利用远缘杂交创造核果类果树新种质的三级放大法

摘要

本发明提供克服核果类果树远缘杂交不亲和性及远缘杂种不育性的系统方法，即三级放大法：父本花粉用强度为434KVm

说明书

(一)技术领域

植物育种及生物技术领域。

(二)背景技术

在植物育种过程中，利用亲缘关系较远的种、属间进行远缘杂交，如李与杏的杂交，比种内品种间的常规有性杂交，可产生更加丰富的遗传变异，不仅是种质创新的有效途径之一，而且在物种的形成、演化及系统发育等生物学问题的研究上，具有重要的理论意义。但在植物长期的进化过程中，形成了各种隔离机制，远缘杂交难度很大，遇到的第一个障碍就是远缘杂交的不亲和性，主要表现为：①花粉在异种植物的柱头上不能萌发；②或虽能萌发，但花粉管生长缓慢，或花粉管太短，不能进入子房到达胚囊；③或花粉管虽然进入子房，到达胚囊，但不能受精，或只有卵核或极核发生单受精，从而导致不能得到杂交种子。遇到的第二个障碍就是远缘杂种的不育(孕)性，主要表现为：①受精后的幼胚不发育，发育不正常或中途停止；②胚乳发育不正常，致使杂种胚部分或全部死亡；③种子不能发芽，或虽能发芽，但幼苗早期天亡；④杂种植株不能正常开花结实。因此，远缘杂交的不亲和性及杂种的不育性是导致植物远缘杂交育种进展缓慢的主要原因，同时也是急待研究解决的重要问题。

果树的远缘杂交育种研究虽然已有几十年的历史，但多数研究报道主要是比较了桃、李、杏等核果类果树远缘杂交的亲和性(坐果率)，如何进一步采取一些措施，利用现代高新技术克服远缘杂交的不亲和性及杂种的不育性方面的系统研究，报道甚少。因此，探讨克服远缘杂交不亲和性和杂种不育性的有效方法，创造新品种、新种质，对丰富果树种质资源的遗传多样性，选育优新品种等具有重大意义。

(三)发明内容

本发明提供克服核果类果树远缘杂交不亲和性和远缘杂种不育性的系统方法，即将物理手段、有性杂交、组织培养及分子生物学技术科学集成的三级放大法。

本发明通过如下技术措施实现：①父本花粉用原光斑直径7mm的氦氖激光处理8min或强度为434.78KVm^-1的负高压平板静电场处理30min，以自交亲和或自然坐果率高的种或品种作母本，在铃铛花期用处理后的花粉授粉，可有效地克服远缘杂交的不亲和性，提高远缘杂种的坐果率(一级放大)；②在授粉后的3～5周，杂种胚大量败育前对杂种幼胚进行胚抢救，即通过组织培养技术，以获得更多的远缘杂种胚培苗(二级放大)。用于李树幼胚萌发及生长的培养基配方为MS+BA 2mgL^-1+IAA 0.3mgL^-1，樱桃幼胚萌发及生长的培养基配方为1/2MS+BA 2mgL^-1+IAA 1mgL^-1+Vc 10mgL^-1；③研究并建立杂种胚培苗多丛芽再生技术体系，扩大每个杂种胚培苗(基因型)的个体数量，保证每个杂种胚培苗能在田间定植后有一定的成活苗，防止因杂种胚培苗的中途死亡而导致的基因型丢失(三级放大)。用于李杂种胚培苗多丛芽诱导及增殖的培养基配方为MS+BA 1.5mgL^-1+IAA0.3mgL^-1，生根培养基配方为1/2MS+IAA 0.8mgL-1；樱桃杂种胚培养多丛芽诱导及增殖的培养基配方为1/2MS+BA 2mgL^-1+IAA 1mgL^-1+NAA 0.1mgL^-1+Vc 10mgL^-1，生根培养基配方为1/2MS+IBA 0.2mgL^-1+Vc 10mgL^-1；④用随机扩增的多态性DNA测定(RAPD)对杂种胚培苗进行早期鉴定，以确定其杂种遗传性状。

利用研制的上述方法，目前已将李×杏、杏×李及欧洲甜樱桃×中国樱桃等核果类果树的一批远缘杂种胚培苗定植于大田，其中欧洲甜樱桃与中国樱桃的远缘杂种是国内外首次获得。进一步丰富了核果类果树种质资源的遗传多样性，为进一步选育优新品种奠定了基础。同时也证明了所研制的三级放大法是十分有效的。

(四)附图说明

图1：利用远缘杂交创造核果类果树新种质流程图

图1中，1是父本花粉的采集及贮藏；2是采集到花粉分别用氦氖激光、负高压平板静电场处理，处理后的花粉放置在低温干燥器内保存备用；3是用处理过的花粉进行人工授粉，并于授粉后2-5周调查杂种胚败育情况；4是杂种果实的采集及幼胚接种培养；5是分别取已萌发并且生长良好的胚培苗转接到多丛芽及增殖培养基中；6是分别将多丛芽梢转接到生根培养基中进行生根培养；7是经7-10天的炼苗后，移栽到温室花盆中，并进行RAPD早期鉴定；8是将杂种胚培苗定植到田间。

(五)具体实施方式

实施例：于春季果树铃铛花期采集充分发育成熟的花药(父本花期晚于母本的，要在温室提前催花)，去除花丝、花瓣及萼片等杂质，置18-20℃的室内阴干，收集花粉于干燥器内的小瓶中，将干燥器置于1-3℃冰箱内(1)；花粉用原光斑直径7mm的氦氖激光处理8min或强度为434.78KVm^-1的负高压平板静电场处理30min后，继续放置在1-3℃冰箱贮存备用(2)；选取树势健壮、生长结果正常的树作为杂交母树，采用连被去雄法去雄后(用“V”形去雄器或手指甲将花瓣、雄蕊及萼筒一次去掉)，用处理过的花粉进行人工授粉，挂牌标记，并于授粉后的2～5周及时调查杂种胚败育发生的时间(3)；然后于授粉后的2～5周，分期采集杂种果实，经30天的低温(1-4℃)处理，再经70％酒精灭菌1min，10％次氯酸钠灭菌10min后取幼胚接种到胚萌发及生长培养基中(4)，其中李树幼胚萌发及生长培养基配方为MS+BA 2mgL-1+IAA 0.3mgL^-1，樱桃幼胚萌发及生长培养基配方为1/2MS+BA 2mgL^-1+IAA 1mgL-1+Vc 10mgL^-1；经一定时期的培养后，取已萌发并且生长良好的胚培苗转接到多丛芽诱导及增殖培养基中，其中李杂种胚培苗多丛芽诱导及增殖培养基配方为MS+BA 1.5mgL^-1+IAA0.3mgL^-1，樱桃杂种胚培养多丛芽诱导及增殖培养基配方为1/2MS+BA 2mgL^-1+IAA 1mgL^-1+NAA 0.1mgL^-1+Vc10mgL^-1(5)；经多次继代增殖培养后，将多丛芽梢转接到生根培养基中进行生根培养，其中李树生根培养基配方为1/2MS+IAA 0.8mgL^-1，樱桃生根培养基配方为1/2MS+IBA 0.2mgL^-1+Vc 10mgL^-1(6)；待主根长1-3cm，并有一定侧根时，打开试管的封口棉塞，在室温(20℃左右)、直射阳光下炼苗7-10天后，从试管内取出小苗，将培养基洗净，移栽到上部为消毒沙、下部为营养土的花盆内，在温室内进行培养。注意加强光照、通风，及时浇营养液。然后取叶片提取DNA，进行RAPD早期鉴定(7)；根据RAPD的鉴定结果，将确系远缘杂种的胚培苗于早春(4月上旬)按2×3m(株行距)定植到大田选种圃(8)。