利用植物细胞分泌性生产具有人型糖链的糖蛋白的方法

摘要

分泌性生产具有人型糖链的糖蛋白的方法，其包括以下步骤：引入能够进行将半乳糖残基转移至非还原性末端乙酰葡糖胺残基的转移反应的酶基因和异源糖蛋白基因，从而获得转化的植物细胞；培养植物细胞；和回收植物细胞的培养基。

说明书

                    技术领域

本发明涉及用植物细胞分泌性生产具有人型糖链的异源糖蛋白的方法、能够分泌该糖蛋白的植物细胞和由该植物细胞所分泌的具有人型糖链的糖蛋白。

                    背景技术

正在进行用植物培养细胞产生外源蛋白质。例如，正尝试用烟草培养细胞产生对人有用的下列蛋白质：

GM-CSF(见E.A.James，C.Wang，Z.Wang，R.Reeves，J.H.Shin，N.S.Magnuson和J.M.Lee，由遗传修饰植物细胞所分泌的具有生物活性的人GM-CSF的产生和表征(Production andCharacterization of Biologically Active Human GM-CSFSecreted by Genetically Modified Plant Cells)，Protein Expr.Purif.，19，131-138(2000))、IL-2和IL-4(见N.S.Magnuson，P.M.Linzmaier，R.Reeves，G.An，K.HayGlass和J.M.Lee，从悬浮培养物内的遗传修饰烟草细胞中分泌具有生物活性的人白细胞介素-2和白细胞介素-4(Secretion of Biologically ActiveHuman Interleukin-2 and Interleukin-4 from GeneticallyModified Tobacco Cells in Suspension Culture)，Protein Expr.Purif.，13，45-52(1998))、免疫球蛋白(见N.S.Magnuson，P.M.Linzmaier，J.W.Gao，R.Reeves，G.An和J.M.Lee，从遗传修饰烟草细胞的悬浮培养物中提高回收分泌的哺乳动物蛋白质(Enhanced Recovery of a Secreted Mammalian Protein fromSuspension Culture of Genetically Modified Tobacco Cells)，Protein Expr.Purif.，7，220-228(1996))、促红细胞生成素(见S.Matsumoto，A.Ishii，K.Ikura，M.Ueda和R.Sasaki，培养烟草细胞中人促红细胞生成素的表达(Expression of HumanErythropoietin in Cultured Tobacco Cells)，Biosci.Biotechnol.Biochem.，57，1249-1252(1993))和α1-抗胰蛋白酶(见M.Terashima，Y.Murai，M.Kawamura，S.Nakanishi，T.Stoltz，L.Chen，W.Drohan，R.L.Rodriguez和S.Katoh，通过植物细胞培养产生功能性人α1-抗胰蛋白酶(Production ofFunctional Human α1-Antitrypsin by Plant Cell Culture)，Appl.Microbiol.Biotechnol.，52，516-523(1999))。

另一方面，报道了植物培养细胞可分泌许多蛋白质或糖蛋白(见A.Sturm，在两种分泌型胡萝卜糖蛋白的特异糖基化位点上复合N-连接寡糖的异质性(Heterogeneity of the Complex N-LinkedOligosaccharides at Specific Glycosylation Sites of TwoSecreted Carrot Glycoproteins)，Eur.J.Biochem.，199，169-179(1991)；Y.Okushima，N.Koizumi，T.Kusano和H.Sano，烟草培养BY2细胞的分泌蛋白：病理相关蛋白质新成员的鉴定(Secreted Proteins of Tobacco Cultured BY2 Cells：Identification of A New Member of Pathogenesis-RelatedProteins)，Plant Mol.Biol.，42，479-488(2000)；和Y.Okushima，N.Koizumi，T.Kusano和H.Sano，糖基化和其适当的加工对于烟草BY2细胞中的蛋白质分泌是关键性的(Glycosylationand Its Adequate Processing is Critical for ProteinSecretion in Tobacco BY2 Cells)，J.Plant Physiolo.，154，623-627(1999))。其中，在烟草BY2培养细胞的情况下，纯化了两种类型的过氧化物酶，并克隆了它们的基因(见H.Narita，Y.Asaka，K.Ikura，S.Matsumoto和R.Sasaki，释放入培养烟草细胞的培养基中的阳离子过氧化物酶同工酶的分离、表征和表达(Isolation，Characterization and Expression of CationicPeroxidase Isozymes Released into the Medium of CulturedTobacco Cells)，Eur.J.Biochem.，228，855-862(1995))。还报道了通过向培养基中添加聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，可以增加培养基中分泌的蛋白质浓度(见N.S.Magnuson，P.M.Linzmaier，J.W.Gao，R.Reeves，G.An和J.M.Lee，从遗传修饰烟草细胞的悬浮培养物中提高回收分泌的哺乳动物蛋白质(Enhanced Recoveryof a Secreted Mammalian Protein from Suspension Culture ofGenetically Modified Tobacco Cells)，Protein Expr.Purif.，7，220-228(1996))；以及Y.Okushima等人(见上，(1999))报道了从烟草BY2株系培养细胞中细胞外分泌了许许多多的蛋白质。其中，由于糖蛋白与识别高甘露糖型糖链的凝集素(伴刀豆凝集素A)的反应，可以确定许多糖蛋白的细胞外分泌(见Y.Okushima，见上，(1999))。

对于这些在植物细胞中产生的糖蛋白(尤其是免疫球蛋白、白细胞介素和GM-CSF)，每种糖蛋白本身的信号肽在植物细胞内的分泌机制中也可被识别，并被分泌到培养溶液中(见E.A.James等人，见上；N.S.Magnuson等人，见上，(1998)；N.S.Magnuson等人，见上，(1996))。在任一种这些糖蛋白之中，推测糖链参与了血液中半寿期的确定、对于蛋白酶的敏感性和稳定性。可是，还没有研究在植物细胞中实际产生的并经纯化的重组蛋白质的糖链结构，而只是推测这些蛋白质具有植物型糖链结构。

在糖链结构的分析中，揭示出从烟草植物中产生的分泌型抗体分子sIgA具有植物型糖链(见M.Cabanes-Macheteau，A.C.Fitchette-Laine，C.Loutelier-Bourhis，C.Lange，N.D.Vine，J.K.Ma，P.Lerouge和L.Faye，在转基因烟草植物中表达的小鼠IgG的N-糖基化(N-Glycosylation of a Mouse IgG Expressedin Transgenic Tobacco Plants)，Glycobiology，9，365-372(1999))。此外，在从同样的烟草植物体产生另一种抗体分子的情况下，细胞内产生的抗体蛋白质被蛋白酶分解且不稳定(见L.H.Stevens，G.M.Stoopen，I.J.Elbert，J.W.Molthoff，H.A.Bakker，A.Lommen，D.Bosch和W.Jordi，气候条件和植物发育阶段对于转基因烟草中表达的抗体稳定性的影响(Effect ofClimate Conditions and Plant Developmental Stage on theStability of Antibodies Expressed in Transgenic Tobacco)，Plant Physiol.，124，173-182(2000))。通过使用抗植物型糖链抗体的Western方法，可以确定该抗体上添加有植物型糖链。虽然报道了人或小鼠所产生的抗体分子糖链中存在β1，4连接的半乳糖残基有利于抗体蛋白质的稳定，但是植物细胞所产生的抗体分子不存在这种糖链。正是由于这个原因，认为烟草植物产生的抗体易于被蛋白酶分解。

在用烟草培养细胞产生促红细胞生成素的情况下，在体外检测到了生物活性，但是在体内没有检测到活性(见S.Matsumoto，K.Ikura，M.Ueda和R.Sasaki，培养烟草细胞中产生的人糖蛋白(促红细胞生成素)的表征(Characterization of a HumanGlycoprotein(Erythropoietin)Produced in Cultured TobaccoCells)，Plant Mol.Biol.，27，1163-1172(1995))。出现这种情况的原因是由于促红细胞生成素在其由植物细胞产生时具有非常不同的糖链结构，而促红细胞生成素的糖链被认为很大程度上参与了生物活性。

另一方面，推测植物型糖链可能是包括人在内的哺乳动物的变态反应原。那即是说，植物所特有的糖链结构，如β1，2-木糖和α1，3-岩藻糖，它们未见存在于哺乳动物糖蛋白中，据报道它们可作为变态反应原(见K.Fotisch，F.Altmann，D.Haustein和S.Vieths，涉及碳水化合物表位的芹菜过敏患者的IgE响应(Involvement ofCarbohydrate Epitopes in the IgE Response of Celery-Allergic Patients)，Int.Arch.Allergy Immunol.，120，30-42(1999)；I.B.Wilson，J.E.Harthill，N.P.Mullin，D.A.Ashford和F.Altmann，核心α1，3-岩藻糖为被抗植物N-连接寡糖抗体所识别的表位的关键部位并存在于各种各样的植物提取物中(Core α1，3-Fucose is a Key Part of the Epitope Recognizedby Antibodies Reacting Against Plant N-LinkedOligosaccharides and is Present in a wide Variety of PlantExtracts)，Glycobiology，8，651-661(1998)；和R.van Ree，M.Cabanes-Macheteau，J.Akkerdaas，J.P.Milazzo，C.Loutelier-Bourhis，C.Rayon，M.Villalba，S.Koppelman，R.Aalberse，R.Rodriguez，L.Faye和P.Lerouge，β(1，2)-木糖和α(1，3)-岩藻糖残基在IgE与植物糖变态反应原的结合中起着巨大的作用(β(1，2)-Xylose and α(1，3)-Fucose Residues Have aStrong Contribution in IgE Binding to Plant Glycoallergens)，J.Biol.Chem.，275(15)，11451-11458(April 14，2000))。因此，用于医学用途的蛋白质必须具有无β1，2-木糖或α1，3-岩藻糖的糖链结构。

                    发明内容

本发明的目的为解决传统技术中存在的上述问题，并提供在植物细胞中分泌性生产稳定的、保持其原始生理活性、且不为变态反应原的糖蛋白的方法、能够分泌这种糖蛋白的植物细胞和由该植物细胞所分泌的具有人型糖链的糖蛋白。

作为广泛研究的结果，本发明者发现，当在烟草培养细胞BY2株系中表达人源半乳糖转移酶基因cDNA时，半乳糖被添加到大多数分泌至外部培养基的糖蛋白的糖链上，并且这些糖蛋白具有无β1，2-木糖或α1，3-岩藻糖的糖链结构。本发明正是基于该发现而实现的。因此，当用这种遗传重组体烟草培养细胞产生人源的有用蛋白质时，能够将具有非变态反应原的糖结构的目标蛋白质分泌到细胞外流体中。

本发明涉及分泌性生产具有人型糖链的糖蛋白的方法。该方法包括以下步骤：向植物细胞中引入能够进行将半乳糖残基转移至非还原性末端乙酰葡糖胺残基的转移反应的酶基因，和引入异源糖蛋白基因，从而获得转化的植物细胞；培养获得的植物细胞。

在上述方法中，具有人型糖链的糖蛋白可以含有核心糖链和外部糖链，核心糖链可以基本上含有较大多数的甘露糖和乙酰葡糖胺，外部糖链可以具有含有非还原性末端半乳糖的末端糖链部分。

在上述方法中，外部糖链可以具有线性或分枝的结构。

在上述方法中，分枝的糖链部分可以为单支化(mono-structure)、二支化(bi-structure)、三支化(tri-structure)或四支化(tetra-structure)结构。

在上述方法中，糖蛋白可以无岩藻糖或木糖。

上述用于分泌性生产的方法可以优选地进一步包括回收植物细胞培养基的步骤。

在一个实施例中，上述用于分泌性生产的方法可以进一步包括体外添加糖或糖链的步骤。

一方面，本发明涉及具有糖链添加机制而能够分泌包含通过由糖链添加机制所添加的糖链的蛋白质的植物细胞，该糖链添加机制能够进行将半乳糖残基转移至非还原性末端乙酰葡糖胺残基的转移反应，其中糖链添加机制添加含有核心糖链和外部糖链的糖链，核心糖链基本上含有较大多数的甘露糖和乙酰葡糖胺，外部糖链具有含有非还原性末端半乳糖的末端糖链部分。

本发明进一步涉及通过上述方法所获得的具有人型糖链的糖蛋白。

本发明更进一步涉及分泌性生产具有人型糖链的糖蛋白的方法，其包括以下步骤：引入能够进行将半乳糖残基转移至非还原性末端乙酰葡糖胺残基的转移反应的酶基因，和异源糖蛋白基因，从而获得转化的植物细胞；在细胞内细胞器中表达该酶。

本发明更进一步涉及用酶基因转化的植物细胞，该酶能够进行将半乳糖残基转移至非还原性末端乙酰葡糖胺残基的转移反应，其中该酶定位于植物细胞中，因此植物细胞能够合成具有人型糖链结构的糖蛋白。

一方面，在上述的植物细胞中，糖链结构包含添加的半乳糖残基。

一方面，在上述的植物细胞中，糖链结构无β1，2-木糖或α1，3-岩藻糖。

一方面，在上述的植物细胞中，糖链结构包含添加至(N-乙酰葡糖胺)_1-2(甘露糖)_2-5(N-乙酰葡糖胺)₂(选自GlcNAc₁Man₃GlcNAc₂、GlcNAc₁Man₅GlcNAc₂、GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂和GlcNAc₁Man₄GlcNAc₂)的N连接型糖链上的半乳糖残基。

一方面，在上述的植物细胞中，酶定位于植物细胞中的细胞内细胞器内。

本发明更进一步涉及从上述植物细胞中再生出的植物。

本发明更进一步涉及从上述植物产生的种子。

                    附图简述

图1为hGT克隆程序的示意图。

图2为用于表达hGT的载体pGAhGT构建程序的示意图。

图3为转化体烟草培养细胞基因组的Southern分析的照片。图3(A)显示了当用EcoRI与HindIII消化基因组DNA(40μg)并随后进行电泳的结果。左边的数字标明了DNA分子量标记的位置。图3(B)显示了整合入每个转化体中、并含有启动子、hGT和终止子的2.2kb片段的示意图。

图4A为从GT6株系培养基中制备的PA-糖链的高效液相层析分析图。

图4B为从GT6株系培养基中制备的PA-糖链的高效液相层析分析图。

图5为GT6株系培养基中分泌的糖蛋白中糖链的结构和分析结果图。图中圆括号内的数字表明了具有图中显示的各结构的糖链的摩尔比例。

图6为从GT6株系培养基中制备的PA-糖链和其外切糖苷酶消化产物的高效液相层析分析图。

图7为从GT6株系培养基中制备的PA-糖链和其外切糖苷酶消化产物的高效液相层析分析图。

图8为从GT6株系培养基中制备的PA-糖链和其外切糖苷酶消化产物的高效液相层析分析图。

图9为从GT6株系培养基中制备的PA-糖链和其外切糖苷酶消化产物的高效液相层析分析图。

图10为从GT6株系培养基中制备的PA-糖链的IS-MS/MS分析图。B为A的部分放大图。

图11为从GT6株系培养基中制备的PA-糖链和其外切糖苷酶消化产物的高效液相层析分析图。

图12为从GT6株系培养基中制备的PA-糖链和其外切糖苷酶消化产物的高效液相层析分析图。

图13为体外唾液酸转移酶反应结果的照片，该反应用源自GT6株系培养基的糖蛋白、源自BY2株系培养基的糖蛋白或脱唾液酸胎球蛋白作为底物。

图14A为从BY2株系培养基中制备的PA-糖盐的高效液相层析分析图。

图14B为从BY2株系培养基中制备的PA-糖盐的高效液相层析分析图。

图15A为GT6株系培养基中分泌的糖蛋白中糖链的结构和分析结果图。图中圆括号内的数字表明了具有图中显示的各结构的糖链的摩尔比例。

图15B为GT6株系培养基中分泌的糖蛋白中糖链的结构和分析结果图。图中圆括号内的数字表明了具有图中显示的各结构的糖链的摩尔比例。

图16为从BY2株系培养基中制备的PA-糖链的分析图。

图17为从BY2株系培养基中制备的PA-糖链和其外切糖苷酶消化产物的高效液相层析分析图。

图18A为从BY2株系培养基中制备的PA-糖链和其外切糖苷酶消化产物的高效液相层析分析图。

图18B为从BY2株系培养基中制备的PA-糖链和其外切糖苷酶消化产物的高效液相层析分析图。

图19为等电聚焦电泳结果的照片。通过等电聚焦分析用过的培养烟草细胞培养基中的蛋白质，并对于过氧化物酶活性进行染色。野生型表示BY2株系。WT-HRP表示含有HRP的BY2株系转化体。GT-HRP表示含有HRP基因的GT6株系转化体。

图20为用过的转基因培养烟草细胞培养基中的蛋白质凝集素染色结果的照片。通过SDS-PAGE将蛋白质分级分离，并用考马斯亮蓝(A)染色，或者将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，再用ConA(B)与RCA120(C)处理。野生型表示BY2株系。WT-HRP-2表示含有HRP基因的BY2株系的一个转化体。GT-HRP-5表示含有HRP基因的GT6株系的一个转化体。

                 实现本发明的最好方式

下面详细描述了本发明。

在本文中，除非另外说明，可以使用本领域所熟知的蛋白质分离与分析方法和免疫学技术。这些技术可以用商购可得的试剂盒、抗体、标记物质等等来进行。

本发明的方法为生产具有人型糖链的糖蛋白的方法。在本发明中，“人型糖链”表示具有与N-乙酰葡糖胺残基成键的半乳糖残基的糖链。人型糖链中的半乳糖残基可以为糖链的末端，或者唾液酸残基可以进一步地键合到半乳糖残基的外侧。在本发明的具有人型糖链的糖蛋白中，所述糖链含有核心糖链部分、分枝糖链部分和末端糖链部分，木糖和岩藻糖中的至少一种优选地不键合在一个或更多的这些部分之中，更优选地不键合在任何的这些部分之中。最优选地，人型糖链既不含有木糖，也不含有岩藻糖。

植物细胞可以是任何植物细胞。植物细胞可以包括任何形式的培养细胞、培养组织、培养器官和植物体。其中，优选的为培养细胞、培养组织和培养器官，更优选的为培养细胞。可在本发明的生产方法中使用的植物种类可以为任何能够进行遗传转导的植物种类。可在本发明的生产方法中使用的植物种类的例子包括属于茄科(Solanaceae)、禾本科(Gramineae)、十字花科(Cruciferae)、蔷薇科(Rosaceae)、豆科(Leguminosae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、唇形科(Labiatae)、百合科(Liliaceae)、藜科(Chenopodiaceae)和伞形科(Umbelliferae)的植物。

茄科植物的例子包括属于烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、曼陀罗属(Datura)、番茄属(Lycopersion)或碧冬茄属(Petunia)的植物，如烟草、茄子、马铃薯、番茄、红辣椒(red pepper)和矮牵牛。

禾本科植物的例子包括属于稻属(Oryza)、大麦属(Hordenum)、黑麦属(Secale)、Scccharum、稗属(Echinochloa)或玉蜀黍属(Zea)的植物，如稻、大麦、黑麦、稗(barnyard millet)、高粱和玉米。

十字花科植物的例子包括属于萝卜属(Raphanus)、芸苔属(Brassica)、拟南芥属(Arabidopsis)、山萮菜属(Wasabia)或荠属(Capsella)的植物，如萝卜、油菜、瘭疽草(whitlowgrass)、辣根和荠菜。

蔷薇科植物的例子包括属于Orunus、苹果属(Malus)、梨属(Pynus)、草莓属(Fragaria)或蔷薇属(Rosa)的植物，如日本杏、桃、苹果、梨、草莓和蔷薇。

豆科植物的例子包括属于大豆属(Glycine)、豇豆属(Vigna)、菜豆属(Phaseolus)、豌豆属(Pisum)、野豌豆属(Vicia)、落花生属(Arachis)、车轴草属(Trifolium)、Alphalfa或苜蓿属(Medicago)的植物，如大豆、红豆、菜豆、青豆、蚕豆、落花生、三叶草(clover)和苜蓿(bur clover)。

葫芦科植物的例子包括属于丝瓜属(Luffa)、南瓜属(Cucurbita)或香瓜属(Cucumis)的植物，如丝瓜、南瓜、黄瓜和香瓜。

唇形科植物的例子包括属于薰衣草属(Lavandula)、薄荷属(Mentha)或紫苏属(Perilla)的植物，如薰衣草、薄荷和紫苏。

百合科植物的例子包括属于葱属(Allium)、百合属(Lilium)或郁金香属(Tulipa)的植物，如葱、大蒜、百合和郁金香。

藜科植物的例子包括属于菠菜属(Spinacia)的植物，如菠菜。

伞形科植物的例子包括属于当归属(Angelica)、胡萝卜属(Daucus)、鸭儿芹属(Cryptotaenia)或芹属(Apitum)的植物，如白根独活(Angelica polyclada)、胡萝卜、百脉根(trefoil)和芹菜。

在这些用于本发明的产生方法的植物中，优选的为烟草、番茄、马铃薯、稻、玉米、萝卜、大豆、青豆、苜蓿和菠菜，更优选的为烟草、番茄、马铃薯、玉米和大豆。

“能够进行将半乳糖残基转移至非还原性末端乙酰葡糖胺残基的转移反应的酶”是指一种能够将半乳糖残基转移到非还原性末端乙酰葡糖胺残基上的酶，该乙酰葡糖胺残基是在植物细胞内合成糖蛋白的蛋白质部分之后添加糖链时产生的。这种酶的例子包括半乳糖基转移酶、乳糖合成酶和β-半乳糖苷酶。这种酶可以源自任何动物物种，但是优选地源自哺乳动物，更优选地源自人。

这种酶优选地定位于细胞内细胞器中。虽然不想受限于特殊的理论，但是本发明者认为，这种酶存在于细胞内细胞器(如内质网和高尔基体)之中，因此在植物细胞中表达和分泌异源糖蛋白的时候，该酶在添加岩藻糖或木糖残基之前作用于蛋白质或糖链，或者起某种作用以致抑制了岩藻糖或木糖残基的添加。

“能够进行将半乳糖残基转移至非还原性末端乙酰葡糖胺残基的转移反应的酶基因”可以用已知编码该酶的核苷酸序列从任何动物细胞中分离得到，或者可以购买商购可得的酶或将其修饰以适合于植物中的表达之后再使用之。

此处，“基因”表示结构基因部分。为了促进植物中的表达，该基因可以连接调节序列，如启动子、操纵基因和终止子。

“异源糖蛋白”表示原来并不在用于本发明的植物中表达的糖蛋白。异源糖蛋白的例子包括酶、激素、细胞因子、抗体、疫苗、受体和血清蛋白质。酶的例子包括辣根过氧化物酶、激酶、葡糖脑苷脂酶、α-半乳糖苷酶、肌醇六磷酸酶、TPA(组织型血纤溶酶原激活物)和HMG-CoA还原酶。激素和细胞因子的例子包括脑啡肽、干扰素α、GM-CSF、G-CSF、绒毛膜促性腺激素、白细胞介素-2、干扰素β、干扰素γ、促红细胞生成素、血管内皮生长因子、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、黄体生成素(LH)、促甲状腺素(TSH)、促乳素和促卵泡激素。抗体的例子包括IgG、scFv和分泌性IgA。疫苗的例子包括乙型肝炎表面抗原、轮状病毒抗原、大肠杆菌(Escherichia coli)肠毒素、疟疾抗原、狂犬病毒的G蛋白和HIV病毒糖蛋白(例如gp120)。受体和基质蛋白的例子包括EGF受体、纤连蛋白、α1-抗胰蛋白酶和凝血因子VIII。血清蛋白质的例子包括清蛋白、补体系统蛋白质、纤溶酶原、皮质类固醇结合球蛋白、甲状腺素结合球蛋白和蛋白C。

“异源糖蛋白的基因”可以用已知编码目标异源糖蛋白的核苷酸序列从任何细胞中分离得到，或者可以购买商购可得的基因或将其修饰以适合于植物中的表达之后再使用之。

将能够进行将半乳糖残基转移至非还原性末端乙酰葡糖胺残基的转移反应的酶基因和异源糖蛋白基因用本领域熟知的方法引入植物细胞中。这些基因可以分别或同时引入。本领域的技术人员将会意识到方法的选择可取决于确定用于转化的植物的类型。

转化植物细胞的合适方法包括微注射(Crossway等人，BioTechniques 4：320-334(1986))、电穿孔(Riggs等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606(1986))、土壤杆菌介导的转化(Hinchee等人，Biotechnology 6：915-921(1988)；也可见Ishida等人，Nature Biotechnology 14：745-750(June，1996)，对于玉米的转化)、直接的基因转移(Paszkowski等人，EMBO J.3：2717-2722(1984)；Hayashimoto等人，Plant Physiol.93：857-863(1990)(稻))和用可从Agracetus，Inc.，Madison，Wis.和Dupont，Inc.，Wilmington，Del.获得的装置的弹道微粒加速法(ballistic particle acceleration)(见例如Sanford等人，U.S.Pat.No.4,945,050；和McCabe等人，Biotechnology 6：923-926(1988))。也可参阅Weissinger等人，Annual Rev.Genet.22：421-477(1988)；Sanford等人，Particulate Science andTechnology 5：27-37(1987)(洋葱)；Svab等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：8526-8530(1990)(烟草叶绿体)；Christou等人，Plant Physiol.87：671-674(1988)(大豆)；McCabe等人，Bio/Technology 6：923-926(1988)(大豆)；Klein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(1988)(玉米)；Klein等人，Bio/Technology 6：559-563(1988)(玉米)；Klein等人，PlantPhysiol.91：440-444(1988)(玉米)；Fromm等人，Bio/Technology 8：833-839(1990)；和Gordon-Kamm等人，PlantCell 2：603-618(1990)(玉米)；Koziel等人，Biotechnology11：194-200(1993)(玉米)；Shimamoto等人，Nature 338：274-277(1989)(稻)；Christou等人，Biotechnology 9：957-962(1991)(稻)；Datta等人，Biol/Technology 3：736-740(1990)(稻)；欧洲专利申请EP 0 332 581(鸭茅和其他Pooideae植物)；Vasil等人，Biotechnology 11：1553-1558(1993)(小麦)；Weeks等人，Plant Physiol.102：1077-1084(1993)(小麦)；Wan等人，PlantPhysiol.104：37-48(1994)(大麦)；Jahne等人，Theor.Appl.Genet.89：525-533(1994)(大麦)；Umbeck等人，Bio/Technology5：263-266(1987)(棉花)；Casas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：11212-11216(December，1993)(高粱)；Somers等人，Bio/Technology 10：1589-1594(December，1992)(燕麦)；Torbert等人，Plant Cell Reports 14：635-640(1995)(燕麦)；Weeks等人，Plant Physiol.102：1077-1084(1993)(小麦)；Chang等人，WO 94/13822(小麦)；和Nehra等人，The PlantJournal 5：285-297(1994)(小麦)。可以在下列文献中找到通过微粒轰击将重组体DNA分子引入玉米的一套特别优选的实施例：Koziel等人，Biotechnology 11：194-200(1993)；Hill等人，Euphytica85：119-123(1995)；和Koziel等人，Annals of the New YorkAcademy of Sciences 792：164-171(1996)。另一个优选的实施例为在EP 0 292 435中公开的用于玉米的原生质体转化方法。植物的转化可以用单一的DNA种类或多个DNA种类(即共转化)来进行，这些技术都适合于过氧化物酶编码序列的应用。

由其中掺入有上述基因的植物细胞所表达和分泌的基因产物可采用本领域熟知的方法来鉴定。鉴定方法的例子包括银染色、Western印迹法、Northern杂交和酶活性的检测。

可以表达能够进行将半乳糖残基转移至非还原性末端乙酰葡糖胺残基的转移反应的酶并表达异源糖蛋白的转化细胞能够表达和分泌具有人型糖链的异源糖蛋白。换句话说，如此获得的转化植物具有人型糖链添加机制，从而通过培养这种转化细胞，可以在培养基中大量地表达和分泌人型糖蛋白。

这种人型糖蛋白含有核心糖链和外部糖链，核心糖链基本上含有较大多数的甘露糖和乙酰葡糖胺。所获得的糖蛋白的外部糖链含有非还原性末端糖链部分。外部糖链可以具有线性或分枝的结构。分枝的糖链部分可以为单支化、二支化、三支化和四支化结构中的任何一种。由转化细胞产生的糖蛋白优选地不含有岩藻糖或木糖。

所得的转化植物细胞可以维持在培养细胞状态，可以分化成特异的组织或器官，或者可以再生成完整的植物体或从完整的植物体获得的部分(如种子、果实、叶、根、茎或花)。

使用本领域熟知的方法和培养基来培养、分化或再生转化的植物细胞。培养基的例子包括Murashige-Skoog(MS)培养基、GamborgB5(B)培养基、White培养基、和Nitsch & Nitsch(Nitsch)培养基，但本发明不局限于此。这些培养基通常在另外添加了适当量的植物生长调节物质(例如植物激素)等等之后才使用。

这些系统对于不同植物株系的应用依赖于从原生质体再生出那种特殊植物株系的能力。已经描述了用于从原生质体再生出谷类植物的说明性方法(Fujimura等人，Plant Tissue Culture Letters，2：74，1985；Toriyama等人，Theot.Appl.Genet.73：16，1986；Yamada等人，Plant Cell Rep.，4：85，1986；Abdullah等人，Biotechnology，4：1087，1986)。

为了转化不能成功地从原生质体再生的植物株系，可以利用将DNA引入完整的细胞或组织的其他方法。例如，按照描述的方法(Vasil，Biotechnology，6：397，1988)可以实现从未成熟胚胎或外植体中再生谷类植物。

土壤杆菌介导的转移也是用于将基因引入植物细胞的广泛适用的系统，因为通过此方法可以将DNA引入整个植物组织，所以避开了从原生质体再生出完整植物的要求。利用土壤杆菌介导的植物整合载体将DNA引入植物细胞的载体在本领域中是熟知的。见例如上面所描述的方法。

基本上，只要转化的植物细胞生长以及随后表达和分泌所期望的基因产物，即可以使用含有任何合适组成的培养基来分泌性生产具有人型糖链的糖蛋白，这种培养基组成含有对于植物细胞生长所必需的痕量养分，如碳源、氮源、维生素和盐。也可以添加聚乙烯吡咯烷酮、蛋白酶抑制剂等等，从而稳定分泌的异源蛋白质和达到异源蛋白质的有效分泌。

由转化的植物细胞表达和分泌的具有人型糖链的糖蛋白一般可以从植物细胞的培养基中分离得到。从植物细胞的培养基中分离糖蛋白可以用本领域技术人员熟知的方法来进行。例如，糖蛋白可以分别或联合采用下列技术从培养基中纯化而分离得到：如盐析(例如硫酸铵沉淀、磷酸钠沉淀)、溶剂沉淀(例如用丙酮或乙醇的蛋白质分级沉淀)、透析、凝胶过滤、离子交换、柱层析(如反相)、超滤和高效液相层析(HPLC)。

作为另一种选择，本发明的糖蛋白也可以从植物细胞中分离或提取。此外，转化细胞中含有的本发明的糖蛋白可以用作食物。本发明的糖蛋白添加了人型糖链，所以其无抗原性，从而适合施用于包括人在内的动物。

本发明还进一步包括，用能够进行将半乳糖残基转移至非还原性末端乙酰葡糖胺残基的转移反应的酶基因所转化的植物细胞或植物体中，β1，2-木糖转移酶或α1，3-岩藻糖转移酶可能已被失活或抑制活性。

Strasser等人已经从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中分离到了编码β1，2-木糖基转移酶的eDNA(Strasser R，Mucha J，MachL，Altmann F，Wilson IB，Glossl J，Steinkellner H，来自拟南芥的β1，2-木糖基转移酶cDNA的分子克隆和功能表达(Molecularcloning and functional expression of β1，2-xylosyltransferase cDNA from Arabidopsis thaliana)，FEBSLett，(2000)472：105-108)。在数据库(如NIH GenBank)中进行的同源性搜索可以显示相应于一些植物中的一些EST(表达序列标签)克隆和基因组序列的核苷酸序列类似于编码拟南芥β1，2-木糖基转移酶的核苷酸序列。基于这些序列，可以从宿主植物中克隆出编码β1，2-木糖基转移酶的核酸，并将其用于通过抑制β1，2-木糖基转移酶基因的表达来形成具有降低了的木糖基转移酶活性的植物细胞或植物。β1，2-木糖基转移酶基因表达的抑制可以通过反义方法、共抑制方法、RNAi方法或其他等等方法来进行。

作为另一种选择，可以采用化学诱变、用寡核苷酸的定点诱变、标记方法或其他等等方法形成具有降低了的木糖基转移酶活性的植物细胞或植物。在该植物中，引入和表达一个或多个编码半乳糖转移酶的糖基转移酶基因以及编码异源多肽的基因可以产生具有人源化多糖结构的异源多肽或分泌具有人源化多糖结构的异源多肽。

类似地，Wilson等人从拟南芥中分离得到了编码α1，3-岩藻糖基转移酶的cDNA(Wilson IB，Rendic D，Freilinger A，Dumic J，Altmann F，Mucha J，Muller S，Hauser MT，来自拟南芥的编码α1，3-岩藻糖基转移酶同源物的cDNA的克隆和表达(Cloning andExpression of cDNAs encoding α1，3-fucosyltransferasehomologues from Arabidopsis thaliana)，Biochim Biophys Acta(2001)1527：88-96)。Leiter等人从绿豆中分离得到了编码α1，3-岩藻糖基转移酶的cDNA(Leiter，H.，Mucha，J.，Staudacher，E.，Grimm，R.，Glossl，J.，Altmann，F.，来自绿豆的GDP-L-Fuc：Asn连接的GlcNAc α1，3-岩藻糖基转移酶的纯化、cDNA克隆和表达(Purification，cDNA cloning，and expression of GDP-L-Fuc：Asn-linked GlcNAc α1，3-fucosyltransferase from mungbeans)，J.Biol.Chem.(1999)274：21830-21839)。在数据库(如NIH GenBank)中进行的同源性搜索可以显示相应于一些植物中的一些EST(表达序列标签)克隆和基因组序列的核苷酸序列类似于编码拟南芥α1，3-岩藻糖基转移酶的核苷酸序列。基于这些序列，可以从宿主植物中克隆出编码α1，3-岩藻糖基转移酶的核酸，并将其用于通过抑制α1，3-岩藻糖基转移酶基因的表达来形成具有降低了的岩藻糖基转移酶活性的植物细胞或植物。α1，3-岩藻糖基转移酶基因表达的抑制可以通过反义方法、共抑制方法、RNAi方法或其他等等方法来进行。

作为另一种选择，可以采用化学诱变、用寡核苷酸的定点诱变、标记方法或其他等等方法形成具有降低了的岩藻糖基转移酶活性的植物细胞或植物。在该植物中，引入和表达一个或多个编码半乳糖转移酶的糖基转移酶基因以及编码异源多肽的基因可以产生具有人源化多糖结构的异源多肽或分泌具有人源化多糖结构的异源多肽。

                      实施例

本发明通过运用实施例描述于下面。下面的实施例只是为了举例说明本发明，而不是为了限制本发明。

1.人β1-4半乳糖转移酶基因的克隆

已经克隆了β1-4半乳糖转移酶(hGt)(EC2.4.1.38)，并揭示了其一级结构含有400个氨基酸(K.A.Masri等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，157，657-663(1988))。

(1)引物制备和模板DNA

通过参考Masri等人的报道制备出下列引物。

hGT-5Eco：5′-AAAGAATTCGCGATGCCAGGCGCGCGTCCCT-3′(SEQ.IDNO：1)

hGT-2Sal：3′-TCGATCGCAAAACCATGTGCAGCTGATG-5′(SEQ.ID.NO：2)

hGT-7Spe：3′-ACGGGACTCCTCAGGGGCGATGATCATAA-5′(SEQ.ID.NO：3)

hGT6Spe：5′-AAGACTAGTGGGCCCCATGCTGATTGA-3′(SEQ.ID.NO：4)

从Clontech购得的人基因组DNA、人胎盘cDNA和人肾脏cDNA用作模板DNA。

(2)hGT基因cDNA的克隆

使用两种组合(i)模板为人基因组DNA，引物为hGT-5Eco和hGT-7Spe，和(ii)模板为人胎盘cDNA，引物为hGT-2Sal和hGT-6Spe，在下面的条件下进行PCR反应，从而获得含有hGT编码区域的0.4kb和0.8kb的片段。

(PCR反应体系)

向1μl模板DNA、5μl 10×PCR缓冲液、4μl dNTPs(200μM)、引物(10pmol)和0.5μl Tag聚合酶(Takara Shuzo生产)(在Tub聚合酶的情况下为0.2μl)中加入水至50μl。

(PCR反应条件)

第一阶段：

循环数：1；变性(94℃)：5分钟；退火(55℃)：1分钟；延伸(72℃)：2分钟。

第二阶段：

循环数：30；变性(94℃)：1分钟；退火(55℃)：1分钟；延伸(72℃)：2分钟。

第三阶段：

循环数：1；变性(94℃)：1分钟；退火(55℃)：2分钟；延伸(72℃)：5分钟。

将获得的两个片段合并来构建hGT基因cDNA，并将其亚克隆进pBluescriptIISK+(SK)中。pBluescriptIISK+(SK)是从Stratagene购买的。图1显示了含有hGT基因cDNA的质粒的构建过程。SEQ.ID.NO：5显示了获得的hGT基因的碱基序列，SEQ.ID.NO：6显示了推测的氨基酸序列。

获得的序列与上述Masri等人所公开的hGT序列有所不同，其不同点在于下面几点：a)528位的A、562位的C和1047位的A分别变成了G、T和G，但是编码的氨基酸没有改变；b)删除了622至630位的9个碱基；和c)为了连接上述0.4kb和0.8kb的片段，在制备引物时，将405位的G和408位的T分别转换成了A和A。

顺便提一句，在该实验中将具有两个起始密码子(ATG)的hGT基因cDNA设计成翻译从第二个起始密码子(37位)开始。

2.将hGT基因引入烟草培养细胞

(1)hGT据报道可以活性类型在大肠杆菌中表达(见D.Aoki等人，EMBO J.，9，3171(1990)和K.Nakazawa等人，J.Biochem.，113，747(1993))。

为了在烟草培养细胞中表达hGT，按照图2中显示的程序构建用于表达的载体pGAhGT。所用的启动子为花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV 35S启动子)，所用的选择性标记为卡那霉素抗性基因。将pGAhGT通过土壤杆菌引入烟草培养细胞。

采用Bevan等人的三亲株交配方法(见M.Bevan，NucleicAcid Res.，12，8711(1984))来进行土壤杆菌的转化。将具有pGA型质粒(见G.An，Methods Enzymol.153，292(1987))的大肠杆菌DH 5α菌株(suE44，ΔlacU169(ф80lacZΔM15)，hsdR17)(Bethesda Research Laboratories Inc.，Focus 8(2)，9(1986))和具有辅助质粒pRK2013(见M.Bevan，Nucleic AcidRes.，12，8711(1984))的大肠杆菌HB101菌株各自在含有12.5mg/L四环素和50mg/L卡那霉素的2×YT培养基中于37℃培养过夜，并将根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA101菌株(见E.H.Elizabeth，J.Bacteriol.，168，1291(1986))在含有50mg/L卡那霉素和25mg/L氯霉素的2×YT培养基中于28℃培养过两夜。从每个培养基中取1.5ml转移入Eppendorf管中，然后收集细胞并用LB培养基洗涤三次。将获得的每个种类的细胞悬浮在100μl的2×YT培养基中，并将这三种细胞混和，然后将混和物涂在2×YT琼脂培养基上并于28℃培养以便将pGA型质粒从大肠杆菌接合传递至土壤杆菌。2天之后，用接种环刮取遍及2×YT琼脂培养基表面生长的一部分细胞，并将其涂在含有50mg/L卡那霉素、12.5mg/L四环素和25mg/L氯霉素的LB琼脂培养基上。在28℃培养2天之后，挑选出单克隆。

通过G.An(Plant Mol.Bio.Manual，A3，1)描述的方法来进行烟草培养细胞的转化。将土壤杆菌(具有pGA-型质粒的EHA101菌株)在含有12.5mg/L四环素的LB培养基中于28℃培养36小时，将烟草细胞(烟草(Nicotiana tabacum L.)栽培变种金黄烟2)培养4天(从The Institute of Physical and Chemical Research，Riken Gene Bank，Plant Cell Bank购得，细胞名为BY-2，商品目录号为No.RPC1)，然后将土壤杆菌悬浮液和烟草培养细胞悬浮液分别以100μl和4ml的量放入培养皿中，随后完全地混和并于25℃静置在暗处。2天之后，将培养皿中的培养基转移至离心管中，并通过离心分离(1,000rpm，5分钟)除去上清液。接着加入新鲜培养基，并在离心分离之后将细胞涂在含有150-200mg/L卡那霉素和250mg/L羧苄青霉素的经修改的LS琼脂培养基平板上，然后将其于25℃静置在暗处。在经过大约2-3星期之后，将愈伤组织细胞植入新的平板上，并挑选出生长起来的克隆。再经过2-3星期之后，将克隆转移到30ml添加了卡那霉素和羧苄青霉素的经修改的LS培养基中，并进行传代培养。培养大约1个月，然后再次进行选择。从获得的一些抗性株系中随机挑选出6个抗性株系(GT1、4、5、6、8和9)。

(2)引入的hGT基因的鉴定

用Southern分析来分析获得的抗性株系，证实了位于T-DNA中的含有CaMV35S启动子-hGT基因cDNA-NOS终止子的2.2kb片段整合入了烟草培养细胞的基因组DNA中。从上面获得的每个抗性株系中制备得到基因组DNA，然后用EcoRI、HindIII消化和用Southern分析进行分析。

根据Watabe方法(见K.Watabe，克隆至序列(克隆和序列)(Cloning to Sequence(Cloning and Sequence)，ShokubutsuBiotechnology Jikken Manual(Plant BiotechnologyExperimentation Manual)，Noson Bunka Sha))从烟草培养细胞中制备染色体DNA。用液氮将10ml烟草培养细胞冷冻，并用研钵和研杵研磨成粉末形式。在液化开始之前，将大约5g如此获得的粉末加入5ml在离心管(40ml)中预热至60℃的2×CTAB(鲸蜡基三甲基溴化铵)溶液中并逐渐地充分混和，当于60℃间歇性混和10分钟或更长时间的时候，保持温度不变。向其中加入5ml的氯仿∶异戊醇(24∶1)，并完全地混和直至形成乳状液，然后将乳状液离心(2,800rpm，15分钟，室温)。将上面的液体层转移到新的40ml体积离心管中，并用氯仿∶异戊醇(24∶1)再次进行提取操作。向获得的上面的液体层中加入1/10体积的10％CTAB并完全地混和，然后离心(2,800rpm，15分钟，室温)。将上面的液体层转移到新的离心管中，然后向其中加入1体积的冷的异丙醇，充分地进行混和并离心(4,500rpm，20分钟，室温)。在用抽吸装置吸去上清液之后，加入含有5ml 1M氯化钠的TE缓冲溶液，并在55-60℃将其完全溶解。向其中加入5ml冷的异丙醇，当观察到DNA时，用小棒的末端将DNA取出并转移到Eppendorf管(含有80％冷的乙醇)中，然后进行漂洗。用70％乙醇进一步漂洗DNA，然后将干的沉淀物溶解在合适量的TE缓冲液中。向其中加入5μl的RNA酶A(10mg/ml)，并于37℃反应1小时。2×CTAB溶液的组成为2％CTAB、0.1M Tris-HCl(pH：8.0)、1.4M氯化钠和1％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，10％CTAB溶液的组成为10％CTAB和0.7M氯化钠。

按照下面的描述进行Southern分析。

(i)DNA的电泳和碱性修饰

在用限制性内切酶完全降解40μg获得的染色体DNA之后，采用标准的方法进行1.5％琼脂糖凝胶电泳(50V)。将凝胶用溴化乙锭染色并照相，然后在400ml 0.25M HCl中摇动20分钟。在此之后，丢弃溶液，然后将凝胶浸在400ml经修改的溶液(1.5M，NaCl，0.5M，NaOH)中并逐渐地摇动45分钟。随后丢弃溶液，再加入400ml中和溶液(1.5M NaCl，0.5M Tris-Cl(pH：7.4))并逐渐地摇动15分钟。在丢弃溶液之后，再次加入400ml中和溶液并逐渐地摇动15分钟。

(ii)转移

在电泳之后，用20×SSC将DNA转移到尼龙膜(Hybond-NAmersham)上。转移过程进行12小时或更长时间。将有印迹的膜在室温干燥1小时，并经UV固定5分钟。20×SSC的组成为3M NaCl和0.3M柠檬酸钠。

(iii)DNA探针的制备

用随机引物标记试剂盒(Takara Shuzo生产)制备DNA探针。在Eppendorf管中制备下面所显示的反应溶液，并于95℃加热3分钟之后迅速地在冰中冷却：模板DNA 25ng，随机引物2μl，加水至5μl。加入各为1.5μl的10×缓冲液和dNTP以及5μl的[α-³²P]dCTP(1.85MBq，50mCi)，随后用水补足至24μl。向其中加入1μlKlenow片段并置于37℃10分钟，此后通过NAP10柱(Pharmacia生产)进行洗脱从而纯化出DNA。将该纯化的DNA于95℃加热3分钟，然后迅速地在冰中冷却从而得到杂交探针。

(iv)杂交

向下面的预杂交溶液中加入0.05mg/ml的0.5％(w/v)SDS。将上面(ii)中的膜浸入所得的溶液中，然后预杂交于42℃进行2小时或更长时间。在此之后，加入(iii)中制备的DNA探针，然后杂交于42℃进行12小时或更长时间。预杂交溶液的组成为5×SSC、50mM磷酸钠、50％(w/v)甲酰胺、5×Denhardt’s溶液(通过稀释100×Denhardt’s溶液获得)和0.1％(w/v)SDS。100×Denhardt’s溶液的组成为2％(w/v)BSA、2％(w/v)Ficol 400和2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。

(v)放射自显影

在以下面的顺序进行清洗之后，采用标准的方法进行放射自显影。用2×SSC和0.1％SDS于65℃清洗15分钟两次，然后用0.1×SSC和0.1％SDS于65℃清洗15分钟一次。

图3显示了从上面获得的每个抗性株系中制备的基因组DNA的Southern分析结果。正如从图3中所看到的，可以确定hGT基因整合入了GT1、6、8和9这四个株系中。

3.由半乳糖基转移酶转化体分泌的糖蛋白的分析

(烟草培养细胞GT6株系细胞外分泌性生产的糖蛋白的制备)

将烟草培养细胞GT6株系在用Murashige-Skoog培养基(WakoJunyaku生产)的混和盐制备的经修改的Murashige-Skoog培养基中培养7天，然后将由此所得的培养基在室温下于2,000rpm离心10分钟，随后将所得的上清液作为GT6株系培养基进行回收和用于本实施例中。将获得的上清液对dH₂O(去离子水)进行透析(1×10⁵倍稀释度)，然后冷冻干燥。

(N-连接型糖链的制备)

将冷冻干燥所获得的样品于100℃肼解10小时从而切除糖链。向肼解产物中加入过量的丙酮，通过于4℃和10,000rpm离心20分钟沉淀出糖链。糖链在饱和碳酸氢钠水溶液和乙酸酐存在的条件下是N-乙酰化的，然后用Dowex 50×2(Muromachi Kagaku kogyo生产)进行脱盐，并通过用0.1N氨水平衡的Sephadex G-25超细凝胶过滤柱(1.8×180cm)，从而回收得到N-连接糖链。

(吡啶胺化(pyridylaminated，PA)糖链的制备)

回收得到的N-连接糖链是PA化的。将PA-样品通过用3％乙酸水溶液平衡的Sephadex G-25超细凝胶过滤柱(1.8×180cm)从而纯化得到PA-糖链。

(用HPLC分级分离和分析PA-糖链)

用反相(RP)和大小分级分离(SF)HPLC分析PA-糖链，用外切糖苷酶消化和IS-MS/MS分析进行二维糖链制图。在HPLC(高效液相层析)分析中，使用具有Jasco 821-FP智能型荧光分光光度计的Jasco 880-PU HPLC，并在310nm的激发波长和380nm的荧光波长测量荧光强度。

在使用Cosmosil 5C18-P柱(6×250mm，Nakaraitesc生产)的RP-HPLC分析中，0.02％TFA水溶液中乙腈的浓度以1.2ml/分钟的流速经过40分钟从0％增加到6％，从而洗脱下PA-糖链。在使用Asahipak NH2P-50柱(4.6×250mm，Showa Denko K.K.生产)的SF-HPLC分析中，dH₂O-乙腈混和溶液中乙腈的浓度以0.7ml/分钟的流速经过25分钟从26％增加到50％，从而洗脱下PA-糖链。

(通过外切糖苷酶消化分析PA-糖链)

在用β-半乳糖苷酶(肺炎双球菌(Diplococcuspneumoniae)，Roche)的酶消化反应中，每个PA-糖链在含有5mUβ-半乳糖苷酶的0.1M乙酸钠缓冲液(pH：5.5)中于37℃反应2天。类似地，在用N-乙酰葡糖胺糖苷酶(N-acetylglucosamidase)(肺炎双球菌，Roche)的酶消化反应中，每个PA-糖链在含有5mUN-乙酰葡糖胺糖苷酶的0.1M乙酸钠缓冲液(pH：5.5)中于37℃反应2天。此外，在用α-甘露糖苷酶(刀豆，Sigma)的酶消化反应中，每个PA-糖链在含有10mM乙酸锌和10μU α-甘露糖苷酶的0.1M乙酸钠缓冲液(pH：3.88)中于37℃反应2天。通过将溶液在100℃煮沸3分钟来终止每个酶消化反应。然后将反应溶液在12,000rpm离心10分钟，并将上清液进行HPLC。将每个样品糖链的洗脱时间与已知糖链的洗脱时间进行比较。

(IS-MS/MS分析)

用Perkin-Elmer Sciex API-III三联四级质谱仪进行IS-MS/MS分析。扫描间隔为0.5Da。

(体外唾液酸转移酶反应)

将上面在透析和冷冻干燥之后制备得到的源自GT6株系细胞培养基的糖蛋白用作底物。唾液酸转移酶反应在62.5mM二甲胂酸钠缓冲溶液(pH：6.0)中于37℃进行5小时，该缓冲溶液还含有1mg/mlBSA、0.5％Triton CF-54、2μM CMP-唾液酸、6mU α2，6-唾液酸转移酶(源自大鼠肝)(Wako Junyaku生产)和400μg源自GT6株系细胞培养基的糖蛋白。在对照测试中，400μg源自BY2株系细胞培养基的糖蛋白和40μg脱唾液酸胎球蛋白(胎牛血清，Sigma)用作底物。

(凝集素染色)

将唾液酸转移酶反应产物进行使用12.5％聚丙烯酰胺凝胶的SDS-PAGE，其条件为130V进行2小时，然后在1mA/cm²的恒定电流下经过50分钟转移到硝酸纤维素膜上。在凝集素印迹过程中，将连有辣根过氧化物酶的SNA凝集素(EY Laboratories，Inc.生产)用含有0.05％ Tween-20的PBS溶液作200倍稀释并投入使用。在印迹过程之后，用POD免疫染色试剂盒(Wako Junyaku生产)进行染色。

(源自烟草培养细胞GT6株系培养基的PA-糖链的纯化)

将从GT6株系培养基中制备的PA-糖链用RP-HPLC和SF-HPLC(分别显示在图4A和图4B中)进行纯化。图4A显示了RP-HPLC中PA-产物的峰。在将峰(1至6)回收之后各自进行SF-HPLC(见图4B)。

除了通过SF-HPLC获得的6个峰(图4B中显示为A至F)之外，其他峰不是N-连接糖链。这是经过证实的，因为在IS-MS/MS分析中，没有获得与m/z 299.33(GlcNAc-PA)和m/z 502.52(GlcNAc₂-PA)一致的信号。图5显示了通过对峰(A-F)分析所得的N-连接糖链结构。在图5中，圆括号内的数字表明了具有图中显示的各结构的糖链的摩尔比例。

正如图5中所显示的，A至F都是具有结合到N-乙酰葡糖胺残基上的半乳糖残基的人型糖链，它们不含有岩藻糖残基，并且除了B和D外不含有木糖残基。

(源自烟草培养细胞GT6培养基的PA-糖链的结构分析)

通过峰A(图6中的I)的IS-MS分析所获得的分子量(m/z1354.8)与GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂-PA(1354.27)一致。推测通过IS-MS/MS分析所获得的信号，即m/z 1192.5、m/z 990.5、m/z827.5、m/z 665.5、m/z 503.0和m/z 300.0分别为GlcNAcMan₃GlcNAc₂-PA(1192.13)、Man₃GlcNAc₂-PA(988.94)、Man₂GlcNAc₂-PA(826.80)、ManGlcNAc₂-PA(664.66)、GlcNAc₂-PA(502.52)和GlcNAc-PA(299.33)，这暗示峰A含有这些结构(未显示数据)。

峰A的β-半乳糖苷酶消化产物为GlcNAcMan₃GlcNAc₂-PA(图6中的II)，其N-乙酰葡糖胺糖苷酶消化产物为Man₃GlcNAc₂-PA(图6中的III)。

通过峰B(图7中的I)的IS-MS分析所获得的分子量(m/z1486.8)与GalGlcNAcMan₃XylGlcNAc₂-PA(1486.38)一致。推测通过IS-MS/MS分析所获得的信号，即m/z 1354.5、m/z 1324.0、m/z1324.0、m/z 1122.0、m/z 991.5、m/z 960.0、m/z 666.0、m/z503.0和m/z 300.0分别为GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂-PA(1354.27)、GlcNAcMan₃XylGlcNAc₂-PA(1324.24)、Man₃XylGlcNAc₂-PA(1121.05)、Man₃GlcNAc₂-PA(988.94)、Man₂XylGlcNAc₂-PA(958.91)、ManGlcNAc₂-PA(664.66)、GlcNAc₂-PA(502.52)和GlcNAc₂-PA(299.33)，这暗示峰B含有这些结构(未显示数据)。

峰B的β-半乳糖苷酶消化产物为GlcNAcMan₃XylGlcNAc₂-PA(图7中的II)，其N-乙酰葡糖胺糖苷酶消化产物为Man₃XylGlcNAc₂-PA(图7中的III)。

通过峰C(图8中的I)的IS-MS分析所获得的分子量(m/z1355.0)与GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂-PA(1354.27)一致。推测通过IS-MS/MS分析所获得的信号，即m/z 1193.5、m/z 989.0、m/z827.0、m/z 665.5、m/z 503.0和m/z 300.0分别为GlcNAcMan₃GlcNAc₂-PA(m/z 1192.13)、Man₃GlcNAc₂-PA(m/z988.94)、Man₂GlcNAc₂-PA(m/z 826.80)、ManGlcNAc₂-PA(m/z664.66)、GlcNAc₂-PA(m/z 502.52)和GlcNAc-PA(m/z299.33)，这暗示峰C含有这些结构(未显示数据)。

峰C的β-半乳糖苷酶消化产物为GlcNAcMan₃GlcNAc₂-PA(图8中的II)，其N-乙酰葡糖胺糖苷酶消化产物为Man₃GlcNAc₂-PA(图8中的III)。

通过峰D(图9中的I)的IS-MS分析所获得的分子量(m/z1487.0，图10中的A)与GalGlcNAcMan₃XylGlcNAc₂-PA(m/z1486.38)一致。推测通过IS-MS/MS分析所获得的信号，即m/z1354.0、m/z 1325.0、m/z 1191.0、m/z 1121.5、m/z 989.5、m/z828.5、m/z 503.0和m/z 300.5分别为GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂-PA(m/z 1354.27)、GlcNAcMan₃XylGlcNAc₂-PA(m/z 1324.24)、GlcNAcMan₃GlcNAc₂-PA(m/z 1192.13)、Man₃XylGlcNAc₂-PA(m/z1121.05)、Man₃GlcNAc₂-PA(m/z 988.94)、Man₂GlcNAc₂-PA(m/z826.80)、GlcNAc₂-PA(m/z 502.52)和GlcNAc-PA(m/z299.33)，这暗示峰D含有这些结构(图10中的B)。

峰D的β-半乳糖苷酶消化产物为GlcNAcMan₃XylGlcNAc₂-PA(图9中的II)，其N-乙酰葡糖胺糖苷酶消化产物为Man₃XylGlcNAc₂-PA(图9中的III)。

通过峰E(图11中的I)的IS-MS分析所获得的分子量(m/z1516.6)与GalGlcNAcMan₄GlcNAc₂-PA(1516.41)一致。推测通过IS-MS/MS分析所获得的信号，即m/z 1355.0、m/z 1193.0、m/z990.0、m/z 826.5、m/z 665.0、m/z 503.5和m/z 300.0分别为GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂-PA(m/z 1354.27)、GalNAcMan₃GlcNAc₂-PA(m/z 1192.13)、Man₃GlcNAc₂-PA(m/z 988.94)、Man₂GlcNAc₂-PA(m/z 826.80)、ManGlcNAc₂-PA(m/z 664.66)、GlcNAc₂-PA(m/z502.52)和GlcNAc-PA(m/z 299.33)，这暗示峰E含有这些结构(未显示数据)。

峰E的β-半乳糖苷酶消化产物为GlcNAcMan₄GlcNAc₂-PA(图11中的II)，其N-乙酰葡糖胺糖苷酶消化产物为Man₄GlcNAc₂-PA(图11中的III)。

通过峰F(图12中的I)的IS-MS分析所获得的分子量(m/z1679.8)与GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂-PA(1678.55)一致。推测通过IS-MS/MS分析所获得的信号，即m/z 1517.5、m/z 1313.5、m/z1152.0、m/z 827.5、m/z 665.5、m/z 503.0和m/z 300.0分别为GlcNAcMan₅GlcNAc₂-PA(m/z 1516.41)、Man₅GlcNAc₂-PA(m/z1313.22)、Man₄GlcNAc₂-PA(m/z 1151.08)、Man₂GlcNAc₂-PA(m/z826.80)、ManGlcNAc₂-PA(m/z 664.66)、GlcNAc₂-PA(m/z502.52)和GlcNAc-PA(m/z 299.33)，这暗示峰F含有这些结构(未显示数据)。

峰F的β-半乳糖苷酶消化产物为GlcNAcMan₅GlcNAc₂-PA(图12中的II)，其N-乙酰葡糖胺糖苷酶消化产物为Man₅GlcNAc₂-PA(图12中的III)。

综合这些结果，认为峰A或C为

α-D-Man-(1→6)[β-D-Gal-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→2)-α-D-Man-(1→3)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-GlcNAc-PA(GalGN₁M3-PA)或[β-D-Gal-(1→4)-β-D-GlcNAc(1→2)-α-D-Man-(1→6)]α-D-Man-(1→3)β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-GlcNAc-PA(GalGN¹M3-PA)。

认为峰B或D为

α-D-Man-(1→6)[β-D-Gal-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→2)-α-D-Man-(1→3)][β-D-Xyl-(1→2)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-GlcNAc-PA(GalGN₁M3X-PA)或[β-D-Gal-(1→4)-β-D-GlcNAc(1→2)-α-D-Man-(1→6)][α-D-Man-(1→3)][β-D-Xyl-(1→2)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-GlcNAc-PA(GalGN¹M3X-PA)。

认为峰E为

α-D-Man-(1→6)-α-D-Man-(1→6)[β-D-Gal-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→2)-α-D-Man-(1→3)]β-D-Man-(1→4)β-D-GlcNAc-(1→4)-GlcNAc-PA(GalGNM4-PA)或α-D-Man-(1→3)-α-D-Man-(1→6)[β-D-Gal-(1→4)-β-D-GlcNAc(1→2)-α-D-Man-(1→3)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-GlcNAc-PA(GalGNM4-PA)。

认为峰F为α-D-Man-(1→6)[α-D-Man-(1→3)]α-D-Man-(1→6)[β-D-Gal-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→2)-α-D-Man-(1→3)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-GlcNAc-PA(GalGNM5-PA)。

(体外唾液酸转移酶反应)

体外唾液酸转移酶反应用源自GT6株系培养基的糖蛋白、源自BY2株系培养基的糖蛋白或脱唾液酸胎球蛋白作为底物来进行。将各反应物转移到硝酸纤维素膜上，并进行凝集素染色。结果为，凝集素染色在底物是脱唾液酸胎球蛋白(图13中的泳道1)或源自GT6株系培养基的糖蛋白(图13中的泳道2)的情况下为阳性；凝集素染色在底物是源自BY2株系培养基的糖蛋白(图13中的泳道3)的情况下为阴性。从此中揭示出源自烟草培养细胞GT6株系培养基的糖蛋白在唾液酸转移酶反应中作为底物。

(比较实施例)

(非转化体BY2株系培养细胞分泌的糖蛋白的分析)

(通过细胞外分泌制备糖蛋白)

采用与对于GT6株系同样的方法获得经冷冻干燥的培养物上清液样品，只是用BY2株系代替GT6株系。

(N-连接糖链的制备)

采用与对于GT6株系同样的方法回收N-连接糖链，只是用TSKgel TOYO PERAL HW-40(TOSO生产)凝胶过滤柱(2.5×30cm)代替Sephadex G-25超细凝胶过滤柱(1.8×180cm)。

(吡啶胺化(PA)糖链的制备)

将回收得到的N-连接糖链用2-氨基吡啶进行PA化。将PA-样品通过TSK gel TOYO PERAL HW-40(TOSO生产)凝胶过滤柱(2.5×30cm)进行过滤从而纯化出PA-糖链。

(用HPLC分级分离和分析PA-糖链)

采用与对于GT6株系同样的方法进行PA-糖链的分级分离和分析，只是用具有HITACHI FL检测器L-7480的HITACHI HPLC系统代替具有Jasco 821-FP智能型荧光分光光度计的Jasco 880-PUHPLC。

(通过外切糖苷酶消化分析PA-糖链)

在用N-乙酰葡糖胺糖苷酶(肺炎双球菌，Roche)的酶消化反应中，每个PA-糖链在含有3mU N-乙酰葡糖胺糖苷酶的0.1M乙酸钠缓冲液(pH：5.45)中于37℃反应2天。在用α-甘露糖苷酶(刀豆，Sigma)的酶消化反应中，每个PA-糖链在含有10mM乙酸锌和10μUα-甘露糖苷酶的0.1M乙酸钠缓冲液(pH：4.0)中于37℃反应2天。通过将溶液在100℃煮沸3分钟来终止每个酶消化反应。然后将反应溶液在12,000rpm离心10分钟，并将上清液进行HPLC。将每个样品糖链的洗脱时间与已知糖链的洗脱时间进行比较。

(IS-MS/MS分析)

采用与对于GT6株系同样的方法进行该分析。

(源自BY2株系培养基的PA-糖链的制备)

将从BY2培养基中制备的PA-糖链也用RP-HPLC和SF-HPLC(图14A和14B)进行纯化。图14A显示了RP-HPLC中PA-产物的峰。在回收之后，将各个级分(I至X)进行SF-HPLC(图14B)。

在图14A中显示的级分(I、II和III)中，SF-HPLC分析没有检测到N-连接糖链。这是经过证实的，因为在IS-MS/MS分析中，没有获得与m/z 299.33(GlcNAc-PA)和m/z 502.52(GlcNAc₂-PA)一致的信号。用SF-HPLC分析级分IV至X的峰，结果得到21个峰(见图14B)。图15A和15B显示了经分析的N-连接糖链结构。

(源自BY2株系培养基的PA-糖链的结构分析)

对图14B中显示的峰V-4、VII-3和VIII-4进行IS-MS/MS分析，结果显示分子量(m/z)分别为1639.0、1476.5和1314.5，将SF-HPLC中的洗脱位置一起考虑，可得出这些峰中存在的糖链结构分别与PA-高甘露糖糖链Man₇GlcNAc₂-PA、Man₆GlcNAc₂-PA和Man₅GlcNAc₂-PA一致(未显示数据)。

而且，SF-HPLC分析的结果显示，各个峰的糖链的α-甘露糖苷酶消化产物与ManGlcNAc₂-PA(M1)一致(未显示数据)。当与Man₇GlcNAc₂-PA的异构体M7A、M7B和M7D进行比较时，峰V-4的洗脱位置与M7A的洗脱位置一致。在Man₆GlcNAc₂-PA的异构体M6B和M6C中，峰VII-3与M6B一致。而且，Man₅GlcNAc₂-PA的异构体M5A与峰VIII-4是一致的。

综合这些数据，图14B中显示的峰V-4、VII-3和VIII-4正如图15A中所显示的为α-D-Man-(1→2)-α-D-Man-(1→6)[α-D-Man-(1→3)]α-D-Man-(1→6)[α-D-Man-(1→2)-α-D-Man-(1→3)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-GlcNAc-PA(M7A)、α-D-Man-(1→6)[α-D-Man-(1→3)]α-D-Man-(1→6)[α-D-Man(1→2)-α-D-Man-(1→3)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-GlcNAc-PA(M6A)和α-D-Man-(1→6)[α-D-Man-(1→3)]α-D-Man-(1→6)[α-D-Man-(1→3)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-GlcNAc-PA(M5A)。

在图中，圆括号内的数字表明了具有图中显示的各结构的糖链的摩尔比例。

通过图14B中显示的峰IV-1和V-1的IS-MS分析所测定的分子量(m/z 1267.5)与Man₃XylFucGlcNAc₂-PA的计算值(M3FX：1267.19)一致。而且，HPLC中的洗脱位置与二维糖链图谱上的M3FX标准产物完全一致。此外，SF-HPLC分析和IS-MS/MS分析的结果显示各个峰的糖链的α-甘露糖苷酶消化产物与ManXylFucGlcNAc₂-PA(MFX：942.91)的计算值一致(见图17A和17B)。

综合这些数据，图14B中显示的峰IV-1和V-1正如图15B中所显示的为α-D-Man-(1→6)[α-D-Man-(1→3)][β-D-Xyl-(1→2)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-[α-L-Fuc-(1→3)]GlcNAc-PA(M3FX)。

通过图14B中显示的峰VII-2的IS-MS分析所测定的分子量(m/z 1417.0)与GlcNAcMan₃XylFucGlcNAc₂-PA的计算值(GNM3FX：1470.38)一致。而且，SF-HPLC分析和IS-MS/MS分析的结果显示该峰的糖链的N-乙酰葡糖胺糖苷酶消化产物与Man₃XylFucGlcNAc₂-PA(M3FX：1267.19)一致。此外，在用α-甘露糖苷酶进行消化之后，SF-HPLC分析和IC-MS/MS分析揭示出产物与ManXylFucGlcNAc₂-PA(MFX：942.91)一致(图17中的C至E)。在二维糖链图谱上，峰VII-2(图16中的D-2)在RP-HPLC中的洗脱位置与标准产物GN¹M3FX，即β-D-GlcNAc-(1→2)-α-D-Man-(1→6)[α-D-Man-(1→3)][β-D-Xyl-(1→2)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-[α-L-Fuc-(1-3)]GlcNAc-PA(图16中的D-1)完全一致。

综合这些数据，峰VII-2正如图15B中所显示的为β-D-GlcNAc-(1→2)-α-D-Man-(1→6)[α-D-Man-(1→3)][β-D-Xyl-(1→2)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-[α-L-Fuc-(1→3)]GlcNAc-PA(GN¹M3FX)。

图14B中显示的峰VII-1和VIII-3的分子量(m/z 1324.0)与GlcNAcMan₃XylGlcNAc₂-PA的计算值(GNM3FX：1324.24)一致。而且，SF-HPLC分析和IS-MS/MS分析的结果显示峰VIII-1的N-乙酰葡糖胺糖苷酶消化产物与Man₃XylGlcNAc₂-PA(M3X：1121.05)一致(图18A中的B)。此外，在用α-甘露糖苷酶进行消化之后，SF-HPLC分析和IC-MS/MS分析揭示出产物与ManXylGlcNAc₂-PA(MX：796.77)一致(图18A中的C)。认为GNM3X的结构有两种异构体类型，即α-D-Man-(1→6)[β-D-GlcNAc-(1→2)-α-D-Man-(1→3)][β-D-Xyl-(1→2)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-GlcNAc-PA(GN₁M3X)和β-D-GlcNAc-(1→2)-α-D-Man-(1→6)[α-D-Man-(1→3)][β-D-Xyl-(1→2)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-GlcNAc-PA(GN¹M3X)。据报道，在ODS柱上GN₁M3X于GN¹M3X之前洗脱。当考虑峰VII-1和VIII-3的洗脱位置时，正如图15B中所显示的，峰VII-1为α-D-Man-(1→6)[β-D-GlcNAc-(1→2)-α-D-Man-(1→3)][β-D-Xyl-(1→2)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-GlcNAc-PA(GN₁M3X)，峰VIII-3为β-D-GlcNAc-(1→2)-α-D-Man-(1→6)[α-D-Man-(1→3)][β-D-Xyl-(1→2)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-GlcNAc-PA(GN¹M3X)。

图14B中显示的峰X-1在HPLC中的洗脱位置与二维糖链图谱上标准的GN2M3(1395.32)完全一致。而且，SF-HPLC分析和IS-S/MS分析的结果显示该峰的糖链的N-乙酰葡糖胺糖苷酶消化产物与Man₃GlcNAc₂-PA(M3：988.94)一致。此外，在用α-甘露糖苷酶进行消化之后，SF-HPLC分析和IC-MS/MS分析揭示出产物与ManGlcNAc₂-PA(M1：664.66)一致(未显示数据)。综合这些结果，峰X-1正如图15A和15B中所显示的为β-D-GlcNAc-(1→2)-α-D-Man-(1→6)[β-D-GlcNAc-(1→2)-α-D-Man-(1→3)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-GlcNAc-PA(GN2M3)。

图14B中显示的峰X-2的分子量(m/z 1529.5)与GlcNAc₂Man₃XylGlcNAc₂-PA的计算值(GN2M3FX：1527.43)一致。而且，HPLC中的洗脱位置与二维糖链图谱上的M3FX标准产物完全一致。此外，该峰的糖链的α-甘露糖苷酶消化产物的洗脱位置没有由于HPLC分析而改变。可是，SF-HPLC分析和IC-MS/MS分析的结果显示N-乙酰葡糖胺糖苷酶消化产物与Man₃XylGlcNAc₂-PA(M3X：1121.05)一致(图18B中的B)。在用α-甘露糖苷酶进行进一步消化之后，SF-HPLC分析和IC-MS/MS分析揭示出产物与ManXylGlcNAc₂-PA(MX：796.77)一致(图18A中的C)。综合这些数据，峰X-2正如图15B中所显示的为β-D-GlcNAc-(1→2)-α-D-Man-(1→6)[β-D-GlcNAc-(1→2)-α-D-Man-(1→3)][β-D-Xyl-(1→2)]β-D-Man-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-GlcNAc-PA(GN2M3X)。

图14B中显示的其他峰IV-2、IV-3、V-2、V-3、V-5、VI-1、VI-2、VI-3、VI-4、VIII-2和IX不是N-连接糖链，因为IS-MS/MS分析的结果显示没有获得与m/z 299.33(GlcNAc-PA)和m/z502.52(GlcNAc₂-PA)相一致的信号。

4.辣根过氧化物酶(HRP)的分泌

将从35S-Cla(Kawaoka等人，J.Ferment.Bioeng.，78，49-53(1994))中获得的外源基因(辣根过氧化物酶基因)插入载体pBI101 HmB(Akama等人，Plant Cell Rep.，12，7-11(1992))的HindIII和SacI位点，并引入GT6株系。在培养获得的GT6株系的克隆(GT-HRP-5、GT-HRP-19)之后，收集上清液并进行标准的等电聚焦电泳。正如图19中所表明的，结果在克隆GT-HRP-5、GT-HRP-19的上清液中检测到HRP的pI7.8的电泳条带，因此可以确定外源蛋白质也从被GalT基因转化的植物细胞分泌出来。此外，图20表明了由克隆GT-HRP-5分泌并按照上面所描述的方法用标准SDS-PAGE电泳分离的蛋白质的凝集素染色结果。RCA120染色表明GT-HRP-5显示阳性信号(图20(c))，因此表明分泌的HRP具有添加了半乳糖的糖链结构。

                    工业适用性

本发明涉及用植物细胞分泌性生产具有人型糖链的异源糖蛋白的方法、能够分泌该糖蛋白的植物细胞和由该植物细胞所分泌的具有人型糖链的糖蛋白。本发明的糖蛋白具有人型糖链，因此其无抗原性从而可用于对包括人在内的动物进行施用。

                         序列表

<110>Tatsuji，Seki and Kazuhito，Fujiyama

<120>分泌性生产具有人型糖链的糖蛋白的方法

<130>J198020401

<160>6

<170>PatentIn Ver.2.0

<210>1

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物hGT-5Eco

<400>1

aaagaattcg cgatgccagg cgcgcgtccc t                                     31

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物hGT-2Sal

<400>2

tcgatcgcaa aaccatgtgc agctgatg                                         28

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物hGT-7Spe

<400>3

acgggactcc tcaggggcga tgatcataa                                        29

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物hGT-6Spe

<400>4

aagactagtg ggccccatgc tgattga                                          27

<210>5

<211>1158

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1155)

<400>5

atg cca ggc gcg tcc cta cag cgg gcc tgc cgc ctg ctc gtg gcc gtc        48

Met Pro Gly Ala Ser Leu Gln Arg Ala Cys Arg Leu Leu Val Ala Val

  1               5                  10                  15

tgc gct ctg cac ctt ggc gtc acc ctc gtt tac tac ctg gct ggc cgc        96

Cys Ala Leu His Leu Gly Val Thr Leu Val Tyr Tyr Leu Ala Gly Arg

             20                  25                  30

gac ctg agc cgc ctg ccc caa ctg gtc gga gtc tcc aca ccg ctg cag        144

Asp Leu Ser Arg Leu Pro Gln Leu Val Gly Val Ser Thr Pro Leu Gln

         35                  40                  45

ggc ggc tcg aac agt gcc gcc gcc atc ggg cag tcc tcc ggg gag ctc        192

Gly Gly Ser Asn Ser Ala Ala Ala Ile Gly Gln Ser Ser Gly Glu Leu

     50                  55                  60

cgg acc gga ggg gcc cgg ccg ccg cct cct cta ggc gcc tcc tcc cag    240

Arg Thr Gly Gly Ala Arg Pro Pro Pro Pro Leu Gly Ala Ser Ser Gln

 65                  70                  75                  80

ccg cgc ccg ggt ggc gac tcc agc cca gtc gtg gat tct ggc cct ggc    288

Pro Arg Pro Gly Gly Asp Ser Ser Pro Val Val Asp Ser Gly Pro Gly

                 85                  90                  95

ccc gct agc aac ttg acc tcg gtc cca gtg ccc cac acc acc gca ctg    336

Pro Ala Ser Asn Leu Thr Ser Val Pro Val Pro His Thr Thr Ala Leu    

            100                 105                 110

tcg ctg ccc gcc tgc cct gag gag tcc ccg cta cta gtg ggc ccc atg    384

Ser Leu Pro Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly Pro Met

        115                 120                 125

ctg att gag ttt aac atg cct gtg gac ctg gag ctc gtg gca aag cag    432

Leu Ile Glu Phe Asn Met Pro Val Asp Leu Glu Leu Val Ala Lys Gln

    130                 135                 140

aac cca aat gtg aag atg ggc ggc cgc tat gcc ccc agg gac tgc gtc    480

Asn Pro Asn Val Lys Met Gly Gly Arg Tyr Ala Pro Arg Asp Cys Val

145                 150                 155                 160

tct cct cac aag gtg gcc atc atc att cca ttc cgc aac cgg cag gag    528

Ser Pro His Lys Val Ala Ile Ile Ile Pro Phe Arg Asn Arg Gln Glu

                165                 170                 175

cac ctc aag tac tgg cta tat tat ttg cac cca gtc ctg cag cgc cag    576

His Leu Lys Tyr Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Val Leu Gln Arg Gln

            180                 185                 190

cag ctg gac tat ggc atc tat gtt atc aac cag gcg gga gac act ata    624

Gln Leu Asp Tyr Gly Ile Tyr Val Ile Asn Gln Ala Gly Asp Thr Ile

        195                 200                 205

ttc aat cgt gct aag ctc ctc aat gtt ggc ttt caa gaa gcc ttg aag    672

Phe Asn Arg Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe Gln Glu Ala Leu Lys

    210                 215                 220

gac tat gac tac acc tgc ttt gtg ttt agt gac gtg gac ctc att cca    720

Asp Tyr Asp Tyr Thr Cys Phe Val Phe Ser Asp Val Asp Leu Ile Pro

225                 230                 235                 240

atg aat gac cat aat gcg tac agg tgt ttt tca cag cca cgg cac att    768

Met Asn Asp His Asn Ala Tyr Arg Cys Phe Ser Gln Pro Arg His Ile

                245                 250                 255

tcc gtt gca atg gat aag ttt gga ttc agc cta cct tat gtt cag tat    816

Ser Val Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gln Tyr

            260                 265                 270

ttt gga ggt gtc tct gct cta agt aaa caa cag ttt cta acc atc aat    864

Phe Gly Gly Val Ser Ala Leu Ser Lys Gln Gln Phe Leu Thr Ile Asn

        275                 280                 285

gga ttt cct aat aat tat tgg ggc tgg gga gga gaa gat gat gac att    912

Gly Phe Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp Asp Ile

    290                 295                 300

ttt aac aga tta gtt ttt aga ggc atg tct ata tct cgc cca aat gct    960

Phe Asn Arg Leu Val Phe Arg Gly Met Ser Ile Ser Arg Pro Asn Ala

305                 310                 315                 320

gtg gtc ggg agg tgt cgc atg atc cgc cac tca aga gac aag aaa aat    1008

Val Val Gly Arg Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys Asn

                325                 330                 335

gaa ccc aat cct cag agg ttt gac cga att gca cac aca aag gag aca    1056

Glu Pro Asn Pro Gln Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr Lys Glu Thr

            340                 345                 350

atg ctc tct gat ggt ttg aac tca ctc acc tac cag gtg ctg gat gta    1104

Met Leu Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Gln Val Leu Asp Val

        355                 360                 365

cag aga tac cca ttg tat acc caa atc aca gtg gac atc ggg aca ccg    1l52

Gln Arg Tyr Pro Leu Tyr Thr Gln Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr Pro

    370                 375                 380

agc tag                                                            1158

Ser

385

<210>6

<211>385

<212>PRT

<213>人

<400>6

Met Pro Gly Ala Ser Leu Gln Arg Ala Cys Arg Leu Leu Val Ala Val

  1               5                  10                  15

Cys Ala Leu His Leu Gly Val Thr Leu Val Tyr Tyr Leu Ala Gly Arg

             20                  25                  30

Asp Leu Ser Arg Leu Pro Gln Leu Val Gly Val Ser Thr Pro Leu Gln

         35                  40                  45

Gly Gly Ser Ash Ser Ala Ala Ala Ile Gly Gln Ser Ser Gly Glu Leu

     50                  55                  60

Arg Thr Gly Gly Ala Arg Pro Pro Pro Pro Leu Gly Ala Ser Ser Gln

 65                  70                  75                  80

Pro Arg Pro Gly Gly Asp Ser Ser Pro Val Val Asp Ser Gly Pro Gly

                 85                  90                  95

Pro Ala Ser Asn Leu Thr Ser Val Pro Val Pro His Thr Thr Ala Leu

            100                 105                 110

Ser Leu Pro Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly Pro Met

        115                 120                 125

Leu Ile Glu Phe Asn Met Pro Val Asp Leu Glu Leu Val Ala Lys Gln

    130                 135                 140

Asn Pro Asn Val Lys Met Gly Gly Arg Tyr Ala Pro Arg Asp Cys Val

145                 150                 155                 160

Ser Pro His Lys Val Ala Ile Ile Ile Pro Phe Arg Asn Arg Gln Glu

                165                 170                 175

His Leu Lys Tyr Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Val Leu Gln Arg Gln

            180                 185                 190

Gln Leu Asp Tyr Gly Ile Tyr Val Ile Asn Gln Ala Gly Asp Thr Ile

        195                 200                 205

Pbe Asn Arg Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe Gln Glu Ala Leu Lys

    210                 215                 220

Asp Tyr Asp Tyr Thr Cys Phe Val Phe Ser Asp Val Asp Leu Ile Pro

225                 230                 235                 240

Met Asn Asp His Asn Ala Tyr Arg Cys Phe Ser Gln Pro Arg His Ile

                245                 250                 255

Ser Val Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gln Tyr

            260                 265                 270

Phe Gly Gly Val Ser Ala Leu Ser Lys Gln Gln Phe Leu Thr Ile Asn

        275                 280                 285

Gly Phe Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp Asp Ile

    290                 295                 300

Phe Asn Arg Leu Val Phe Arg Gly Met Ser Ile Ser Arg Pro Asn Ala

305                 310                 315                 320

Val Val Gly Arg Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys Asn

                325                 330                 335

Glu Pro Asn Pro Gln Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr Lys Glu Thr

            340                 345                 350

Met Leu Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Gln Val Leu Asp Val

        355                 360                 365

Gln Arg Tyr Pro Leu Tyr Thr Gln Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr Pro

    370                 375                 380

Ser

385