HIV多表位DNA疫苗及HIV复合多表位DNA疫苗

摘要

一种HIV多表位DNA疫苗和HIV复合多表位DNA疫苗，属于生物工程领域，特别是涉及一种HIV复合多表位DNA疫苗。本疫苗基因全长634bp，优选了HIV基因组中九个高度保守的免疫优势表位，一个HIV－1分离株共有抗体表位，另外加入了一个MHC非限制性的辅助性T淋巴细胞表位，各表位间用三个丙氨酸连接，同时在上述融合基因的中引入ER信号肽引导序列。以HIV－1CNB gag基因为模板，利用PCR方法获得全长693bp的HIV衣壳蛋白P24后插入权利要求1所述基因中，获得了以p24核心蛋白为载体分子的全新HIV复合多表位DNA疫苗。

说明书

技术领域：

本发明属于生物工程领域，特别是涉及一种HIV复合多表位DNA疫苗。

背景技术：

艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)在全球的迅速蔓延，已成为威胁人类最严重的病毒病之一。据联合国艾滋病规划署和WHO估计，AIDS从80年代初流行至2000年6月为止，全球累计5300多万人感染HIV或身患AIDS，其中约1880万人已经死亡。目前我国的HIV-1感染人数正呈加速上升趋势，在我国大陆的HIV感染人数已超过60万，到2010年可达1000万以上。1995年前，全球每天只有8000人感染艾滋病；但现在，这个数字已经到了每天15000人，这个数字的日益飚升，与这种疾病出现早期人们不重视疫苗的研究不无关系。目前HIV感染者的药物治疗费用每人每年需要1.2-5.0万美元，这样大的费用即使在发达国家亦难以承受，何况迄今为止尚未见有真正有效的治疗药物。因此，世界各国又一次将目标转向实用化AIDS疫苗的开发。国外投入了大量的资金和人力对艾滋病疫苗以及艾滋病毒的分子生物学和免疫学进行研究，希望早日遏止艾滋病在世界范围内尤其是发展中国家不断加速的蔓延趋势。为尽快控制艾滋病在我国的快速蔓延，98年底国务院(国发[1998]38号)签发了四部委(卫生部，国家科委，科技部和财政部)制定的《中国预防与控制艾滋病中长期规划(1998-2010)》，提出2010年研制出针对我国艾滋病病毒流行株的疫苗并完成临床试验。

HIV全病毒灭活后制备的灭活疫苗，由于残留的HIV核酸可能具有感染性，作为免疫原接种予人，危险性很大。而在过去开发的HIV基因工程疫苗大多为亚单位疫苗(gp160、gp120、p24、p55)和多肽疫苗(V3、C4-V3)，但造价高，抗感染免疫效果不佳。在大肠杆菌、沙门氏菌(表达env)、结核杆菌(表达V3)、酵母等系统表达的蛋白不能被忠实地加工，常用于制作诊断制剂而不适于用作疫苗研究。因此人们普遍寄希望于基因工程活载体疫苗和巨分子亚单位疫苗，以期诱导机体产生坚强的细胞免疫和体液免疫，可寄希望于新型HIV治疗性疫苗。到目前为止，人们已利用多种病毒系统，例如，昆虫的杆状病毒(gp160、gp120、p24、p55、gag-V3)、腺病毒、痘苗病毒、金丝雀痘病毒等表达了HIV的结构基因，以期制备第三代基因工程重组疫苗，其中包括治疗和预防用疫苗。已进入I、II、III期临床试验、且有望成为疫苗的有：HIV重组鸡痘病毒(表达env)进入I期临床试验，HIV重组痘苗病毒(表达env、env-pol、gag-pol-env)将进入II期临床试验，HIV重组金丝雀痘病毒(表达gag-pol-env)将进入III期临床试验，DNA疫苗(表达env-rev、gag-pol、gag-pol-rev)将进入II、III期临床试验。Gag蛋白是HIV的主要结构蛋白之一。由于Gag蛋白氨基酸序列相对保守，抗原变异较少，使用Gag蛋白作为AIDS疫苗，有可能克服Env蛋白不能有效抵抗异源变异病毒株攻击的缺陷。此外，Gag蛋白还有一个重要特点即自我装配功能，它能在病毒的其他成分缺失，甚至在自身序列不完整时，自我装配成病毒样粒子，在细胞膜表面出芽成熟。这对于构建巨分子颗粒化抗原十分必要，因而Gag蛋白成为疫苗研究的新热点。目前正在通过对核心蛋白(Gag)、Gag-Pol(聚合酶)、Gag-Env和Gag-Pol-Env的表达研究，以求制备HIV巨分子颗粒化疫苗和HIV巨分子重组活载体疫苗。

新型疫苗的研究必须有新的战略，在详尽研究病毒分子结构极其生物功能，分析病毒抑制宿主免疫应答的分子，激活宿主免役细胞产生保护性免疫应答(中和抗体及CTL)的分子，从而在病毒基因水平上进行人工剪切修饰及组合，去除抑制免疫应答的组分，保留诱导编码不同的保护性片段，重建成人工疫苗，则可提高免疫效果，抑制病毒突变的免疫逃逸。以抗原表位为基础的DNA疫苗即具备了上述特点。抗原表位是抗原中诱生特异性免疫应答的最基本的结构和功能单位。表位疫苗只把证明可以诱导免疫反应的抗原部分(表位，epitope)用作免疫原(candidate vaccine/vaccine，候选疫苗/疫苗)，去除了免疫无关、免疫抑制及免疫病理等序列。

近几年来，发现AIDS、结核及乙型肝炎等一些慢性疾病的持续性感染中，应用其治疗性疫苗后，可有效调动机体的免疫应答，增强天然免疫力，在控制感染方面发挥重要作用，从而使得疫苗在治疗方面的作用受到人们的广泛关注，成为当前病毒研究的热点。虽然治疗性疫苗在应用上有其局限性，但对某些慢性感染、持续性感染、周期性复发性疾病、肿瘤等的治疗，以及作为某些传染病的辅助治疗，控制微生物感染和提高机体免疫应答能力上，还是有着广阔的发展前景。治疗性疫苗与预防性疫苗相比，不但在免疫机理上不同，且各有其特点，前者的接种对象大多是持续性慢性感染者，或无症状的带毒者，且机体的免疫应答能力低下；后者的接种对象则是广大的易感的健康群体，免疫应答能力正常。另外，二者在组成成分上有所不同，治疗性疫苗不像预防性疫苗那样仅为保护性抗原成分，而是根据需要，对治疗性疫苗的成分作各种最佳组合，且十分强调佐剂的作用。治疗性疫苗是用高度纯化的微生物抗原及能提高机体免疫力的其它成分组合而成，所以其免疫原性强，对免疫系统有较强的刺激作用，且可通过不同途径把微生物抗原提呈给免疫系统，诱导机体免疫力的产生，并可打破免疫耐受，提高机体自身对病原微生物的特异性免疫应答等。另外，导致这些慢性疾病的病原微生物又多为胞内寄生性，免疫物质难以发挥作用，患者的细胞介导免疫(CMI)又多发生缺陷，注射疫苗后，则可通过改善机体的免疫状态，刺激恢复特异性CMI应答，达到根除病原，防止疾病复发的目的。

核酸疫苗是最近几年从基因治疗研究领域发展起来的一种全新疫苗，有些核酸疫苗不仅能高效诱导免疫应答，而且有明显的治疗作用。随着对核酸疫苗免疫机制认识的不断深入和对核酸疫苗结构及免疫方法的不断改进，这种新型疫苗必将成为有效的治疗性疫苗。DNA疫苗接种后，蛋白质抗原在宿主细胞内表达，其加工处理过程与病原的自然感染过程相似。因此，可以表达出与病原体相似的抗原。同时，两者的抗原提呈过程亦相同，因而，可以与自然感染一样诱导接种动物既产生细胞免疫又产生体液免疫。这是灭活疫苗和亚单位疫苗所不能比拟的。另外，DNA疫苗引发的免疫应答持久。由于外源基因可以在体内存在较长时间，并不断表达外源蛋白，可以有效持续刺激免疫系统。

技术内容：

本发明提供一种HIV多表位DNA疫苗及HIV复合多表位DNA疫苗。

HIV多表位DNA疫苗基因全长634bp，优选了HIV基因组中九个高度保守的免疫优势表位，一个HIV-1分离株共有抗体表位，另外加入了一个MHC非限制性的辅助性T淋巴细胞表位，各表位间用三个丙氨酸连接，同时在上述融合基因的中引入ER信号肽引导序列；其序列为：

Met Gly Met Gln Val Gln Ile Gln Ser Leu Phe Leu Leu Leu Leu

  1             5                   10                   15

Trp Val Pro Gly Ser Arg Gly Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val

                20                  25                   30

Thr Ile Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala

                35                  40                   45

Gly Gly Gly Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Ala Ala Ala Gln Tyr

                50                  55                   60

Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Gly Ser

                65                  70                   75

Asp Ile Ser Arg Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Ala Ala

                80                  85                   90

Ala Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ala Ala Ala Asp Arg Val Ile Glu

                95                  100                 105

Val Val Gln Gly Ala Tyr Arg Ala Ile Arg Ala Ala Ala Arg Ile

                110                 115                 l20

Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Ala Ala Ala Pro Leu Thr

                125                 130                 135

Phe Gly Trp Cys Tyr Lys Leu Ala Ala Ala Arg Gly Pro Asp Arg

                140                 145                 150

Pro Glu Gly Ile Glu Glu Glu Gly Gly Glu Arg Asp Arg Asp Arg

                155                 160                 165

Ser Ala Ala Ala Val Leu Glu Trp Arg Phe Asp Ser Arg Leu Ala

                170                 175                 180

Ala Ala Val Ile Tyr Gln Tyr Met Asp Asp Leu

                185                 190

HIV复合多表位DNA疫苗，是以HIV-1CNB gag基因为模板，利用PCR方法获得全长693bp的HIV衣壳蛋白P24后插入上述基因中，获得了以p24核心蛋白为载体分子的全新HIV复合多表位DNA疫苗；其序列为：

Met Gly Met Gln Val Gln Ile Gln Ser Leu Phe Leu Leu Leu Leu

1               5                   10                   15

Trp Val Pro Gly Ser Arg Gly Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val

                20                  25                   30

Thr Ile Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala

                35                  40                   45

Gly Gly Gly Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Ala Ala Ala Gln Tyr

                50                  55                   60

Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Gly Ser

                65                  70                   75

Met Tyr Pro Ile Val Gln Asn Leu Gln Gly Gln Met Val His Gln

                80                  85                   90

Pro Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu

                95                  100                 105

Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu

                110                 115                 120

Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Lys

                125                 130                 135

Val Gly Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile

                140                 145                 150

Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Leu His Pro Val His Ala

                155                 160                 165

Gly Pro Val Ala Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp

                170                 175                 180

Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met

                185                 190                 195

Thr Asn Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp

                200                 205                 210

Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr

                215                 220                 225

Cys Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp

                230                 235                 240

Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala Ser

                245                 250                 255

Gln Asp Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln Asn

                260                 265                 270

Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro Ala

                275                 280                 285

Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly

                290                 295                 300

Pro Ser His Lys Ala Arg Ile Leu Ala Glu Ser Arg Ala Met Gln

                305                 310                 315

Met Leu Lys Glu Thr Ile Ala Ala Ala Glu Leu Asp Lys Trp Ala

                320                 325                 330

Ala Ala Ala Asp Arg Val Ile Glu Val Val Gln Gly Ala Tyr Arg

                335           340           345

Ala Ile Arg Ala Ala Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu

                350                 355                 360

Lys Asp Ala Ala Ala Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Tyr Lys Leu

                365                 370                 375

Ala Ala Ala Arg Gly Pro Asp Arg Pro Glu Gly Ile Glu Glu Glu

                380                 385                 390

Gly Gly Glu Arg Asp Arg Asp Arg Ser Ala Ala Ala Val Leu Glu

                395                 400                 405

Trp Arg Phe Asp Ser Arg Leu Ala Ala Ala Val Ile Tyr Gln Tyr

                410                 415                 420

Met Asp Asp Leu

本发明的优点是：

1、本发明得到HIV复合多表位DNA疫苗为人工设计，在HIV表达产物中优选的高度保守的免疫优势T/B细胞表位基因，删除产生免疫抑制及免疫病理的基因序列。

2、本发明得到HIV复合多表位DNA疫苗引入了一个MHC非限制性的辅助性T淋巴细胞表位基因，增强了疫苗的细胞免疫及体液免疫水平。

3、本发明得到HIV复合多表位DNA疫苗基因的中引入ER信号肽引导序列，增强了疫苗的细胞免疫水平。

4、本发明得到HIV复合多表位DNA疫苗可诱导BALB/c小鼠产生针对所选表位及衣壳蛋白P24的特异性体液免疫和细胞免疫反应。

5、本发明得到HIV复合多表位DNA疫苗对实验动物是安全的，无任何病理现象出现。

6、本发明得到HIV复合多表位DNA疫苗的基因序列来自HIV-1B亚型中国流行株，该疫苗可作为我国治疗兼预防AIDS的DNA疫苗。

附图说明：

图1是本发明重组表达质粒pMD18-T-MEG的PCR鉴定结果

图2是本发明HIV多表位基因pVAXI-MEG的测序结果

具体实施方式：

1.HIV多表位基因的合成

1.1引物合成：

引物名：CAG218F1-F6；CAG218R1-R6

1.2 Taq酶聚合反应：

1.2.1 DNA链延伸反应：将上述合成的12条寡核苷酸片段中的F3和R6(frag.I-1)、F6和R3(frag.II-1)分别进行链延伸反应。

在Microtube中调制下列反应液

引物1(0.010D/μl)    5ul

引物2(0.010D/μl)    5ul

10×LA BUffer        10ul

dNTP                 16ul

H20                  63ul

94℃保温5分钟后，在10分钟内冷却至55℃，加入TaKaRa LA Taq酶1ul后，保温5分钟，72℃保温5分钟。

此反应液为DNA延伸液。

①如果DNA延伸液宣接进行克隆时：用DNA延伸液进行乙醇沉淀，然后溶于100ul的TE Buffer中(此溶液称为PCR Frag.溶液)。

②如果需要用DNA延伸液进一步进行PCR反应时，按下列条件进行PCR反应。    

1.2.2 PCR反应：分别取Frag.-I和Frag.-II反应产物各1μl，前者以F2和R5(frag.I-2)，后者以F5和R2(frag.II-2)为引物进行PCR反应，各引物加量光密度值均为0.01，反应体积100μl，PCR条件为：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，30个循环.再分别取Frag.I-2 FragII-2反应产物各1μl，前者以F1和R4(Frag.-I-3)，后者以F4和R1(frag.-II-3)为引物进行PCR反应，引物加量光密度值各0.01进行PCR反应，反应体积100μl，PCR条件为同前，再分别取Frag.I-3 FragII-3应产物各1μl，以F1和R1为引物进行PCR反应，反应体系及PCR条件为同前。反应产物用乙醇沉淀后溶解于200μlTE Buffer中。

将上述所得的PCR产物回收，纯化，用EcoRI及NotI双酶切后，与相同酶切的pBluescript II KS(十)载体连接。连接产物命名为pBluescript II KS-MEG。

1.2.3 DNA序列测定：

使用T3做为测序引物对上述连接产物进行序列测定。

2.大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)

以无菌接种环刮取冻存于-70℃冰箱的大肠杆菌菌种，划线接种于不含氨苄青霉素(Amp)的LB琼脂平板，37℃培养16h左右。挑取单一菌落，接种到100ml LB培养基中，37℃、250r/min振摇培养到OD600＝0.4~0.6，在无菌条件下将细菌培养液转移到两个无菌并以冰预冷的聚丙烯离心管中(以下操作均需无菌)，冰浴10min，使培养物冷却到0℃；4℃、2000r/min离心10min，弃上清，以10ml用冰预冷的75mmol/L CaCl2、10mmol/L(pH6.5)溶液重悬沉淀，冰浴10min，4℃，2000r/min离心10min，弃上清，以2ml用冰预冷的，含15％(v/v)甘油的75mmol/L CaCl2、10mmol/L Tris·Cl(pH6.5)溶液重悬每管沉淀，用无菌吸头将感受态细胞分装于无菌微量离心管中，每管200μl；标明菌株、体积和日期，置-70℃冰箱冻存备用。

3.转化

将适量质粒DNA(体积：质粒＜1μl，连接产物＜10μl，DNA＜50ng)加入200μl感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；42℃水浴热冲击90s，冰浴冷却2min；加入200μl 37℃预热的LB培养基，37℃150r/min振摇培养50min；取培养液涂布于含Amp(50μg/ml)的LB琼脂平板，37℃培养14~16h后，出现转化菌落。

4.质粒的提取

4.1质粒的小量制备(碱裂解法)

挑取单个转化菌落，接种到2ml含50μg/ml Amp的LB培养液(下同)中，37℃250r/min振摇培养12~16h；将1.5ml转入微量离心管中，12000r/min离心30s，弃上清。以200μl冰预冷的溶液I(50mmol/L葡萄糖；25mmol/L Tris·Cl，pH8.0；10mmol/L EDTA，pH8.0)重悬沉淀，加入200μl新配制的溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，颠倒数次混匀，加入200μl用冰预冷的溶液III(3mol KAc，5mol/L冰乙酸)，颠倒混匀，4℃ 12000r/min离心10min，取上清，分别用等量饱和酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，氯仿/异戊醇(24∶1)各抽提一次；加2倍体积冷无水乙醇，混合均匀，置-20℃30min，4℃12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用70％冷乙醇洗涤抽干。以20μl含终浓度20μg/ml RNA酶(无DNA酶)的TE(10mmol/L Tris·HCl，pH8.0，1mmol/L EDTA，pH8.0，下同)溶解沉淀，并于37℃水浴中作用30min，琼脂糖凝胶电泳检查或-20℃保存。

4.2质粒的大量制备与纯化

将含有目的质粒的细菌接种于100ml LB培养液中，37℃250r/min振摇培养16~18h；冰浴10min，4℃4000r/min离心10min，弃上清，沉淀用20ml预冷的特殊TE(STE，10mmol/L Tris·Cl，pH8.0；50mmol/L EDTA，pH8.0)洗涤一次，4000r/min离心10min，弃上清；用4ml预冷的溶液I重悬沉淀，加8ml新配的溶液II充分混匀，冰浴10min后，加6ml预冷的溶液III中止反应，冰浴10min，4℃ 7000r/min离心15min，取上清加0.6~0.7倍体积的异丙醇，37℃作用30min；4℃，7000r/min离心15min，弃上清，以适量TE(pH8.0)溶解沉淀后，加等体积的氯化锂(5mol/L)充分混匀，8000r/min离心10min；取上清，加2倍体积100％冷乙醇，-20℃30min，4℃12000r/min离心10min；弃上清，沉淀用70％冷乙醇洗涤并抽干。以适量TE(pH8.0)溶解沉淀，加无DNA酶的RNA酶(10mg/ml)至终浓度20μg/ml，37℃水浴30min；加等体积13％聚乙二醇溶液(PEG8000，2.5mol/L NaCl)，4℃静置过夜；4℃12000r/min离心10min，弃上清；加400μlTE(pH8.0)溶解沉淀，用等体积酚、酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)、氯仿/异戊醇(24∶1)各抽提一次，加0.1倍体积3MNaAC(pH5.2)，2倍体积100％冷乙醇，混匀后-20℃30min以上，4℃12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用70％冷乙醇洗涤并抽干，溶于适量TE(pH8.0)中，-20℃保存。

4.3质粒DNA的定量

以TE(pH8.0)为空白对照，用TZK-800Z型紫外可见分光光度计测定波长260nm和280nm下的核酸溶液光密度(OD)值。OD₂₆₀＝1相当于含质粒大约50μg/ml，双链DNA纯品的OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.8，如样品OD₂₆₀/OD₂₈₀值明显低于1.8，则可能有蛋白质或酚污染，需进一步纯化。

5.琼脂糖凝胶电泳

用0.5×TBE电泳缓冲液(0.045mol/L Tris-硼酸，0.001mol/L EDTA)配0.8-1.2％(w/v)琼脂糖凝胶溶液，加热至琼脂糖完全溶解后，加EB(10mg/ml)至终浓度0.5μg/ml；混匀倒入封固好的胶模中，插入相应的梳子，梳子距底板1.0mm左右，待凝胶完全凝固，小心移去梳子，将凝胶放入装有0.5×TBE电泳缓冲液的电泳槽中，取适量DNA样品在封口膜上与适量体积加样缓冲液(0.25％溴酚蓝、0.25％二甲苯青FF、40％蔗糖)混匀，用微量加样器将样品加到梳孔中，以5v/cm的电压电泳，当溴酚蓝电泳至适当位置，在长波紫外灯下观察结果和拍照。

6.DNA操作

6.1限制性内切酶酶切反应

单酶切反应：将1.0μg质粒DNA与适量水混匀，使其总体积为18μl，加入2-3单位限制性内切酶及1μl相应的10×限制性内切酶反应缓冲液，轻弹管壁混匀并离心，置最适反应温度水浴2~3h，琼脂糖凝胶电泳检查。对大量质粒DNA的酶切反应，相应扩大限制性内切酶用量和反应体积，取少量反应液电泳检查，完全酶切后，-20℃保存，以备进一步鉴定或回收片段之用。

双酶切反应：选择反应活性等于或接近100％的同一缓冲系统进行双酶切反应，若温度或缓冲系统不同，则按先低温后高温，先低盐后高盐的顺序进行；或第一酶切完成后，酚/仿抽提，乙醇沉淀后，再进行第二酶切反应。

6.2 DNA片段的回收

将酶切完全的含目的DNA片段的溶液与上样缓冲液混合，加入适当浓度的琼脂糖凝胶板中电泳至目的DNA片段完全分离，根据DNA片段大小选择下述方法回收DNA片段。

冻融法将含目的DNA片段的凝胶条置于微量离心管中，用玻棒捣碎，补加去离子水至50μl，加等量饱和酚振荡混匀，置液氮罐气相中10min，4℃12000r/min离心10min，回收上清。

低熔点琼脂糖法(Low melting point agarose，LMPA)  将目的DNA条带前沿切一沟，加入融化的LMPA，等其凝固后，继续电泳至目的DNA完全进入LMPA(用手提式长波紫外灯观察)，切下目的DNA条带，加适量TE，与含目的DNA的LMPA于65℃共温育使之融化。溶液冷却至室温后，加等量酚混合均匀，12000r/min离心10min，回收上清。

DEAE-81膜回收法

膜的活化：(1)10mmol/L EDTA(pH8.0)浸泡膜5min；(2)0.5mol/LNaOH浸泡膜5min；(3)灭菌双蒸水洗涤6次，于灭菌水中，4℃保存。

DNA的回收：当目的DNA泳至适当位置，将其前后琼脂糖上各切一口，插入适当大小、处理过的DEAE-81膜，继续电泳，用长波紫外灯观察到目的DNA全部吸附于膜上，拆膜。用低盐缓冲液(LSBF，50mmol/L Tris·Cl，pH8.0；0.15mol/L NaCl；10mmol/L EDTA，pH8.0)漂洗膜二次，并移膜至一Eppendorf管中，加入高盐缓冲液(HSBF，50mmol/L Tris·Cl，pH8.0；1mol/L NaCl；10mmol/L EDTA，pH8.0)充分混匀后，65℃温育30min；移上清液于另一Eppendorf管中，再往膜上加适量HSBF，65℃温育15min，检查膜上无DNA存留后，弃膜。合并二次HSBF，用酚、氯仿抽提，乙醇沉淀目的DNA，回收物溶于适量TE(pH7.6)，-20℃保存。

6.3外源DNA片段与质粒载体的连接反应

粘端连接：取0.5μg回收的载体DNA，加3~5倍摩尔量的外源DNA片段，2μl5×连接缓冲液加水定容至10ul，最后加入1 Weiss单位T₄ DNA连接酶，混匀并离心，16℃连接1~4h，取7μl连接反应液转化E.coli感受态细胞。

6.4重组子的酶切筛选和鉴定

将连接产物转化DH5α，37℃培养过夜。取单菌落接种于2ml AmpLB培养液中，小量制备质粒DNA。选择1~2种合适的限制性内切酶单独或组合消化，琼脂糖凝胶电泳分析。挑选酶切结果与预计相同者进一步用2种以上的内切酶消化，所有酶切结果均与预计完全相同者，即为目的重组质粒。

7.重组表达质粒的构建

用EcoRI和NotI双酶切pBluescript II KS-MEG，与用相同限制性内切酶双酶切的pVAXI载体片段相连接，构建成pVAXIIL-MEG重组表达质粒。

8.重组表达质粒的PCR鉴定

在Microtube中调制下列反应液

引物PMD18-T      (0.010D/μl)    0.5ul

引物PMD18-R      (0.010D/μl)    0.5ul

premix EX taq     25ul

H20               14ul

PCR反应条件为96℃ 10分钟后，94℃60秒，55℃ 30秒，72℃45秒，共30个循环，72℃延伸10分钟。

9.重组表达质粒转染哺乳动物细胞

2.2.1接种细胞：

将处于对数生长期的P815(小鼠的肥大细胞瘤细胞)和HeLa(人宫颈癌细胞)细胞。贴壁细胞用胰酶消化后，制备成3×10⁵/ml细胞悬液，于3cm细胞培养板上加入3ml细胞悬液，于37℃、5％CO2下培养过夜。

2.2.2转染：

取待转染质粒5-10ug，加入无血清1640培养基500ul混匀，温育30分钟，另取脂质体溶液(Lipofectamine)2mg/ml 10ul，加入无血清1640培养基500ul，混匀后温育30分钟，将上述两种溶液逐滴加入，吹气混匀，室温下静置30分钟后，加入转染的Hela细胞培养液中，37℃、5％CO2下培养孵育10-12小时后，补加3ml含10％FBS的1640细胞培养液，37℃、5％CO2下培养。

将获得的重组表达质粒感染P815(小鼠的肥大细胞瘤细胞)和HeLa(人宫颈癌细胞)细胞。于感染后48h收获细胞，检测目的蛋白的表达。

10.重组表达质粒表达产物的检测

10.1间接免疫荧光鉴定表达产物检测

在6×30mm培养板中放入盖玻片，传代培养P815和HeLa细胞。次日，在500ml无血清MEM中加入10mg欲转染的质粒，混匀。另取500ml无血清MEM，加入10ml转染试剂(Lipofectin Reagent)，混匀。将含有质粒的500ml MEM逐滴加入含有转染试剂的500ml MEM中，轻轻混匀，室温静置30分钟。将长成40％-60％单层BHK21细胞的培养液MEM吸出，用无血清MEM洗两次，加入上述含脂质体包裹的质粒的1ml MEM，于37℃、5％CO2感作16-18小时后补加3ml含5％小牛血清MEM，继续培养48小时。以上操作均需在无菌条件下进行。

取出盖玻片，PBS(pH7.2)漂洗一次，冷丙酮固定10-15分钟。PBS洗涤3次，与HIV-1阳性血清(1∶300)反应1.5小时，PBS洗涤3次，然后与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗人IgG反应1.5小时。PBS洗涤3次，在载玻片上滴一滴甘油缓冲液(50％甘油PBS)，将载有细胞的盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下，波长495nm处观察和拍照。

间接免疫荧光(IFA)检测显示，转染重组核酸疫苗质粒pVAXI-MEG-p24的BHK21细胞，在核周围及细胞浆中出现与特异性荧光抗体发生反应的黄绿色荧光，而对照质粒pVAXI转染的细胞看不到黄绿色荧光。结果说明，构建的核酸疫苗质粒表达了MEG-p24蛋白。

10.2免疫印迹(Western blot)

将转染重组核酸疫苗质粒pVAXI-MEG-p24的BHK21细胞、P815细胞和HeLa细胞用1ml TEN(40mmol/L Tris.Cl pH7.5、1mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl)洗脱，3000r/min离心5min，弃上清。沉淀细胞用50μl裂解缓冲液(10mmol/L Tris.Cl pH7.4、1mmol/L MgCl2、0.5％NP40、20μg/ml DNase I)裂解，冰水浴30min，5000r/min离心5min，加等量2×SDS上样缓冲液，沸煮3min，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。经SDS-PAGE分离蛋白后，将其电转移至硝酸纤维素膜上。5％脱脂乳或3％牛血清白蛋白缓冲液(10mmol/L Tris·Cl，pH7.5，150mmol/LNaCl，0.05％Tween20)37℃封闭2h，洗涤缓冲液(10mmol/L Tris·ClpH7.5，150mmol/L NaCl，0.05％Tween20)洗涤3次，每次5~10min，分别用中国人HIV-1阳性血清及鼠抗P24单克隆抗体用封闭缓冲液稀释(1∶300)覆盖膜上，室温感作2h，洗涤3~5次，碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG(1∶1000)室温感作2h，洗涤3~5次后，每次5~10min，用10ml碱性磷酸酶缓冲液(100mmol/L NaCl，5mmol/L MgCl₂，100mmol/LTris·Cl pH9.5)加入66μl NBT(0.5g NBT，70％二甲基甲酰胺)，混匀后再加33μl BCIP(0.5gBCIP，100％二甲基甲酰胺)，显色10~20min，用蒸馏水中止反应。结果证实，表达产物可以与中国人HIV-1阳性血清及鼠抗P24单克隆抗体发生反应，证明重组核酸疫苗质粒pVAXI-MEG-p24能在哺乳动物细胞得以成功地表达。

11.HIV复合多表位DNA疫苗的实验免疫研究

11.1核酸疫苗免疫小鼠

BALB/c雌性小鼠48只，体重18~20g，雌性，6～8周龄，属SPF(III)级动物，以上实验动物均具合格证书。随机分四组，分别注射空质粒pVAXI对照组、pVAXI-MEG-p24免疫组、pVAXI-MEG免疫组及pVAXI-p24免疫组。每只小鼠于双侧胫前肌直接注总容量为100μl(1μg/μl)的PBS质粒溶液。共免疫三次，第一次、第二次时间间隔为25天。第二次、第三次时间间隔为20天。最后一次免疫后第7天摘眼球取血，颈椎脱臼处死，凝血分离血清供ELISA检测抗HIV抗原的IgG抗体。无菌取其脾脏分别检测细胞毒性T细胞活性和用流式细胞仪分析T淋巴细胞亚类的数量。

1.2脾脏免疫学指标的检测

11.2.1脾脏单淋巴细胞悬液制备

断头处死小鼠，无菌条件下取出脾脏，置于盛有RPMI 1640培养基的平皿中，用玻片研磨，200目尼龙网过滤制成单细胞悬液，1500r/min，离心5min，弃上清。用Hanks液离心洗细胞两次，重悬于含10％NBS的RPMI 1640培养液中，计数，调至2×10⁷个/ml备用。

11.2.2脾T淋巴细胞亚类数量的检测

取脾细胞悬液0.1ml，加5ml PBS，1500 r/min，离心10min，洗细胞两次，在0.5ml PBS细胞悬浮液中分别加荧光标记大鼠抗小鼠CD3+、CD4+和CD8+单克隆抗体(此抗体用PBS按1∶10稀释)室温避光放置30min，再加5ml PBS洗一次，1500r/min离心10min，将管底细胞用200μl PBS悬浮，待上流式细胞仪检测。FACS检测10000个细胞，所得数据进行统计学处理。

结果，所有重组质粒免疫组pVAXI-MEG-p24免疫组、pVAXI-MEG免疫组及pVAXI-p24免疫组，其各组之间及与pVAXI对照组之间CD3+CD4+与CD3+CD8+的比值无显著差异，但所有重组质粒免疫组的CD4+和CD8+淋巴细胞数都显著高于空白质粒pVAXI对照组，说明所有重组质粒免疫小鼠后，均表达了外源蛋白，并诱导免疫鼠良好的免疫反应。

11.2.3脾细胞特异性CTL细胞毒活性检测

1)靶细胞的制备：

将H-2d限制性HIV识别表位多肽Arg Gly Pro Gly Arg Ala PheVal Thr Ile、

Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile、Asp Arg Val Ile Glu Val

Val Gln Gly Ala Tyr Arg Ala Ile Arg与P815细胞在37℃，5％CO2培养箱共孵育2h，制备成相应肽标记的靶细胞。

2)特异性CTL细胞毒活性检测：

将Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile、Ala Met GlnMet Leu Lys Glu Thr Ile、Asp Arg Val Ile Glu Val Val Gln GlyAla Tyr Arg Ala Ile Arg三种表位多肽及无关对照肽为体外刺激原，与小鼠的脾细胞于37℃，5％CO2培养箱共孵育2h，加入丝裂霉素C至终浓度为40mg/L，培养2h后用PBS洗涤细胞4次，以除掉丝裂霉素。制备成相应肽标记的刺激细胞。制备免疫小鼠的脾细胞悬液，调整细胞浓度至5×107个/ml。靶细胞和刺激细胞各1ml加入60mm细胞培养皿，补加2ml RPMI1640，培养24h后加入IL2至终浓度10u/ml，继续培养5天。2000r/min离心5min。沉淀以RPMI1640悬浮，调整细胞浓度至107个/ml。作为效应细胞。以乳酸脱氢霉释放法检测CTL反应。96微孔板上划分好样品、自然释放及最大释放孔，效靶细胞比例(E/T)为20∶1、50∶1、100∶1，每孔补加RPMI1640至200μl，每组设3个复孔，效靶细胞于37℃5％CO2共同孵育4h，取上清50μl，加入LDH作用底物50μl，室温、闭光反应30min后加50μl终止液终止反应，490nm下测吸光度，计算公式如下：

杀伤活性(％)＝(实验孔OD值-靶细胞自然释放孔OD值-效应细胞自然释放孔OD值)/(最大释放管孔OD值-靶细胞自然释放管孔OD值)×100％

结果表明，pVAXI-MEG-p24免疫组和pVAXI-MEG免疫组都产生了针对所选表位Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile、Ala MetGln Met Leu Lys Glu Thr Ile、Asp ArgVal Ile Glu Val Val Gln GlyAla Tyr Arg Ala Ile Arg的强CTL反应，与pVAXI对照组及不相关对照肽AGCKNFFWKTFTSC组相比，差异显著(P＜0.01)。针对表位ArgGly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile、Ala Met Gln Met Leu LysGlu Thr Ile、Asp Arg Val Ile Glu Val Val Gln Gly Ala Tyr ArgAla Ile Arg产生的CTL反应的强度分别为Ala Met Gln Met Leu LysGlu Thr Ile＞Asp Arg Val Ile Glu Val Val Gln Gly Ala Tyr ArgAla Ile Arg＞Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile，但三组之间没有显著差异。

11.3 ELISA试剂盒测定免疫小鼠血清中抗HIV抗体

ELISA试剂盒中的包被抗原为基因工程表达的HIV外膜及核心抗原，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体。在酶联免疫仪450nm测量各孔OD值，将酶标仪测得的OD450值进行统计学分析。

结果表明，pVAXI-MEG-p24免疫组及pVAXI-MEG免疫组抗体水平明显高于pVAXI对照组，差异显著(P＜0.01)；pVAXI-MEG-p24免疫组抗体水平高于pVAXI-p24免疫组，存在显著差异(P＜0.05)；pVAXI-MEG-P24免疫组的抗体水平明显高于pVAXI-MEG免疫组，二者存在极其显著的差异(P＜0.01)。综合比较pVAXI-MEG-P24免疫组的抗体水平在所有免疫组中是最高的。