡增加，非常规吞噬细胞增强其吞噬活性，这种增强的吞噬作用增加了生物体将自身抗原识别为非自身抗原的可能性。

免疫活性细胞具有的识别自身抗原为对生物体有害或外来抗原的这种机制，是很多自身免疫性疾病发病的基础，例如系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化症(MS)、关节炎、糖尿病、甲状腺炎、溶血性贫血、萎缩性睾丸炎、古德帕斯彻病(Goodpasture’s disease)、自身免疫性视网膜病、自身免疫性血小板减少症、重症肌无力、原发性胆汁性肝硬变(primary biliary cirrhosis)、侵袭性慢性肝炎、溃疡性结肠炎、皮炎、慢性肾小球肾炎、斯耶格伦综合症(Sjogrensyndrome)、莱特尔综合症(Reiter syndrome)、肌炎(miositis)、系统性硬化症以及多关节炎。

系统性红斑狼疮是一种炎症性的系统性自身免疫性疾病，其特征在于从T细胞产生高亲合力的自身免疫性抗体。

处于疾病活跃期的SLE病人显示特别低的C反应蛋白CRP的血浆水平。

已经发现罹患SLE的病人先天性缺少补体因子C1q(1998Nature Genetics 19：56-59；1998 Nature Genetics 19：3-4)、由PTX3识别的因子(1997 J.Biol.Chem.272：32817-32823)。

此外，PTX3结合某些SLE非常特征性的自身抗原，例如组蛋白等(1990 J.Exp.Med.172：13-18；1997 J.Biol.Chem.272：32817-32823)。

PTX3先前的用途已经清楚，例如以申请人姓名申请的WO99/32516，描述了长的正五聚蛋白PTX3在治疗肿瘤性、炎症性以及感染性疾病中的用途。

US 5767252描述了属于正五聚蛋白家族的神经元细胞生长因子(也参见引用的出版物)。该专利涉及神经生物学领域。

迄今为止，对已知的大部分自身免疫性疾病尚未有满意的疗法。仍然非常需要既能防止将自身抗原识别为外来抗原，又能减轻这些疾病的症状而不引起更多副作用的新药。

这种抑制作用决定了阻断自身免疫性疾病的发作，这是上述疾病的基础。

如今意外发现，长的正五聚蛋白PTX3可用于防止和减轻自身免疫性疾病的症状。

实际上，长的正五聚蛋白PTX3能够结合凋亡细胞(而不结合活细胞)，防止这些细胞在过度或失调的凋亡过程中被不成熟DC吞噬。

如上所述，在炎症以及细胞死亡增多的过程中，大量死亡细胞阻断了生物体去除这些细胞的能力，这些细胞在组织中聚集，可以被非常规吞噬细胞(例如不成熟DC细胞)吞噬，起始自身免疫过程的可能性增加。

凋亡细胞和PTX3的结合有助于巨噬细胞清除凋亡细胞，防止凋亡细胞被不成熟的DC细胞吞噬而促进自身免疫性疾病。

本发明可以治疗的自身免疫性疾病选自系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化症(MS)、关节炎、糖尿病、甲状腺炎、溶血性贫血、萎缩性睾丸炎、古德帕斯彻病、自身免疫性视网膜病、自身免疫性血小板减少症、重症肌无力、原发性胆汁性肝硬变、侵袭性慢性肝炎、溃疡性结肠炎、皮炎、慢性肾小球肾炎、斯耶格伦综合症、莱特尔综合症、肌炎、系统性硬化症以及多关节炎。

″长的正五聚蛋白PTX3″是指任何长的正五聚蛋白PTX3或其功能性类似物，分别来自其起源(人或动物)或合成物。

长的正五聚蛋白优选人PTX3，其序列描述于WO99/32516。

下文报告一些阐述本发明的实施例。

实施例1

PTX3结合人凋亡细胞以及调节其清除的能力

细胞类型

1.白血病细胞

人白血病Jurkat T细胞购自ATCC(Rockville，MD)，在包含100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺和10％FCS(Hyclone，Logan，UT)的RPMI(Gibco BRL，Grand Island，NY)(组织培养基Tissue Culture Medium，TCM)或1％Nutridoma-SP(Boehringer Mannhein，Germany)(TCM-nut)中生长。

2.树突细胞

来源于循环中的单核细胞的不成熟的人DC，在重组GM-CSF和IL-4[(1999)J.Leuk.Biol.，66：345-349；(1997)J.Exp.Med.185：317-328]存在下培养，这种处理可以产生不成熟DC细胞的同种群体。

凋亡诱导

在TCM-nut中传代增殖Jurkat细胞，以避免非典型的血清辅因子干扰，在TCM-nut中，于37℃利用抗CD95 moAb(CH-11，100ng/10⁶细胞)或者U.V.源下照射20″，使其凋亡。如(ArthritisRheum.1998；41：205-214)所述，利用流式细胞术以及形态特征确证凋亡，在两种处理之后，大多数Jurkat T细胞(＞95％)凋亡。

在包含0.1mM MgC12和0.1mM CaC12的PBS(PBS++)中，利用FITC标记的Annexin V(Bender MedSystems，Prodotti Gianni，Milano，Italy)(0.5ml)室温10分钟染色后，通过流式细胞术和聚焦显微镜术(参见下文)确定暴露的磷脂酰丝氨酸(PS)。

利用流式细胞术检测DNA含量。

一些实验利用不同的药物处理(5μM BAPTA-AM，10μg/ml放线菌酮，20μM星形孢菌素，100μM和50mM二硫代氨基甲酸吡咯烷PDTC，100nM地塞米松)，使细胞凋亡。

通过加热细胞(95℃ 5分钟)、冻融或高渗休克(hyperhosmoticshock)(在150mM NaP，pH7.5，1.4M NaCl缓冲液中10分钟)使细胞坏死。

蛋白质

如J.Biol.Chem.1997；272：32817-32823中所述，人PTX3纯化自稳定持续表达该蛋白质的CHO细胞。如EMBO J.1992；11：813-89所述，进行PTX3的生物素化；随后如J.Biol.Chem.1997；272：32817-32823所述，在天然状态下，于5-10％梯度PAGE中分析生物素化的PTX3。

纯化的人C反应蛋白(CRP)、血清淀粉状蛋白P组分(SAP)以及牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma(St.Louis，MO)。

PTX3结合凋亡细胞

用生物素化的PTX3(测试范围0.1-500μg/ml)在室温下攻击细胞30分钟。

加入FITC偶联的链亲和素(Pierce，Rockford，IL)以后，利用流式细胞术显示细胞结合辅因子。在只存在FITC偶联的链亲和素的情况下，计算荧光本底。

提高生物素化PTX3的使用浓度，观察到结合按线性增强，在大约100μg/ml达到平台期。

在加入生物素化PTX3(10μg/ml)、FITC链亲和素以及FACS分析之前，凋亡细胞与PTX3、SAP、CRP和BSA(500g/ml)预温育，验证结合的特异性。

同样利用聚焦成像术表征PTX3与死亡细胞的结合：在这种情况下，染色的细胞种在聚赖氨酸包被的盖片上，室温20分钟，在4％(重量/体积)多聚甲醛中室温固定15分钟，并封固在Mowiol介质中。

利用配备氩/氪激光、75mW多线的Leica TCS-NT(LeicaMicrosystems，Heidelberg，Germany)聚焦激光扫描显微镜，进行聚焦激光扫描显微镜术。

根据细胞核特征，例如染色质边缘化、凝聚和片断化，容易识别经CD95(FAS)触发凋亡的Jurkat细胞。

吞噬作用

通过U.V.照射使扩增对数期的Jurkat细胞凋亡，利用绿色荧光脂肪族染料PKH2-GL(Sigma)标记。

洗涤后，细胞与或不与PTX3(100μg/ml室温30分钟)温育，然后37℃或4℃与DC共同温育90分钟。

既使用不成熟DC，也使用经TNF-α(1997 J.Exp.Med.185：317-328)处理后成熟的DC。作为对照，在存在或不存在PTX3的情况下，确定由不成熟以及成熟DC内在化的FITC标记的卵清蛋白(Sigma)或绿色荧光胶乳珠(2μm直径，Polysciences，Warrington，PA)。吞噬之后，DC在包含EDTA和胰蛋白酶的PBS中37℃温育15分钟，利用流式细胞术(FACS Scan，Becton and Dickinson，SanJose，CA)分析。

在独立样本中比较结合或内在化凋亡细胞的细胞百分比。

实施例1/1

如上所述，用生物素化PTX3和FITC-链亲和素攻击Jurkat细胞，然后利用流式细胞术确定其结合。

结果(代表4次独立实验)如下表1所示，表示为除在存在PTX3和FITC-链亲和素以及只存在FITC-链亲和素时的平均荧光强度而计算的相对荧光强度(RFI)。

                  表1

细胞*凋亡处理RFI**活细胞无1凋亡细胞放线菌酮10凋亡细胞PDTC12.3凋亡细胞地塞米松17.9凋亡细胞星形孢菌素19.8凋亡细胞U.V.照射(16h)22.4凋亡后细胞U.V.照射(48h)2.8坏死细胞冰冻7.3坏死细胞煮沸2.4坏死细胞高渗休克5.6

*＝Jurkat细胞；**＝相对荧光强度。

这些结果表明，PTX3具有结合晚期凋亡细胞的能力，PTX3的识别不依赖于触发凋亡所用的启始刺激。此外，PTX3不能结合向凋亡后期演化的细胞。

表1所示结果表明，只有凋亡细胞能够结合生物素化PTX3，这证明了PTX3结合的特异性。

实施例1/2

上述由PTX3结合的凋亡细胞逃脱了不成熟DC的内在化。

本实验使用不成熟DC或者经TNF-α处理后成熟的DC。

作为对照，在存在或不存在PTX3的情况下，确定由不成熟以及成熟DC内在化FITC标记的卵清蛋白或绿色荧光胶乳珠。

                                表2

        内在化绿色荧光凋亡细胞或胶乳珠的DC％    底物       不成熟DC           成熟DC       (TNF-α处理的DC)  无PTX3  有PTX3  无PTX3    有PTX3    凋亡细胞  56±8  21±6  6±5    8±6    胶乳珠  30±9  28±12  11±5    11±2

表2所示结果(3次独立实验的平均)表明，PTX3不影响不成熟DC对惰性底物的吞噬作用。