携带SV40增强子元件的DNA疫苗载体

摘要

本发明公开了一种提高DNA疫苗免疫原性的新型DNA疫苗质粒载体，该载体的特征在于含有一段长度为72bp的SV40病毒增强子元件，及其在基因免疫中的应用。本发明还涉及一种提高DNA疫苗免疫原性的方法。

说明书

技术领域

本发明属生物技术和基因免疫领域。

背景技术

DNA疫苗又称基因疫苗、核酸疫苗或裸露的DNA。该类疫苗通过把抗原基因导入体内表达来诱导抗原特异性的细胞和体液免疫反应，从而达到预防或治疗疾病的目的。1990年Wolff JA等(Wolff JA，Malone RW，WilliamsP，et al.Direct gene transfer into mouse muscle in vivo.Science，1990；247(4949 Pt 1)：1465-1468)发现，肌肉注射质粒DNA可使外源基因在体内表达，这为发展新型疫苗提供了思路。1992年Tang DC等(Tang DC，DeVit M，Johnston SA.Genetic immunization is a simple method foreliciting an immune response.Nature.1992；356(6365)：152-4)进行了首次DNA疫苗实验。1997年以来，已有超过70种针对艾滋病、疟疾、乙肝、癌症和自身免疫等疾病的预防或治疗用的DNA疫苗相继进入临床试验。DNA疫苗具有广阔的发展前景。

DNA疫苗既可以诱导细胞免疫，又可以诱导体液免疫，具有安全、模拟天然抗原呈递过程、构建周期短、生产简单、成本低、载体本身无免疫原性、储存简单、无需冷链等诸多优点，是很有希望的新一代疫苗。但是DNA疫苗现在还不是一种成熟的疫苗形式，距离大规模临床应用的要求还有差距。大多数DNA疫苗面临着免疫原性低的共同难题，能否进一步增强DNA疫苗的免疫原性是决定DNA疫苗能否能够成为独立的疫苗形式并逐步取代传统疫苗的关键因素。

DNA疫苗免疫原性较弱的一个重要原因就是其抗原基因在体内表达量低(pg/ml~ng/ml)，不足以对B/T细胞产生有效的刺激。核膜是真核细胞细胞质和细胞核之间的屏障，而质粒DNA所携带的目的基因要在真核细胞内表达，就必须首先进入细胞核内进行转录，所以，质粒进入细胞核的效率，就成了限制目的基因表达效率的一个主要环节，也是限制DNA疫苗免疫原性的一个重要环节。

有研究表明，SV40增强子具有增强DNA的细胞核定位的功能，可以使外源基因在体内肌肉细胞的表达水平比单独使用CMV E/P启动子提高20倍左右，而且这种增强表达的作用具有肌肉细胞特异性(S Li Gene Therapy(2001)8，494-497，David A，Experimental Cell Research 253，713-722(1999))。但由于目前对DNA疫苗免疫机理的研究还不透彻，对于肌肉细胞在抗原呈递方面的作用存在争论，有的研究结果表明，肌肉细胞在抗原呈递过程中几乎不发挥作用(Torres，J.Immunol.158，4529-4532)，目前大多数的DNA疫苗载体定位是以抗原呈递细胞为靶细胞的(Corr M，J Exp Med 1996，184：1555-1560)。因此很难推断肌肉组织特异性的元件对DNA疫苗免疫原性的影响，只能通过实验证实。而已公开发表的文献资料中没有关于SV40病毒72bp增强子样序列对DNA疫苗免疫原性的影响的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型DNA疫苗质粒载体pDRVISV1.0，其特征在于含有可以改善DNA疫苗免疫原性的72bp单拷贝SV40增强子序列。

本发明的另一个目的是提供一种提高DNA疫苗免疫原性的方法，其特征在于将编码抗原的基因克隆到本发明的DNA疫苗质粒载体pDRVISV1.0中。

本发明的另一个目的是提供DNA疫苗载体pDRVISV1.0在基因免疫中的应用。

本发明的技术方案是通过将72bp单拷贝SV40增强子序列克隆入DNA疫苗载体pVRC2000的CMV启动子上游，构建成新的DNA疫苗载体pDRVISV1.0。为评价该72bp单拷贝SV40增强子序列对DNA疫苗免疫原性的优化效果，即为评价DNA疫苗载体pDRVISV1.0的效果，本发明将HIV-1CN54gag基因克隆进相应载体pVRC2000和pDRVISV1.0中，293T细胞转染实验评价载体表达外源基因的能力，小鼠体内免疫实验评价载体诱生特异性细胞免疫反应(细胞因子分泌)和体液免疫反应(检测血清中抗HIV-1Gag抗体)的能力。实验结果表明，基于pDRVISV1.0构建的DNA疫苗诱导的细胞免疫反应和体液免疫反应均明显高于pVRC2000，说明72bp单拷贝SV40增强子序列可以显著增强DNA疫苗的免疫原性。

附图说明

图1为载体pDRVISV1.0构建流程图，Kan表示卡那霉素抗性基因，ColE1表示ColE1复制起始区，BGH PolyA表示牛生长激素基因的多聚腺苷加尾信号，MCS表示供外源基因插入的多克隆位点，Intronl表示人巨细胞病毒主要即刻早期蛋白基因(Human cytomegalovirus maiorimmediate-early protein gene)内含子1，Exonl表示人巨细胞病毒主要即刻早期蛋白基因外显子1，CMVE/P表示人巨细胞病毒主要即刻早期蛋白基因增强子/启动子序列，SV40 ELS表示SV40病毒72bp的增强子元件(序列如SEQ ID NO：12所示)。

图2为载体pVRC2000结构示意图，载体元件说明见图1说明。

图3为载体pDRVISV1.0结构示意图，载体元件说明见图1说明。

图4为pVRC2000-gag和pDRVISV1.0-gag构建示意图，载体元件说明见图1说明。

图5为pDRVISV1.0的EcoRV和EcoRI酶切鉴定图，1泳道为分子量标记DL15000；2泳道为分子量标记DGL2000；3泳道为pDRVISV1.0的EcoRV和EcoRI酶切产物。

图6为pVRC2000-gag的EcoRV和SalI酶切鉴定图，1-3泳道为非正确克隆子的EcoRV和SalI酶切产物；4泳道为正确克隆pVRC2000-gag的EcoRV和SalI酶切产物；5泳道为分子量标记DGL2000；6泳道为分子量标记DL15000。

图7为pDRVISV1.0-gag的EcoRV和SalI酶切鉴定图，1泳道为分子量标记DL15000；2泳道为正确克隆子pDRVISV1.0-gag的EcoRV和SalI酶切产物；3-4泳道为非正确克隆子的EcoRV和SalI酶切产物。

图8为表示pVRC2000-gag和pDRVISV1.0-gag诱导的Gag特异性IgG抗体按终末稀释法进行ELISA检测结果的图表，抗体滴度为几何均值，其中pDRVISV1.0-gag诱导的抗体滴度为1∶38018.9，pVRC2000-gag诱导的抗体滴度为1∶19054.6。

图9为表示pVRC2000-gag和pDRVISV1.0-gag诱导的IgG亚类滴度的图表，其中IgG2a/IgG1的比值为pDRVISV1.0-gag∶1.5；pVRC2000-gag∶1.7。

图10为表示HIV-1 CN54 Gag蛋白刺激免疫小鼠脾细胞后分泌IFN-γ和IL-4情况的图表，其中IL-4均低于试剂盒检测水平，IFN-γ的分泌水平为(pg/ml)∶pDRVISV1.0-gag∶375.5；pVRC2000-gag∶174.5。

图11为表示HIV-1 CN54 Gag CD8⁺T细胞特异性表位肽刺激免疫小鼠脾细胞后，经细胞内染色，流式细胞仪检测分泌IFN-γCD8⁺T细胞的图表，其中HIV-1 CN54 Gag特异性CD8⁺T细胞占CD8⁺T细胞总数的比例分别为(％)：pDRVISV1.0-gag∶3.00；pVRC2000-gag∶0.68。

转化了质粒pCRScript-gpnef的大肠杆菌DH5α/pCRScript-gpnef于2003年09月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(中国，北京，中关村)，保藏号为CGMCC No.1003。

转化了质粒pVRC2000的大肠杆菌Top10/pVRC2000于2004年01月09日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(中国，北京，中关村)，保藏号为CGMCC No.1088。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明进行详细的描述，但本领域的技术人员应理解，下述实施例是意图解释本发明，而不应以任何形式理解为意图限制本发明的范围。

本实验所使用的实验材料：pVRC2000是由美国国立卫生研究院疫苗研究中心Gary Nable教授惠赠的DNA疫苗载体，其结构见图2，携带该载体的大肠杆菌保藏在CGMCC，保藏号为1088。携带遗传密码优化的HIVB’/C重组毒株CN54gag基因的质粒pCRScript-gpnef由本实验室和德国雷根斯堡大学微生物研究所共同构建，转化该质粒的大肠杆菌DH5α/pCRScript-gpnef已保藏在CGMCC，保藏号为1003。Pyrobest DNAPolymerase高可信度高温聚合酶和dNTP混合物为Takara公司产品；T4DNA连接酶为New England Biolabs公司产品；各种限制性内切酶均为Takara公司产品；琼脂糖(Agarose)、低熔点琼脂糖、十二烷基硫酸钠(SDS)均为GIBCO BRL公司产品；酵母粉，胰蛋白胨为Amersham公司产品；2-巯基乙醇(2-ME)、丙烯酰胺和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺为Fluka公司产品；Tris碱、高分子量标准蛋白为Promega公司产品；质粒小量提取试剂盒E.Z.N.A.Plasmid Miniprep KitI为Omega公司；凝胶回收试剂盒E.Z.N.A.Gel Extraction Kit为Omega公司；PCR产物纯化试剂盒E.Z.N.A Cycle-Pure Kit为Omega公司产品；Lipofectin2000质粒转染试剂盒为Invitrogen公司产品；用于制备无内毒素质粒DNA的试剂盒Qiagen Giga Endo-Free Prep kit为Qiagen公司产品；小鼠IFN-γ和IL-5 ELISA试剂盒为晶美公司产品；大肠杆菌Top10为Invitrogen公司产品；哺乳动物细胞株293T为Invitrogen公司产品；293T培养于含10％胎牛血清的DMEM培养液中(购于GIBICO公司)，37℃培养；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG购自北京中山公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG1和辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG2a为Sigma公司产品；6-8周龄体重18-25克的BALB/c(H-2d)雌性小鼠购自中国药品生物制品检定所，每组5只，清洁级饲养。

实施例1：DNA疫苗载体pDRVISV1.0的构建

采用PCR技术和亚克隆技术相结合的方法，将72bp单拷贝SV40增强子序列插入到pVRC2000CMV启动子上游，构建成质粒pDRVISV1.0(构建流程参见图1)。具体构建过程如下。

以质粒pVRC2000为模板，用引物5’SV40-CMV1(5’-ggagcctggggactttccacacccattaccgccatgttgacattg-3’(SEQ IDNO：1))和3’SV40-CMV-SacI(5’-aacagtatagcatgcataagagccaaag-3’(SEQ ID NO：2))进行PCR扩增，得到的PCR产物命名为SV40-CMV1。本反应实际上是在CMV启动子上游引入72bp单拷贝SV40增强子的部分序列(ggagcctggggactttccacacc(SEQ ID NO：3))，经1％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒回收特异条带DNA(约750bp)。PCR反应体系为：

           10×Pyrobest Buffer                 5μl

           dNTP混合物(各2.5mM)                 5μl

            5’SV40-CMV1(50μM)                   0.5μl

            3’SV40-CMV-SacI(50μM)               0.5μl

            质粒pVRC2000                          0.5μl

            Pyrobest DNA Polymerase(5U/ml)        0.5μl

            ddH₂O                                38μl

反应条件为：94℃预变性2min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共4个循环；94℃30s，68℃30s，共35个循环；循环结束后72℃保温7min，然后4℃恒温。

以SV40-CMV1为模板，用引物5’SV40-CMV2(5’-tgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttcc-3’(SEQID NO：4))和3’SV40-CMV-SacI(5’-aacagtatagcatgcataagagccaaag-3’(SEQ ID NO：5))进行PCR扩增，PCR产物命名为SV40-CMV2。该反应实际上是通过引物5’SV40-CMV2引入72bp单拷贝SV40增强子的第二部分序列(tgcatgctttgcatacttctgcctgctgg(SEQ ID NO：6))，同上经1％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒回收特异条带DNA(约780bp)。PCR反应体系为：

         10×Pyrobest Buffer                    5μl

         dNTP混合物(各2.5mM)                    5μl

         5’SV40-CMV2(50μM)                    0.5μl

         3’SV40-CMV-SacI(50μM)                0.5μl

         PCR产物SV40-CMV1                       0.5μl

         Pyrobest DNA Polymerase(5U/ml)         0.5μl

         ddH₂O                                 38μl

反应条件为：94℃预变性2min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共4个循环；94℃30s，68℃30s，共35个循环；循环结束后72℃保温7min，然后4℃恒温。

以PCR产物SV40-CMV2为模板，用引物5’SV40-CMV3-EcoRI(5’-ggaattctggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctg-3’(SEQID NO：7))和3’SV40-CMV-SacI(5’-aacagtatagcatgcataagagccaaag-3’(SEQ ID NO：8))进行PCR扩增，PCR产物命名为SV40-CMV3。本反应实际上是通过引物5’SV40-CMV2引入了72bp单拷贝SV40增强子的第三部分序列(tggttgctgactaattgaga(SEQ ID NO：9))，同时在5’端引入EcoRI限制性酶切位点。PCR产物SV40-CMV3经1％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒回收纯化(约810bp)。PCR反应体系为：

          10×Pyrobest Buffer                    5μl

          dNTP混合物(各2.5mM)                    5μl

          5’SV40-CMV3-EcoRI(50μM)              0.5μl

          3’SV40-CMV-SacI(50μM)                0.5μl

          PCR产物SV40-CMV2                       0.5μl

          Pyrobest DNA Polymerase(5U/ml)         0.5μl

          ddH₂O                                 38μl

反应条件：94℃预变性2min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共4个循环；94℃30s，68℃30s，共35个循环；循环结束后72℃保温7min，然后4℃恒温。

以质粒pVRC2000为模板，用引物3’PVRC-EcoRI(5’-ggaattcttggacatgagccaatataaatgtac-3’(SEQ ID NO：10))和5’PVRC-SacI(5’-tcgctattaccatggtgatgcgg-3’(SEQ ID NO：11))进行PCR扩增，PCR产物(约4.3kb)命名为pDRVISV1.0-B。PCR反应体系为：

         10×Pyrobest Buffer                    5μl

         dNTP混合物(各2.5mM)                    5μl

         3’PVRC-EcoRI(50μM)                   0.5μl

         5’PVRC-SacI(50μM)                    0.5μl

         质粒pVRC2000                           0.5μl

         Pyrobest DNA Polymerase(5U/ml)         0.5μl

         ddH₂O                                 38μl

反应条件为：94℃预变性2min；94℃30s，68℃5min，共35个循环；循环结束后72℃保温7min，然后4℃恒温。

用Takara公司的限制性内切酶EcoRI和SacI对PCR产物SV40-CMV3和pDRVISV1.0-B分别进行双酶切。

反应体系为：

          10×BufferM                         5μl，

          EcoR I                              2μl

          Sac I                               2μl

          SV40-CMV3(或PDRVISV-1.0-B)          20μl

          ddH₂O                              21μl

反应条件为37℃水浴反应5小时

酶切产物用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure Kit进行纯化回收。用Biolab公司的T4 DNA Ligase对酶切回收产物SV40-CMV3和pDRVISV1.0-B进行连接。

反应体系为：

          10×Buffer                          1μl

          T4 DNA Ligase                       1μl

          SV40-CMV3                           5μl

          PDRVISV-1.0-B                       3μl

反应条件为16℃反应4小时。

连接产物转化大肠杆菌Top10感受态。从转化平板上挑取8个菌落接种于5ml含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡过夜。碱裂解法提取质粒，限制性内切酶EcoRI和EcoRV酶切鉴定，筛选正确重组子(结果如图5所示，正确克隆应该得到大小分别为1664kb和3359kb的两条带)。得到的正确重组质粒命名为pDRVISV1.0。

反应体系为：

          10×BufferM                          5μl，

          EcoRI                                2μl

          EcoRV                                2μl

          待鉴定质粒                           20μl

          ddH₂O                               21μl

反应条件为37℃水浴反应5小时。

DNA疫苗载体pDRVISV1.0与pVRC2000的区别在于前者在CMV启动子上游引入了72bp的SV40单拷贝增强子样序列(tggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacc(SEQ ID NO：12))，并引入EcoRI限制性酶切位点。

实施例2：重组DNA疫苗pVRC2000-gag和pDRVISV1.0-gag的构建

以gagwt5SalI(5’-acgcgtcgacgccgccaccatggccgccagggccagcatc-3’(SEQ ID NO：13))和gags3EcoRV(5’-acgtgatatctcactggctgctggggtcgttgcc-3’(SEQ ID NO：14))为引物，通过PCR从质粒pCRScript-gpnef上扩增得到HIV-1 CN54gag基因(约1.5kb)，SalI和EcoRV双酶切定向克隆入DNA疫苗载体pVRC2000和pDRVISV1.0，得到重组DNA疫苗pVRC2000-gag和pDRVISV1.0-gag，其构建过程参见图4。

PCR反应体系为：

         10×Pyrobest Buffer                   5μl

         dNTP混合物(各2.5mM)                   5μl

         gagwt5SalI(50μM)                     0.5μl

         gags3EcoRV(50μM)                     0.5μl

         pCRScript-gpnef                       0.5μl

         Pyrobest DNA Polymerase(5U/ml)        0.5μl

         ddH₂O                                38μl

反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s，60℃30s，72℃2min，共4个循环；94℃30s，68℃2min，共35个循环；循环结束后72℃保温7min，然后4℃恒温。

用限制性内切酶SalI和EcoRV分别酶切鉴定pVRC2000-gag和pDRVISV1.0-gag(正确的重组质粒酶切后应产生大小分别约为5kb和1.5kb的两个片段)，鉴定结果正确(图6和图7)。反应体系及反应条件分别为：

反应体系

          10×BufferH                           5μl

          EcoRV                                 2μl

          SalI                                  2μl

          pVRC2000-gag                          20μl

        ddH₂O                             21μl

反应条件：37℃水浴反应5小时

反应体系

        10×BufferH                        5μl

        EcoRV                              2μl

        SalI                               2μl

        pDRVISV1.0-gag                     20μl

        ddH₂O                             21μl

反应条件：37℃水浴反应5小时

实施例3：pVRC2000-gag和pDRVISV1.0-gag免疫接种后所诱导的体液和细胞免疫反应的比较

用Qiagen Giga Endo-Free Prep kit制备DNA疫苗pVRC2000-gag、pDRVISV1.0-gag和空DNA疫苗载体质粒DNA，分别溶于生理盐水，配成浓度为1g/l的质粒溶液。实验组每组5只小鼠(n＝5)，并设空载体对照和空白对照各5只。采用双侧后腿胫骨前肌注射方法，DNA疫苗免疫组和载体对照组小鼠注射100g/100l质粒DNA，空白对照组注射100l生理盐水。初次免疫后间隔2周以同样剂量加强免疫3次。第8周时眼眶采血获取血清，然后脱颈椎处死，取脾脏，制成单细胞悬液(6×10⁵细胞/ml)。

ELISA检测小鼠血清中HIV-1 Gag特异性抗体，具体检测过程如下：a)将纯化Gag抗原蛋白(购于北京万泰公司)溶于包被液(0.06M NaHCO₃，0.02％NaN₃，pH9.6)中，配成0.5ug/ml的溶液，向每个孔中加入200μl，置冰箱4℃过夜；

b)将包被液倒掉，用PBST(含0.05％Tween-20的1xPBS)洗三遍，每次5分钟；

c)向每孔加入200μl PBST-BSA(含1％BSA的PBST，BSA购于基因公司)封闭，37℃2小时；

d)将封闭液倒掉，晾干，用封板胶纸密封，4℃保存待用。

e)用PBST将一抗(即免疫后小鼠血清)做2倍梯度稀释，从1∶100起稀释至1∶284800(即，1∶100，1∶200，1∶400……1∶284800)，向每孔加入200μl，每个样品重复2~3个孔，37℃1-2小时；

f)用PBST洗三遍；

g)用PBST或PBST-BSA适当稀释(1∶5000)二抗羊抗鼠IgG抗体(HRPO)；向每孔加入200μl，

h)37℃1-2小时；

i)用PBST洗三遍，将孔控干；

j)配制底物溶液(邻苯二胺0.4mg/ml)，然后加入0.1μl/ml的30％的H₂O₂，混匀后向每孔中加200μl，室温放3-10分钟.

k)加入50μl的4M H₂SO₄终止反应，室温放5--10分钟.

l)测450nm处的O.D.值。

结果如图8所示，pVRC2000-gag和pDRVISV1.0-gag均诱导了高水平的特异性抗体，pDRVISV1.0-gag所诱导的抗体水平是pVRC2000-gag诱导的抗体水平的大约两倍。空载体和阴性对照组均未测到特异性抗体。

定量ELISA对抗体的亚类分析显示两种载体诱导的抗体主要是IgG2a，参见如图9。实验过程同上，只是将二抗分别换为羊抗鼠IgG1抗体(HRPO)羊抗鼠IgG2a抗体(HRPO)。

用纯化Gag抗原(购于北京万泰公司)刺激小鼠脾细胞(细胞浓度5×10⁶/ml，Gag浓度10μg/ml)。用1640培养基(购自Gibico公司)调各组免疫小鼠的脾细胞数为1×10⁶细胞/毫升。具体刺激条件如下：

a)96孔微量滴定板中每孔加入2×10⁵细胞，每实验组设3个复孔。总体积为200μl/孔。

b)对应孔中分别加入原核表达纯化抗原P55(购自北京万泰公司)至终浓度为10μg/ml。

c)37℃5％CO₂孵箱内培养3天，收集上清液测量细胞因子水平

72小时后用购于晶美公司的试剂盒检测培养上清中IFN-γ和IL-4，评价Gag特异性细胞免疫水平。结果显示，pDRVISV1.0-gag免疫组分泌的IFN-γ水平明显高于pVRC2000-gag免疫组，但IL-4均低于试剂盒检测水平(10pg/ml)，参见如图10。两种载体诱生的IgG均以IgG2a为主，刺激免疫后小鼠脾细胞分泌的细胞因子主要为IFN-γ，提示主要诱生Th1型免疫反应。

用Gag特异性表位肽(从赛百盛公司合成)(SIRIGPGQTFYATGD(SEQ IDNO：15)，5μg/ml)刺激小鼠脾淋巴细胞(6×10⁵/ml)，细胞内IFN-γ抗体染色，用流式细胞仪(购自Beckman公司)检测Gag特异性CD8⁺T细胞占总CD8⁺T细胞的比例。具体实验过程如下：

1).刺激细胞：

a)根据需要调细胞浓度为4×10⁶细胞/ml(即2×10⁶细胞/500μl/孔)，所用细胞培养液完全1640购自Gibico公司。

b)配制阳性对照刺激物——取PMA(phorbol myristate acetate，佛波酯，购于赛百盛公司)使用液(0.1mg/ml溶于DMSO)和Ionomycin(伊屋诺霉素，购于赛百盛公司)使用液(0.5mg/ml溶于乙醇)溶于含有20μg/ml rIL-2(购于赛百盛公司)的1640完全培养液，配制2倍阳性对照刺激物溶液(PMA和Ionomycin浓度分别为50ng/ml和2μg/ml)。

c)配制多肽刺激物——用含有20μg/ml rIL-2的1640完全培养液配制Gag特异性表位肽刺激液(肽终浓度为5μg/ml)。

d)按下表每孔分别加入脾脏细胞及刺激物(DMSO含量限制在10μl/ml)：

e)37℃5％CO₂培养1小时。

f)加入BFA(Brefeldin A，蓝菌素，购于赛百盛公司)，终浓度10μg/ml(2μl/ml，5mg/ml的DMSO储存液)。

g)37℃5％CO₂培养5小时

h)放置4℃或直接染色。

分组脾脏细胞  PMA+  Ionomycin  多肽  1640完  全培养  基  总计阴性对照500μl(2×10⁶细胞/孔)  500μl  1000μl阳性对照500μl(2×10⁶细胞/孔)  500μl  1000μl样品500μl(2×10⁶细胞/孔)  500μl  1000μl    同种    型500μl(2×10⁶细胞/孔)500μl 1000μl

2).细胞染色及流式细胞仪检测

a)将培养物转入1.5ml Eppendorf离心管，450g 4℃离心7分钟。

b)倒掉培养基，加入1ml染色缓冲液FACS缓冲液(PBS+2％FCS(胎牛血清)+2％NaN₃)洗涤一次

c)450g 4℃离心7分钟，小心吸掉上清。

d)加入100μl含CD⁸/APC，CD⁴/PerCP及CD³/PE标记抗体(购于Pharmingen公司)的FACS缓冲液中，通常每种抗体含量为2μl/孔(可用FACS缓冲液配成使用液(使用液浓度40μg/ml)后分装到各管)，轻轻混匀。

e)4℃避光放置15分钟。

f)加入1ml FACS缓冲液洗涤细胞，450g 4℃离心7分钟，小心吸掉上清。

g)加入100μl的Reagent A(固定剂，购于Caltag公司)重悬细胞。

h)室温避光放置15分钟。

i)加入1ml FACS缓冲液洗涤细胞，450g 4℃离心7分钟，小心吸掉上清。

j)重悬于50μl含γIFN/Fitc标记抗体(购于Pharmingen公司)的Reagent B(穿膜剂，购于Caltag公司)中(抗体含量为2μl/孔，可用Reagent B配成使用液(使用液浓度40μg/ml)后分装到各管)，轻轻混匀。同种型对照加入抗大鼠的γIFN/Fitc抗体(购于Pharmingen公司)。

k)室温避光放置15分钟。

1)加入1ml FACS缓冲液洗涤细胞，450g 4℃离心7分钟，小心吸掉上清。

m)用500μl的固定液(FACS缓冲液+1％甲醛)重悬细胞，准备检测。

n)流式仪检测，FACS计数100,000点。

结果(见图11)表明，pDRVISV1.0-gag免疫所诱导的Gag特异的CD8⁺T细胞反应(Gag特异的CD8+T细胞占CD8+T细胞总数的3.00％)显著高于pVRC2000-gag免疫所诱导的Gag特异的CD8⁺T细胞反应(Gag特异的CD8+T细胞占CD8+T细胞总数的0.68)。

综合动物实验结果，SV40增强子元件显著增强了DNA疫苗的免疫原性，可以作为优化DNA疫苗的元件。

                             序列表

<110>中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心

<120>携带SV40增强子元件的DNA疫苗载体

<130>I040002

<160>15

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>45

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

ggagcctggg gactttccac acccattacc gccatgttga cattg               45

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

aacagtatag catgcataag agccaaag                                28

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ggagcctggg gactttccac acc                                     23

<210>4

<211>47

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

tgcatgcttt gcatacttct gcctgctggg gagcctgggg actttcc           47

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

aacagtatag catgcataag agccaaag                                   28

<210>6

<211>29

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

tgcatgcttt gcatacttct gcctgctgg                                  29

<210>7

<211>48

<212>DNA

<213>人工合成

<400>7

ggaattctgg ttgctgacta attgagatgc atgctttgca tacttctg             48

<210>8

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成

<400>8

aacagtatag catgcataag agccaaag                        28

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>9

tggttgctga ctaattgaga                                 20

<210>10

<211>33

<212>DNA

<213>人工合成

<400>10

ggaattcttg gacatgagcc aatataaatg tac                  33

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<400>11

tcgctattac catggtgatg cgg                             23

<210>12

<211>72

<212>DNA

<213>人工合成

<400>12

tggttgctga ctaattgaga tgcatgcttt gcatacttct gcctgctggg gagcctgggg    60

actttccaca cc                                                        72

<210>13

<211>40

<212>DNA

<213>人工合成

<400>13

acgcgtcgac gccgccacca tggccgccag ggccagcatc                          40

<210>14

<211>34

<212>DNA

<213>人工合成

<400>14

acgtgatatc tcactggctg ctggggtcgt tgcc                                34

<210>15

<211>15

<212>PRT

<213>人工合成

<400>15

Ser Ile Arg Ile Gly Pro Gly Gln Thr Phe Tyr Ala Thr Gly Asp

1               5                   10                  15