利用HPLC/ESi-MS建立糖蛋白中N-糖链的分析方法

摘要

蛋白质糖基化是人体中最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式，人体中超过50％的蛋白质是糖基化的。研究发现，寡糖在蛋白质结构构造、生物活性中起着至关重要的作用，人类许多疾病的发生和发展都与蛋白上N-糖链的结构和表达量的改变有关。因此，发展和建立分析N-糖链的方法，对生物和病理学研究具有积极现实意义。
　　目前的研究方法主要是化学衍生法，其缺点是需要引入额外的化学试剂、操作步骤繁琐以及有副反应发生。化学酶标记法由于没有化学衍生法的特点，为研究糖蛋白中的N-糖链，提供了新的思路。首先，在本实验室前人工作的基础上，以Boc-Asn-GlcNAc为基础结构单元物质合成了同位素标记糖基受体d0/d8-PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc，优化了受体合成方法:以DMT-MM作为反应缩合剂，探索温度、时间、反应物比例对受体产率的影响，合成受体反应产率达到95-98％。随后，我们以标准糖肽SGP为反应底物，对比Endo-M酶、Endo-M-N175Q酶的转糖基活性和水解活性，结果表明Endo-M-N175Q酶的转糖基活性几乎是Endo-M酶的2倍，且Endo-M-N175Q酶几乎丧失对转糖基产物的水解能力。紧接着我们以标准糖蛋白牛胰核糖核酸酶B为研究对象，对比丙酮富集N-糖链和N-糖苷酶F释放N-糖链两种方法检测糖链的效率，结果表明N-糖苷酶F释放N-糖链简便、高效。为了检验该方法的实用性，我们以卵清蛋白为实际样品，成功、高效地检测出一系列N-糖链(M5N2、M6N2、M7N2、M4N3、M5N3、M3N4、M3N5、M4N4、M3N6)，和文献已报到的寡糖数量一致，正离子模式下这些寡糖都是以二价或三价的形式出现。相比于传统的化学衍生化法，Endo-M-N175Q酶可以一步完成酶解和转移两个过程，避免了繁琐的步骤以及副反应的发生。因此，我们提出的以含有Boc-Asn-GlcNAc结构单元的化学物质作为糖基受体、结合Endo-M-N-175Q酶的特性、以HPLC/ESI-MS为检测手段，这一全新的分析方法，对分析糖蛋白中的N-糖链切实高效可行。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 糖与蛋白质的关系

1．2 几种重要的糖蛋白

1．2．1 炎症性糖蛋白

1．2．2 触珠蛋白

1．2．3 纤连蛋白

1．3 糖蛋白中寡糖链的功能及研究意义

1．4 本课题的研究目的及意义

第二章 实验部分

2．1 实验仪器与试剂

2．2 稳定同位素标记糖基受体的合成

2．2．1 d0-PDPZ-Boc-Asn-GIcNAc糖基受体的合成

2．2．2 d8-PDPZ-Boc-Asn-GIcNAc糖基受体的合成

2．2．3 d0-MPDPZ-Boc-Asn-GIcNAc糖基受体的合成

2．3 转糖基酶的选择

2．3．1 标准溶液的配制

2．3．2 Endo-M与SGP的反应

2．3．3 Endo-M-N175Q与SGP的反应

2．4 糖蛋白的酶解与标记

2．4．1 PNGase F酶解

2．4．2 糖链的分离纯化

2．4．3 糖链的纯化

2．4．4 糖链的标记

2．5 丙酮选择性富集糖肽

2．5．1 溶液的配制

2．5．2 糖蛋白的变性与失活

2．5．3 过石墨炭柱

2．5．4 糖蛋白的酶切

2．5．5 肽链与糖肽链的分离

2．5．6 糖链的标记

第三章 结果与结论

3．1 稳定同位素糖基受体合成条件的优化

3．2 转糖基反应效力对比

3．2．1 糖苷内切酶的选择

3．2．2 PDPZ--Boc-Asn-GlcNAc-SG结构分析

3．3 丙酮富集糖肽链

3．4 使用N-糖苷酶F释放寡糖链

3．5 实际样品的分析

第四章 结论

参考文献

致谢

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附图