治疗阿尔茨海默氏病与有关神经变性障碍的τ聚集作用抑制剂萘醌衍生物

摘要

本发明提供了萘醌型化合物，它们能够用于调节与神经变性疾病(例如阿尔茨海默氏病)有关的蛋白质(例如τ蛋白)聚集作用。公开了氧化与还原的萘醌型化合物，例如甲萘醌相关性化合物的结构－功能特征。本发明进一步提供基于这些化合物的、神经变性疾病和/或临床痴呆的治疗或预防方法。

说明书

技术领域

本发明一般涉及与神经变性疾病、例如阿尔茨海默氏病(AD)有关的蛋白质聚集作用和能够调节这类聚集作用的化合物。

背景技术

痴呆症(例如AD)经常是以蛋白质样结构(例如β-淀粉样蛋白斑和神经纤维缠结(NFT))的细胞内和/或细胞外沉积物在患者脑中的进行性蓄积为特征的。这些损伤的出现与病理性神经纤维变性和脑萎缩、以及认知减损密切相关(Mukaetova-Ladinska，E.B.等(2000)Am.J.Pathol.Vol.157，No.2，623-636)。

在AD中，神经炎斑和NFT含有成对的螺旋丝(PHF)，其主要成分是与微管有关的τ蛋白(Wischik等(1988a)PNAS USA 85，4506-4510)。这些斑还含有细胞外β-淀粉样蛋白原纤维，从淀粉样蛋白前体蛋白的异常加工衍化而来(APP；Kang等(1987)Nature 325，733)。Wischik等的文章(Neurobiology of Alzheimer′s Disease′，2nd Edition(2000)Eds.Dawbarn，D.and Allen，S.J.，The Molecular and Cellular Neurobiology Series，BiosScientific Publishers，Oxford)详细讨论了τ蛋白在神经变性性痴呆发病机理中的公认作用。中前皮质中正常τ形式的丧失、病理性PHF的蓄积和突触的丧失都与有关的认知减损相关联。此外，在阿尔茨海默氏病中，突触的丧失和锥体细胞的丧失都与τ反应性神经纤维病变的形态学量度相关联，后者在分子水平上并行于τ蛋白集合几乎全部从可溶形式重新分配为聚合形式(即PHF)。

τ以交替剪接的同种型存在，它们含有三个或四个相当于微管结合性结构域的重复序列副本(Goedert，M.，等(1989)EMBO J.8，393-399；Goedert，M.，等(1989)Neuron 3，519-526)。PHF中的τ被蛋白酶解作用加工成核心结构域(Wischik，C.M.，等(1988b)PNAS.USA 85，4884-4888；Wischik等(1988a)Loccit.)；Novak，M.，等(1993)EMBO J.12，365-370)，它由重复结构域的相位移动版本组成，仅有三个重复结构域参与稳定的τ-τ相互作用(Jakes，R.，等(1991)EMBO J.10，2725-2729)。一旦生成，PHF样τ聚集物充当进一步捕获的种子，为全长τ蛋白的蛋白酶解加工提供模板(Wischik等1996 Proc Natl Acad Sci USA 93，11213-11218)。

在掺入到PHF中的τ的重复结构域中所观察到的相位移动提示了该重复结构域在掺入丝体期间经历所诱发的构象改变。在AD的开始期间，所面临的是这种构象改变可能是由τ与病理性底物的结合而引发的，例如损伤或突变了的膜蛋白(Wischik，C.M.，等(1997)″Microtubule-associatedproteins：modifications in disease″，eds.Avila，J.，Brandt，R.and Kosik，K.S.(Harwood Academic Publishers，Amsterdam)pp.185-241)。

在它们的生成和蓄积过程中，PHF首先在胞质内装配成无定形的聚集物，很可能来自早期的τ寡聚体，它们在PHF装配之前或期间变成截短的(Mena，R.，等(1995)Acta Neuropathol.89，50-56；Mena，R.，等(1996)ActaNeuropathol.91，633-641)。这些丝体然后继续生成经典的细胞内NFT。在这种状态中，PHF由截短的τ核心和含有全长τ的被微毛外衣组成(Wischik.，C.M.，et al，(1996)loc.cit.)。装配过程是指数性的，消耗正常功能性τ的细胞集合体，诱导新的τ合成，以弥补不足(Lai，R.Y. K.，等，(1995)，Neurobiology of Ageing，Vol.16，No.3，433-445)。最终，神经元的功能性减损发展为细胞死亡点，留下细胞外NFT。细胞死亡与细胞外NFT的数量密切相关(Wischik等2000，loc.cit)。由于缠结被挤到细胞外空间，存在神经元被微毛外衣的进行性丧失，和对应的N-末端τ免疫反应性丧失，但是保留与PHF核心有关的τ免疫反应性(Bondareff，W.等，(1994)J.Neuropath.Exper.Neurol.，Vol.53，No.2，158-164)。

显然，鉴别能够调节与疾病有关的蛋白质、例如τ的聚集作用的化合物受到特别关注。

WO 96/30766(F Hoffman-La Roche)公开了用于抑制τ-τ缔合作用的测定法，利用该测定法鉴定了某些抑制剂。其中的图23和24根据它们的抑制性质评价了某些化合物。维生素K(＝K2)具有0.674的分值，甲萘醌(已知也称维生素K3)具有1.042的分值。在评价标准中，分值1代表结合作用等同于没有化合物存在的情况。

当然，维生素K本身是一种熟知的治疗剂。维生素K的简要概述参见″Goodman and Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics″，9thedition，pp 1582-1585，1998。更全面的综述参见William Friedrich，″Vitamins″，pp 285-338，1988；Thorp et al(1995)，Drugs 49，376-387；Vermeerand Schurgers(2000)，Blood Stasis and Thrombosis，14，339-353。还原形式的维生素K充当γ-谷氨酰羧化酶的辅因子。这种酶负责在维生素K依赖性凝血因子(II、VII、IX、X因子与抗凝蛋白、C蛋白和S蛋白)上转化谷氨酸残基为γ-羧基谷氨酸盐。其他含有γ-羧基谷氨酸的蛋白质(所谓的Gla-蛋白)已经见于血浆(Z蛋白)、骨(骨钙蛋白)、肾、肺和睾丸组织。非血液学Gla-蛋白的功能概述于Vermeer and Schurgers(2000，loc cit.)中。不过，在脑中没有发现这类蛋白质(Vermeer(1990)，Biochem J，266，625-636)。

维生素K类似物的传统治疗用途包括成人与新生儿的血凝血酶原过少、脂溶性物质的吸收不充分、和肠吸收障碍综合征，例如囊性纤维变性、口炎性腹泻、克罗恩氏病和小肠结肠炎。

除了上述治疗用途以外，已知维生素K3还具有体外抗肿瘤活性，对抗广泛的啮齿动物和人肿瘤细胞系(Hu等，1996)。这种活性的机理是未知的。已经有人指出，维生素K3对若干第二信使激酶级联具有配合效应(Markovits等，1998；Wu and Sun 1999)，还已经有人明确提出维生素K3与含有肽序列(I/V)HCXXXXXR(S/T)G的激酶/磷酸酶生成共价键，通过抑制Cdc25磷酸酶诱发细胞周期停止和细胞死亡。不过，在τ的重复结构域中没有发现共有序列[HCXXXXXR(S/T)G]。

有一项研究(Nakajima等，1993)检查了维生素K衍生物对所培养的CNS神经元的效果，发现维生素K1和K2在10nM-1μM范围内具有突出的存活促进效果。相反，维生素K3(甲萘醌)仅具有这种存活促进活性的～10％，并且仅在1μM下。无论这种效果的机理如何，它都不依赖于维生素K周期，因为干扰环氧化物还原酶步骤的香豆素抗凝剂对存活促进测定没有影响。利用所培养的人成神经细胞瘤细胞，Ko等(1997)指出甲萘醌在高剂量(200μM)下导致突出的τ蛋白脱磷酸作用，和广泛蛋白质的氧化作用。有趣的是，出于由Wischik等(2000)所详细讨论的原因，预期蛋白质脱磷酸作用可能增强τ蛋白的聚集作用。

最近，Ko等(2000)讨论了α-突触核蛋白在使神经元细胞敏感于由高剂量甲萘醌诱导的氧化性应激中的病原性突变作用。该文中，作者主张由产生氧化性应激的化合物所诱导的硫醇排除是负责遗传性帕金森氏病中突变型α-突触核蛋白毒性的一般机理，这暗示了开发疗法的合理途径将是基于抵消由甲萘醌等物质所产生的氧化剂损伤的。

不过，除了WO 96/30766(F.Hoffman-La Roche)所给出的孤立数据以外，还没有进行过调查研究，以证明和优化萘醌型化合物在抑制与神经变性疾病有关的蛋白质聚集作用中的作用。

发明的公开

本发明人已经研究了能够用于抑制与神经变性疾病有关的蛋白质聚集作用的萘醌型化合物的结构。利用新颖的测定技术，他们已经证明，与WO 96/30766所给出的数据相反，甲萘醌和有关化合物可能是高度有效的抑制剂。关于萘醌型化合物，例如维生素K类化合物的详细结构-功能特征在它们作为蛋白质(例如τ蛋白)聚集作用抑制剂的用途方面已经得到证明。正如本领域技术人员将领会到的是，鉴于本文的公开，这些结果证明了这类化合物尤其在治疗与这类蛋白质聚集作用有关的疾病(例如AD)中的实用性。

更具体而言，本发明人已经确定，可能对效能有利的是，下式结构中的3’位基团、一般为取代基R^2A是不存在的，或者是相对短的(例如在甲萘醌中)，而不是长链基团(例如在维生素K2或K3中)。不仅鉴于WO96/30766，而且鉴于关于这些化合物的早期更一般性的结构功能关系，这一点都是意外的。例如Isler and Wiss(1959)，Vitamins和Hormones，17，5390，p.77指出，维生素K1与K2和它们的类似物的“生物活性”随着3’位侧链的缩短而降低。

本发明的化合物

本发明的各方面是基于维生素K型化合物关于蛋白质聚集作用的神经变性疾病的用途的，它们在3’位具有相对短的基团或者没有基团(如下文所详细定义的)。

如上所述，称为“维生素K”的一类化合物在它们天然存在的形式上相当于血液凝固所需若干因子的正常生物合成所必需的饮食成分。这种活性与至少两种不同的天然存在的物质有关，它们被称为维生素K1(植基甲萘醌或2-甲基-3-植基-1，4-萘醌，存在于叶类植物中的形式)和维生素K2(甲基萘醌)。后者代表一系列化合物(甲基萘醌类)，其中植基甲萘醌的植基侧链被2至13个异戊二烯基单元的侧链构件所代替，并相应地编号。肠细菌和肝能够从合成的脂溶性类似物甲萘醌合成甲基萘醌类(主要为甲基萘醌-4)。甲萘醌具有两种常见的水溶性衍生物，甲萘二酚磷酸钠和甲萘醌硫酸氢钠，它们在给药后转化为甲萘醌。已经研究了其他与甲萘醌有关的化合物的抗肿瘤活性，特别是与拉帕醇(2-羟基-3-(3-甲基-2-丁烯基)-1，4-萘醌)有关的化合物。Rao(1974)综述了3位侧链的结构变体。Seiber等(1976)和Morrison等(1970)提供了关于拉帕醇的一些常用毒理与临床数据。

本发明确切地涉及下式化合物：

其中：

J¹和J²都是＝O；也就是说，标记为α和ε的共价键是双键；β和δ是单键；在R^1B和R^2B都不存在时标记为γ的共价键是双键；或者标记为γ的共价键是单键。

在另一种实施方案中：

J¹是-OR⁷，J²是-OR⁸；也就是说，标记为α和ε的共价键是单键；β和δ是双键；在R^1B和R^2B都不存在时标记为γ的共价键是单键。

本文所述化合物的氧化和还原形式都可以用在本发明中。

因而在确切的实施方案中，这些化合物具有下式：

在一种实施方案中，这些化合物具有下式：

在一种实施方案中，这些化合物具有下式：

各种优选的具体的实施方案如图2所示，维生素K1与K2和某些其他无活性化合物不构成本发明的一部分，包括在内以供对比。

R^2A和R^2B如果存在的话

本发明的化合物是这样的，其中R^2A是相对短的基团(例如对比K1和K2与DH10和K3)。

因而，R^2A可以独立地选自-H、C_1-7烷基(例如包括未取代的C_1-7烷基、取代的C_1-7烷基，例如C_1-7卤代烷基、C_1-7羟基烷基、C_1-7氨基烷基、C_1-7羧基烷基等)、-OH、C_1-7烷氧基、酰氧基、-COOH、酯、-SO₃H、-SO₃M、磺酸酯、C_1-7烷基磺酸酯或“短链烷基”，该术语表示直链或支链烷基，其具有1-15个碳原子，优选1-12个、更优选1-10个、例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子，它可以是饱和的或部分饱和的。

本文所用的术语“C_1-7卤代烷基”是关于其中至少一个氢原子(例如1、2、3个)已经被卤原子(例如F、Cl、Br、I)代替的C_1-7烷基。如果多于一个氢原子已经被卤原子代替，那么卤原子可以独立地是相同的或不同的。每个氢原子都可以被卤原子代替，在这种情况下该基团可以适宜被称为C_1-7全卤代烷基。C_1-7卤代烷基的实例包括但不限于-CF₃、-CHF₂、-CH₂F、-CCl₃、-CBr₃、-CH₂CH₂F、-CH₂CHF₂和-CH₂CF₃。

本文所用的术语“C_1-7羟基烷基”是关于其中至少一个氢原子已经被羟基代替的C_1-7烷基。C_1-7羟基烷基的实例包括但不限于-CH₂OH、-CH₂CH₂OH和-CH(OH)CH₂OH。

本文所用的术语“C_1-7氨基烷基”是关于其中至少一个氢原子已经被氨基代替的C_1-7烷基。C_1-7氨基烷基的实例包括但不限于-CH₂NH₂、-CH₂CH₂NH₂和-CH₂CH₂N(CH₃)₂。

本文所用的术语“C_1-7羧基烷基”是关于其中至少一个氢原子已经被羧基代替的C_1-7烷基。C_1-7羧基烷基的实例包括但不限于-CH₂COOH和-CH₂CH₂COOH。

在一种实施方案中，短链烷基是下列基团之一，其中n是0、1或2：

如果存在的话，R^2B将选自与R^2A相同的基团，并且可以与R^2A相同或不同。不过，优选的化合物中R^2B不存在。

R^1A、R^1B

每个R^1A、R^1B独立地是-H、C_1-7烷基(例如包括未取代的C_1-7烷基、取代的C_1-7烷基，例如C_1-7卤代烷基、C_1-7羟基烷基、C_1-7氨基烷基、C_1-7羧基烷基等)、-OH、C_1-7烷氧基、酰氧基、-COOH、酯、-SO₃H、-SO₃M、磺酸酯、C_1-7烷基磺酸酯或短链烷基。

M表示与-SO₃^-基团上的电荷相反的带电或累积带电阳离子。在一种实施方案中，M表示碱性离子，例如Li⁺、Na⁺、K⁺或Cs⁺，更优选Na⁺或K⁺。

优选的化合物是这样的，其中R^1B不存在，尽管其中它不是不存在的化合物(例如DH3)也显示活性。

优选的化合物是这样的，其中R^1A是烷基，例如甲基(例如对比DH2和DH14，以及DH1、DH7和DH15)。不过，代替甲基的其他小基团、例如磺酸酯基也可以是优选的(对比K3和DH8)。优选地，R^1A基团是供电子基团。

R^1A、R^1B、R^2A、R^2B

在一种实施方案中，每个R^1A、R^1B、R^2A、R^2B独立地是-H；-Me、-Et、-nPr、-iPr、-nBu、-sBu、-iBu、-tBu；-OH；-OMe、-OEt、O(nPr)、-O(iPr)、-O(nBu)、-O(sBu)、-O(iBu)、-O(tBu)；-OC(＝O)Me、-OC(＝O)Et、-OC(＝O)(nPr)、-OC(＝O)(iPr)、-OC(＝O)(nBu)、-OC(＝O)(sBu)、-OC(＝O)(iBu)或-O(C＝O)(tBu)；-C(＝O)OMe、-C(＝O)OEt、-C(＝O)O(nPr)、-C(＝O)O(iPr)、-C(＝O)O(nBu)、-C(＝O)O(sBu)、-C(＝O)O(iBu)、-C(＝O)O(tBu)；-SO₃H、-SO₃M、-SO₃Me、-SO₃Et、-SO₃(nPr)、-SO₃(iPr)、-SO₃(nBu)、-SO₃(sBu)、-SO₃(iBu)、-SO₃(tBu)。

在一种实施方案中，每个R^1A、R^1B、R^2A、R^2B独立地是-H、Me、-Et、-OMe、-OEt、-OH、-OMe、-OEt、-OC(＝O)Me、-OC(＝O)Et、-COOH、-COOMe、-COOEt、-SO₃H、-SO₃M、-SO₃Me、-SO₃Et或-CH₂CH＝C(CH₃)₂。

在一种实施方案中，每个R^1A、R^1B、R^2A、R^2B独立地是-H、Me、-OMe、-OH、-OMe、-OC(＝O)Me、-COOH、-COOMe、-SO₃H、-SO₃M、-SO₃Me或-CH₂CH＝C(CH₃)₂。

在一种实施方案中，R^1A是-Me，R^1B和R^2B不存在：

在一种实施方案中，R^1A和R^1B都是-H，R^2A和R^2B是如上所定义的：

在一种实施方案中，R^2A和R^2B都是-H，R^1A和R^1B是如上所定义的：

在一种实施方案中，R^1B和R^2B都是-H，R^1A和R^2A是如上所定义的：

R³、R⁴、R⁵和R⁶

每个R³、R⁴、R⁵和R⁶独立地是-H、-OH、C_1-7烷基(例如包括未取代的C_1-7烷基、取代的C_1-7烷基，例如C_1-7卤代烷基、C_1-7羟基烷基、C_1-7氨基烷基、C_1-7羧基烷基等)、C_1-7烷氧基或酰氧基。

R³、R⁴、R⁵或R⁶上取代基的存在与否似乎对活性没有重大影响(例如对比K3和DH2)。

在一种实施方案中，每个R³、R⁴、R⁵和R⁶独立地是-H、-OH、C_1-7烷基、C_1-7烷氧基或C_1-7烷基酰氧基。

在一种实施方案中，每个R³、R⁴、R⁵和R⁶独立地是-H；-OH；-Me、-Et、-nPr、-iPr、-nBu、-sBu、-iBu、-tBu；-OMe、-OEt、O(nPr)、-O(iPr)、-O(nBu)、-O(sBu)、-O(iBu)、-O(tBu)；-OC(＝O)Me、-OC(＝O)Et、-OC(＝O)(nPr)、-OC(＝O)(iPr)、-OC(＝O)(nBu)、-OC(＝O)(sBu)、-OC(＝O)(iBu)或-O(C＝O)(tBu)。

在一种实施方案中，每个R³、R⁴、R⁵和R⁶独立地是-H；-OH；-Me、-Et；-OMe、-OEt；-OC(＝O)Me或-OC(＝O)Et。

在一种实施方案中，每个R³、R⁴、R⁵和R⁶独立地是-H；-OH；-Me；-OMe或-OC(＝O)Me。

在一种实施方案中，每个R³、R⁴、R⁵和R⁶独立地是-H或-OH。

在一种实施方案中，每个R⁴、R⁵和R⁶是-H，R³是如上所定义的：

在一种实施方案中，每个R⁴、R⁵和R⁶是-H，R³是-H：

在一种实施方案中，每个R⁴、R⁵和R⁶是-H，R³是-OH：

J¹和J²

正如实施例所证明的，其中J¹和J²都是＝O的化合物或者其中它们分别是-OR⁷和-OR⁸的化合物都可以具有较高的活性(例如对比K3和DH9，以及DH5)。

因而，关于上式IV，每个R⁷和R⁸独立地是-H、C_1-7烷基(例如包括未取代的C_1-7烷基、取代的C_1-7烷基，例如C_1-7卤代烷基、C_1-7羟基烷基、C_1-7氨基烷基、C_1-7羧基烷基等)、酰基(例如包括C_1-7烷基酰基，例如乙酰基)、-SO₃H、-SO₃M或磺酸酯。

本文所用的术语“酰基”是关于基团-C(＝O)R，其中R是酰基取代基，例如C_1-7烷基(也称为C_1-7烷基酰基或C_1-7烷酰基)、C_3-20杂环基(也称为C_3-20杂环酰基)或C_5-20芳基(也称为C_5-20芳基酰基)，优选C_1-7烷基。酰基的实例包括但不限于-C(＝O)CH₃(乙酰基)、-C(＝O)CH₂CH₃(丙酰基)、-C(＝O)C(CH₃)₃(丁酰基)和-C(＝O)Ph(苯甲酰基、苯酮基)。

在一种实施方案中，R⁷和R⁸是相同的。

在一种实施方案中，R⁷和R⁸是不同的。

在一种实施方案中，每个R⁷和R⁸独立地是-H、C_1-7烷基、C_1-7烷基酰基、-SO₃H、-SO₃M或C_1-7烷基磺酸酯。

在一种实施方案中，每个R⁷和R⁸独立地是-H；-Me、-Et、-nPr、-iPr、-nBu、-sBu、-iBu、-tBu；-C(＝O)Me、-C(＝O)Et、-C(＝O)(nPr)、-C(＝O)(iPr)、-C(＝O)(nBu)、-C(＝O)(sBu)、-C(＝O)(iBu)或-(C＝O)(tBu)；-SO₃H、-SO₃M、-SO₃Me、-SO₃Et、-SO₃(nPr)、-SO₃(iPr)、-SO₃(nBu)、-SO₃(sBu)、-SO₃(iBu)或-SO₃(tBu)。

在一种实施方案中，每个R⁷和R⁸独立地是-H；-Me、-Et、-C(＝O)Me、-C(＝O)Et、-SO₃H、-SO₃M、-SO₃Me或-SO₃Et。

在一种实施方案中，每个R⁷和R⁸独立地是-H；-Me、-C(＝O)Me、-SO₃H、-SO₃M或-SO₃Me。

在一种实施方案中，每个R⁷和R⁸是-H：

优选的本发明化合物是这样的，它们在本文所述的测定法中显示较高的活性，特别是下述细胞类测定法I’。优选的化合物的B50小于10，更优选小于5。同样，它们具有较低的毒性，治疗指数大于4，更优选大于10。

除非另有需要，下文所用的术语“维生素K化合物”用于涵盖任何这些化合物，例如(仅仅是例子)甲萘醌、甲萘二酚及其二酯和符合本文所给出的结构式的这些任何的类似物。

本发明的用途

一方面公开了维生素K化合物抑制蛋白质聚集的用途，该聚集作用是与疾病状态有关的。

一般而言，本发明可以适用的蛋白质聚集作用是由所诱发的构象聚合相互作用所引起的，也就是说，蛋白质或其片段的构象改变引起更多蛋白质分子(前体)以自增长的方式进行模板结合和聚集。一旦引发了成核作用，可能继发聚集级联，它牵涉所诱发的更多蛋白质分子的构象聚合作用，引起在聚集物中生成毒性产物片段，它们基本上耐受进一步的蛋白分解作用。所生成的蛋白质聚集物被认为是表现为神经变性、临床性痴呆和其他病理症状的疾病状态的最接近的原因。

涉及τ蛋白的用途

优选的发明实施方案是基于τ蛋白聚集的抑制作用的。本文所用的术语“τ蛋白”一般表示τ蛋白家族的任何蛋白质。τ蛋白是众多蛋白质家族中的一种，在反复的装配与解装配周期期间与微管一起被共同纯化(Shelanski等(1973)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，70.，765-768)，也称为微管相关蛋白(MAP)。τ家族的成员共有的共同特征是具有特征性的N-末端节段、插入在N-末端节段中的大约50个氨基酸的序列(它们在脑中受发育性调节)、特征性串连重复区(由3或4个31-32个氨基酸的串连重复序列组成)和C-末端尾。

MAP2是体-树腔内的主要微管相关蛋白(Matus，A.，″Microtubules″[Hyamsand Lloyd，eds.]pp 155-166，John Wiley and Sons，NY)。MAP2同种型在串连重复区中几乎等同于τ蛋白，但是在N-末端结构域的序列和程度上都有实质性区别(Kindler and Garner(1994)Mol.Brain Res.26，218-224)。尽管如此，串连重复区的聚集作用就τ重复结构域而言不是选择性的。因而将被领会到的是，本文涉及τ蛋白或τ-τ聚集作用的任何讨论都应当被视为也涉及τ-MAP2聚集作用、MAP2-MAP2聚集作用等。

其他蛋白质

图4显示一张表格，列举了各种其他与疾病有关的聚集蛋白质，对它们的抑制作用构成本发明的一部分。在每种情况下，还列举了其中聚集作用的引发和/或蛋白质的突变可能起作用的疾病。

从表中可以看到，以病理性蛋白质聚集为特征的疾病实例包括运动神经元疾病和雷维小体病。此外，神经变性障碍、例如皮克氏病和进行性核上性麻痹的发病机理似乎分别与病理性τ聚集物在新皮质的齿状回和星形锥体细胞中的蓄积相关联(Wischik等2000，loc.cit)。本发明可以适用的其他τ病变包括家族性多系统τ病、皮质基底变性和家族性格-施-沙病。

因而，按照上述讨论，将被领会到的是(另有要求除外)尽管关于τ蛋白或τ样蛋白质(例如MAP2)描述了本发明的实施方案，不过这些说明应当被视为等价适用于上面所讨论的其他蛋白质(例如淀粉样蛋白、突触核蛋白、朊病毒等)，或者其他蛋白质，它们可以凭借就聚集作用的增长而言关键性的结构域中的构象改变而引发或经历相似的病理性聚集作用，或者它们赋予所生成的聚集物以蛋白分解稳定性(Wischik等″Neurobiology ofAlzheimer′s Disease″，2nd Edition(2000)Eds.Dawbarn，D.and Allen，S.J.，The Molecular and Cellular Neurobiology Series，Bios-Scientific Publishers，Oxford)。所有这类蛋白质在本文中都可以被称为“聚集的疾病蛋白质”。这些疾病在本文中可以被称为“蛋白质聚集疾病”。

同样，在本文提到“τ-τ聚集作用”等时，这也可以被视为适用于其他蛋白质的其他聚集作用，它们在这方面具有相似的性质，例如β-淀粉样蛋白聚集作用、朊病毒聚集作用和突触核蛋白聚集作用等。同样，“τ蛋白酶解降解作用”等也是如此。

其他用途和方法

如上所述，在一方面公开了维生素K化合物抑制蛋白质聚集的用途，该聚集作用与上述疾病状态有关。

进一步的实施方案是上述蛋白聚集疾病的治疗或预防方法，该方法包括对受治疗者给药维生素K化合物或包含它的治疗组合物，以便抑制与所述疾病状态有关的蛋白质聚集作用。

在进一步的实施方案中，公开了用在上述蛋白聚集疾病的治疗或预防方法中的维生素K化合物或包含它的治疗组合物，该方法包含对受治疗者给药维生素K化合物或组合物，以便抑制与所述疾病状态有关的蛋白质聚集作用。

在进一步的实施方案中，公开了维生素K化合物在药物制备中的用途，该药物用在上述蛋白聚集疾病的治疗或预防方法中，该方法包含对受治疗者给药该药物，以便抑制与所述疾病状态有关的蛋白质聚集作用。

在一种实施方案中，公开了调节哺乳动物脑中蛋白质聚集作用的方法，该聚集作用与上述疾病状态有关，该方法包含对需要所述处置的所述哺乳动物给药预防或治疗有效量的所述聚集作用抑制剂，其中该抑制剂是维生素K化合物。

在本发明的另一种实施方案中，提供了抑制哺乳动物脑中蛋白质聚集物(例如PHF的形式，可选地在NFT中)产生的方法，该处置是如上所述的。

维生素K化合物可以被单独给药，或者可以与其他治疗联用，同时或者先后，这依赖于所要治疗的病症或疾病。确切而言，可能需要将维生素K化合物与其他有关蛋白聚集反应抑制剂一起使用或配制，例如在τ的情况下，它们可以是WO 96/30766或在先提交的未公布的申请GB 0101049.5所述的化合物，其内容引用在此作为参考。

其他可以与本发明联用的例如用于治疗AD的治疗剂包括胆碱酯酶抑制剂(例如多奈佩齐)、毒蕈碱受体激动剂和β-淀粉样蛋白抑制剂。

本发明的进一方面提供包含维生素K化合物加一种其他化合物的治疗剂组合物。

治疗剂的剂量

本发明所述化合物、组合物或药物的给药优选地采用“预防有效量”或“治疗有效量”(视情况而定，尽管预防也可以被视为治疗)，这足以对个体显示有益效果。所给药的实际剂量和给药的速率与时间-过程将依赖于所治疗的疾病的性质和严重性。

治疗的处方、例如关于剂量的决定等，属于一般从业人员和其他医生的职责范围，通常要考虑所要治疗的疾病、个体患者的状况、释放药物的部位、给药的方法和从业人员已知的其他因素。

通常，哺乳动物是人，尽管在其他动物中的用途(例如对于试验目的，或者兽医治疗目的)也为本发明所涵盖。

维生素K建议每日限量在约10-20μg/天(婴儿)、15-60μg/天(儿童和11岁以下少年)和50-140μg/天(11岁以上儿童和成人)之间不等(美国RDAs，1980)。其他报道推荐0.01-0.03mg/kg体重(Friedrich，1988，loc cit，讨论页319-320)。维生素K型化合物、例如用在本发明中的那些在对70kg成人给药时，可以采用大于或等于约10mg/天或以上的量(根据BritishNational Formulary的数据，由BMA和Royal Pharmaceutical Society of GreatBritain发布)。

治疗剂的配制和给药

在进一步试验毒性之后，适合的化合物、例如具有上式的那些或它们的药学上可接受的盐可以制成本发明的组合物。

除了上述组分以外，组合物还可以包括药学上可接受的赋形剂、防腐剂、增溶剂、增加粘度的物质、稳定剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、矫味剂、改变渗透压的盐、缓冲剂或包衣剂。这类材料应当是无毒的，并且不应干扰活性成分的功效。载体或其他材料的精确性质可以依赖于给药的途径。技术和方案的实例可以参见″Remington′s PharmaceuticalSciences″，16th edition，Osol，A.(ed.)，1980。Daabis & Khawas(1969Pharmazie 24，750)和Fattah and Daabis(1977 Pharmazie 32H.4，232)讨论了影响甲萘醌(维生素K3)有关稳定性的化合物。

在将组合物配制成药物组合物时，它的给药可以按肠内方式例如口服进行，剂型为粉剂、片剂、包衣片剂、锭剂、硬与软胶囊剂、溶液剂、乳剂或混悬剂；鼻用剂型(例如鼻用喷雾剂)；或直肠用剂型(例如栓剂)。不过，给药也可以按肠胃外方式进行，例如肌内、静脉内、经皮、皮下或腹膜内，剂型例如注射液。

因而例如，当药物组合物是片剂的形式时，它可以包括固体载体，例如明胶，或助剂。关于片剂、包衣片剂、锭剂和硬胶囊剂的制造，可以将活性化合物和它们的药学上可接受的酸加成盐与药学惰性的无机或有机赋形剂一起加工。可以使用乳糖、玉米、淀粉或其衍生物、滑石、硬脂酸或其盐等，例如作为片剂、锭剂和硬胶囊剂的赋形剂。适合于软胶囊剂的赋形剂例如有植物油、蜡、脂肪、半固体与液体多元醇等。当组合物是液体药物制剂的形式时，它一般将包括液体载体，例如水、石油、动物与植物油、矿物油或合成油。还可以包括生理盐水溶液、葡萄糖或其他糖的溶液，或二醇类，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。其他适合于制造溶液剂和糖浆剂的赋形剂例如有水、多元醇、蔗糖、转化糖、葡萄糖、海藻糖等。适合于注射液的赋形剂例如有水、醇、多元醇、甘油、植物油等。关于静脉内、经皮或皮下注射，或者导管内输注入脑中，活性成分将是肠胃外可接受的水溶液的形式，它是无热原的，并且具有适合的pH、等渗性和稳定性。有关技术人员完全能够制备适合的溶液，例如使用等渗的载体，例如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸化林格氏注射液。根据需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂和/或其他添加剂。

维生素K1和维生素K3的口服与肠胃外制剂是商业上可得到的(尽管不是用于本文所公开的用途)。

由于本领域技术人员可能需要补充本文的公开内容，本文所作的任何交叉参考的公开内容都具体结合在此。

现在将参照下列非限制性附图和实施例进一步描述本发明。有鉴于此，本领域技术人员将知晓本发明的其他实施方案。

附图

图1表示在维生素K2的存在下的体外τ-微管蛋白结合。

图2a表示维生素K1-K3和2，3-二甲基-1，4-萘醌(DH10)的结构。

图2b表示两种5-羟基-1，4-萘醌衍生物(DH14和DH2)。包括另一种化合物(DH16)供对比。

图2c表示三种化合物(DH15，DH7和DH1)中2’位羟基存在的作用。

图2d表示化合物(DH8，DH3)中2’位硫酸酯基和亚硫酸氢酯基的存在的作用。还表示了本发明的烷氧基衍生物(DH17)，还包括另一种化合物(DH19，包括卤化物)供对比。

图2e表示检查了两种1，4-二氢萘醌(naphthoquinol)化合物(化合物DH4，DH5)。

图2f表示乙酸酯和硫酸酯取代的作用(化合物DH9，DH11，DH13)。

图2g表示烷氧基和甲基取代的作用(化合物DH18)，还包括另一种化合物(DH20，包括卤化物)供对比。

图3a和3b表示对τ-τ聚集的抑制作用，利用细胞类测定法II。

图4表示一张表格，列举了可以用在本发明中的各种其他与疾病有关的聚集蛋白质。

图5是WO 96/30766体外聚集作用测定法的示意图，其中测量了两种截短单元的结合。先将终止于Ala-390的种类(″a″)涂在ELISA平板上(碳酸钠缓冲液：50mM，pH9.6)。再将终止于Glu-391的第二种截短τ(″e″)在各种缓冲条件下培育。只有″e″种被mAb 423识别，因此mAb 423免疫反应性仅测量在第二培育期间所结合的τ。

图6a是作为细胞类测定法I(‘T40/12kD’)基础的过程示意图。它表示全长τ的诱导作用如何能够引起它向12kD片段的转化，其条件是在细胞中预先存在一些12kDτ。图6b-e是使用DH15(阴性结果)、维生素K3、DH9和DH17进行测定所得结果的实例。

图7是细胞类测定法II(‘SSK40/25kD’)示意图。

实施例

方法

体外测定法

该方法在WO 96/30766中有详细描述。简而言之，已被吸附到固相底物上的相当于核心重复结构域的τ片段能够捕获可溶性全长τ，并且以较高亲合性与τ结合。这种缔合作用赋予所聚集的τ分子以对抗蛋白酶解消化作用的稳定性。该过程是自我增长的，能够被原型药物试剂所选择性阻滞(Wischik，C.M.，等(1996)，loc.cit)。

该测定法如图5所示。

细胞类测定法I(‘T40/12kD’)

本质上，在诱导性启动子的控制和PHF-核心τ片段(12kD片段)的低构成水平下，成纤维细胞(3T6)表达全长τ(″T40″)。当T40表达被诱导时，它在细胞内经历聚集作用依赖性截短，N-末端在～αα295，C-末端在～αα390，由此产生更高水平的12kD PHF-核心结构域片段。12kD片段的产生能够以剂量依赖性方式被τ-聚集作用抑制剂所阻滞。事实上，化合物关于细胞内蛋白分解生成12kD片段的抑制活性的量化能够借助与描述体外τ-τ结合抑制作用相同的参数加以完整描述。也就是说，细胞内蛋白分解生成12kD片段的程度是借助通过重复结构域的τ-τ结合程度加以完整测定的。细胞内有关蛋白酶的可利用性是没有限制的。

该过程如图6a所示，实例结果如图6b-6d所示。该过程在在先提交的未公布的申请GB 0101049.5中有详细描述。

用在细胞类测定法I中的参数

所观测的关于12kD谱带产生的细胞数据可以与描述体外τ-τ结合抑制作用的标准函数匹配良好(也就是观测值对预测值的相关系数＞0.9)。为了达到这种匹配，需要进行两项假设，它们与其他细胞类与体外研究的结果是一致的：1)细胞内τ浓度为大约500nM；2)τ-τ结合亲合性为22nM。

在进行这些假设时，函数：

           活性＝[τ]([τ]+Kd*(1+[抑制剂]/KI))

可以借助标准数值方法求解，得到表观KI值。对比关于在500nMτ浓度下体外τ-τ结合所观测的值，其中已知关于τ-τ结合的Kd值为22nM，这确认了细胞内PHF的蛋白水解稳定性核心τ单元产生的唯一决定因素仅仅是τ-τ结合的程度。

关于本文所例证的化合物，还已经确立了另一参数B50。B50值是所测定的用在细胞测定法中的供试化合物浓度，在该浓度下来自全长τ的12kD谱带的相对产生率减少至在没有化合物存在下所观测的水平的50％。这提供了实现相应体内活性所需的组织浓度的指征。一般而言，在表观KI值与B50值之间存在近似线性的关系，这可以用于推导KI值：

             B50(μM)＝0.0217×KI(nM)

细胞类测定法II(‘ssK40/25kD’)

该过程在在先提交的未公布的申请GB 0100119.7中有详细描述。正如其中所证明的，膜定向性τ(ssτ190-441，“ssK40”)的组成型表达导致两种特异性裂解产物的产生：次要的30kD片段(″K30″)，其中该片段在残基-390被C-末端截短，和主要的25kD片段(″K25″)，其中该片段在残基-295被N-末端截短。这些裂解位点相当于已知的PHF核心结构域边界，说明它们在细胞内的生成依赖于通过重复结构域的反向平行相位移动排列的PHF样τ聚集作用。

这如图7所示。当全长τ(T40)在组成上表达膜定向性ssK40片段的细胞中诱导性启动子的控制下被活化时，T40被蛋白水解性地加工，得到K40片段(N-末端截短于～αα185)、K30片段(C-末端截短于～αα390)和K25片段(N-末端截短于～αα295)。

实施例1-体外τ-τ和τ-微管蛋白结合

已发现维生素K2在体外τ-τ结合测定中具有一定的活性。关于小于100μM的浓度，体外表观KI值为942nM。不过，维生素K2体外在高达500μM的浓度下不抑制τ-微管蛋白结合(也就是在测定条件中关于τ的摩尔比为2500∶1)，见图1。

进一步的数据(没有显示)证明，DH3(图2d)导致抑制作用的浓度大于或等于50μM(τ浓度为100nM)。不过，甲萘醌(图2a)在该体外测定中没有显示活性，这可能是由于它的溶解度低。

在这种基础上，利用细胞类测定法进行了进一步的结构-活性特征测定，使用不同溶解度的化合物更容易进行。

实施例2-利用细胞类测定法I的τ-τ抑制作用

图2a表示维生素K1-K3和2，3-二甲基-1，4-萘醌(DH10)的结构，后者与K3(2-甲基-1，4-萘醌(二氢萘醌(menadiol))密切相关。

利用T40/12kD细胞测定法从细胞数据计算表观KI和B50，列举对应的数值，以测定τ-τ结合的抑制程度，如上所述。

对比结构与细胞中的抑制活性，显然3’-位侧链越长，活性越低。

图2b表示两种5-羟基-1，4-萘醌衍生物。对比DH14和DH2，提示了3’-位甲基可能是增强活性所优选的，5’-位羟基不是有害的。DH2被证实是所有供试化合物中毒性最高的，其细胞LD50值为2.1μM。DH16化合物没有显示任何活性。

图2c表示三种化合物中2’-位存在羟基的作用。从DH15和DH17可以看到，2’-位羟基似乎对活性有害。不过，在3-异戊二烯基衍生物(DH1)中也观察到微弱活性。

图2d表示2’-位存在磺酸酯基的作用。可以看到，磺酸酯基能够存在于这个位置，而活性没有实质性丧失。不过，亚硫酸氢盐(广泛用作动物饲料添加剂的K3形式)降低了活性。甲氧基衍生物(DH17)显示良好的活性，对比图2a中的维生素K3可以预计到这一点。化合物DH19显示没有作为聚集作用抑制剂的活性，甚至似乎它可能是一种前聚集剂(结果没有显示)。这提示了具有DH19的烯醇化性质的化合物可能是不可取的。

图2e表示在检查两种1，4-二萘醌时所得结果。二腈是完全无活性的，萘甲酸型在初步实验中具有活性。萘甲酸普遍存在于蔬菜中，是叶类蔬菜和细菌中高级萘醌合成的天然前体。

图2f表示1和4位乙酸酯和硫酸酯取代的作用。从这一系列可以看到，2-甲基双乙酸酯(DH9)是非常活性的，而2，3-二甲基双乙酸酯(DH11)降低了活性，如同对应的萘醌。2-甲基硫酸氢酯的活性居中。

图2g表示与图2a中DH10有关的化合物，但是其中甲基已被甲氧基代替(DH18)。它仍然具有活性(参照DH17和K3)。化合物DH20显示没有作为聚集作用抑制剂的活性，甚至似乎它可能是一种前聚集剂(结果没有显示)。

实施例3-利用细胞类测定法II的τ-τ抑制作用

为了确认利用细胞类测定法I所得到的结果，利用细胞类测定法II进行进一步实验。

图3a和3b表示在这种系统中，使用浓度1-2μM的维生素K3(甲萘醌)能够阻滞这种蛋白酶解加工。图3a表示T40向K25的转化减少至没有K3所见到的水平大约1/4，图3b显示K40向K25的转化减少至没有K3所见到的水平大约1/2。由此可以推断，T40向K40的转化也减少至没有K3所见到的水平大约1/2。

实施例4-利用细胞类测定法I的毒性

在用于评估活性的T40/12kD细胞测定法中评估上述化合物的毒性。在剩余细胞的溶解之后，按照厂商的指导，利用乳酸脱氢酶测定试剂盒TOX-7(Sigma Biosciences)，在暴露于化合物24小时后，借助细胞数量测量毒性。作为替代选择，利用来自Promega UK(CytoTox 96)的试剂盒，仍然按照厂商的指导。

该分析得出两项重要结论：

1、在该测定中，在作为τ-τ聚集作用抑制剂的化合物的活性与它们的毒性之间没有关联；

2、考虑迄今所测试的化合物，若干化合物具有相似的KI值，为约120nM，相当于2.6μM的B50细胞活性水平。不过，它们在相对活性上的确不同，以LD50值表示。本组中优选用于临床的化合物可以是具有最高LD50值者。已经如下计算了在细胞测定中使用的每种化合物的治疗指数(RxIndx)：

RxIndx＝LD50/B50

上述某些化合物可以按顺序排列为：

化合物    KI(nM)    B50(μM)    r^*      LD50(μM)    RxIndx

K3        128       2.78        0.925    44.92        16.17

DH10      221       4.80        0.935    66.71        13.91

DH5       118       2.56        0.776    34.29        13.39

DH1       513       11.13       0.864    100.97       9.07

DH8       157       3.41        0.964    18.55        5.45

DH13      263       5.71        0.956    30.90        5.41

DH9       127       2.76        0.988    13.09        4.75

DH3       630       13.68       0.944    63.36        4.63

DH11      674       14.63       0.950    12.13        0.83

^*是函数与数据匹配的良好程度。

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