公开/公告号CN1526719A
专利类型发明专利
公开/公告日2004-09-08
原文格式PDF
申请/专利权人 长春华普生物技术有限公司;
申请/专利号CN03119841.4
申请日2003-03-05
分类号C07H19/02;A61K31/706;A61K39/29;A61K39/205;A61K39/145;A61K39/12;A61P31/12;
代理机构11021 中科专利商标代理有限责任公司;
代理人程金山
地址 130061 吉林省长春市西安大路11号国联大厦1302室
入库时间 2023-12-17 15:30:37
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2023-03-21
专利权有效期届满 IPC(主分类):C07H19/02 专利号:ZL031198414 申请日:20030305 授权公告日:20081203
专利权的终止
2022-11-18
专利权人的姓名或者名称、地址的变更 IPC(主分类):C07H19/02 专利号:ZL031198414 变更事项:专利权人 变更前:华普生物技术(江苏)股份有限公司 变更后:华普生物技术(河北)股份有限公司 变更事项:地址 变更前:214142 江苏省无锡市新吴区长江南路35-501号301室 变更后:051430 河北省石家庄市高新技术产业开发区太行南大街769号A2栋7-9层
专利权人的姓名或者名称、地址的变更
2017-03-01
专利权人的姓名或者名称、地址的变更 IPC(主分类):C07H19/02 变更前: 变更后: 申请日:20030305
专利权人的姓名或者名称、地址的变更
2008-12-03
授权
授权
2006-04-26
实质审查的生效
实质审查的生效
2004-09-08
公开
公开
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发明领域
本发明涉及数种含CpG单链脱氧寡核苷酸，特别是涉及可增强狂犬疫苗、乙型肝炎疫苗、流感病毒疫苗和其它蛋白类疫苗免疫效果的含CpG单链脱氧寡核苷酸；以及这些含CpG单链脱氧寡核苷酸用于制备可增强狂犬疫苗、乙型肝炎疫苗、流感病毒疫苗和其它蛋白类疫苗免疫效果的生物制剂的用途。
发明背景
100多年前，Coley在世界上第一个开展了应用细菌提取物治疗细菌感染性疾病的实验，他得出结论：细菌的提取物是一种可以用于治疗传染性疾病的制剂。
1984年，Tokunaga T等发现从卡介苗(BCG)提取的DNA能抑制多种动物肿瘤的生长，具有激活人外周血单个核细胞和小鼠脾脏天然杀伤(NK)细胞的活性，诱导干扰素(IFN)的产生。非脊椎动物的DNAs有上述功能，脊椎动物和植物的DNA则不然，这些功能依赖于DNA分子中CpG结构(Tokunaga T，Antitumor activity of deoxyribonucleic acid fractionfrom Mycobacterium bovis BCG.I.Isolation，physicochemical characterization，and antitumor activity，JNCI，72：955.1984)。
CpG是由胞嘧啶和鸟嘌呤通过磷酸连接成的二核苷酸。C代表胞嘧啶，G代表鸟嘌呤，p代表磷酸，胞嘧啶位于5’端。多种具有CpG结构的细菌和病毒DNA对脊椎动物的免疫系统均为危险的信号，可激活多种免疫细胞启动对细菌和病毒的抵抗机制。近年来的研究表明，人工合成的含一个或多个CpG的寡核苷酸单链DNA(CpG ODN)也可表现强效的免疫增强和免疫调节作用。CpG ODN可强力增强B细胞、T细胞、NK细胞、抗原提呈细胞(单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞)和中性粒细胞的功能，表现出明显的临床应用前景(Weiner GJ，The immunobiology andclinical potential of immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotides.J LeukocBiol 2000 Oct；68(4)：455-63)。
由于序列，尤其是CpG两侧的序列的不同，CpG ODN可有多种多样的形式，表现不同性质、不同强度的免疫增强和免疫调节作用。CpG ODN可表现出种属依赖性，即对一种动物表现免疫增强功能的CpG ODN，在另一种动物或人则未必表现出同样的或等效的免疫增强功能(Kamstrup S，et al.Response of porcine peripheral blood mononuclear cells to CpG-containing oligodeoxynucleotides，Vet Microbiol 2001 Feb 26；78(4)352-62；Gunther Hartmann，et al.Delineation of a CpG PhosphorothioateOligodeoxynucleotide for Activating Primate Immune Responses In Vitro andIn Vivol The Journal of Immunology，2000，164：1617-1624)。
研究表明，某些CpG ODN有强效的免疫增强作用，可增强B细胞、T细胞、NK细胞、抗原提呈细胞(单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞)和中性粒细胞的功能，表现出明显的临床应用价值(Weiner GJ，Theimmunobiology and clinical potential of immunostimulatory CpGoligodeoxynucleotides.J Leukoc Biol 2000 Oct；68(4)：455-63)。Cynthia L.等证明，CpG ODN可明显增强重组乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的免疫效果(Cynthia L.et al.CpG DNA can induce strong Th1 humoral and cell-mediatedimmune responses against hepatitis B surface antigen in young mice.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.Vol.95，26，15553-15558，December 22，1998)。与HBsAg单独免疫相比，HBsAg和CpG ODN一起免疫BALB/c小鼠可使其抗HBsAg抗体的滴度增加5-到40-倍(Gunther Hartmann，et al.Delineation of a CpGPhosphorothioate Oligodeoxynucleotide for Activating Primate ImmuneResponses In Vitro and In Vivol The Journal of Immunology，2000，164：1617-1624)。
此外，CpG ODN可明显增强狂犬疫苗，流感嗜血杆菌疫苗，白喉-百日咳-破伤风疫苗以及其他蛋白类疫苗诸如呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗，口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus)疫苗，免疫缺陷病毒疫苗(HIV gp120)等许多疫苗的免疫效果，CpG ODN可明显增强外周血中单个核细胞增生以及表达CD19，促进TNF以及IL-6的表达。
发明内容
发明概述
本发明的目的之一是提供数种含CpG单链脱氧寡核苷酸，特别是可增强狂犬疫苗、乙型肝炎疫苗、流感疫苗和其它蛋白类疫苗免疫效果的含CpG单链脱氧寡核苷酸。它们由含一个或多个CpG的寡核苷酸单链DNA分子构成，其磷酸二酯键可以是部分硫化的，全部硫化的，也可以是未硫化的。
优选地，本发明的含CpG单链脱氧寡核苷酸具有SEQ ID NO：1-81所示的序列。
本发明的目的之二是提供含有本发明的含CpG单链脱氧寡核苷酸和狂犬疫苗、乙型肝炎疫苗、流感病毒疫苗和其它蛋白类疫苗的生物制剂。较之于普通的狂犬疫苗、乙型肝炎疫苗、流感疫苗和其它蛋白类疫苗，这些生物制剂的免疫效果有了明显的提高。
本发明的目的之三是提供本发明的含CpG单链脱氧寡核苷酸用于制备可增强狂犬疫苗、乙型肝炎疫苗、流感病毒疫苗和其它蛋白类疫苗免疫效果的生物制剂的用途。
另外，需要指出的是，在本申请的上下文的公开内容的基础上，本发明的其它具有实质性特点的方面和创造性的有益效果对本领域的普通技术人员来说是可以直接推知的。
附图简要说明
图1显示了CpG刺激外周血单个核细胞(48h)产生CD19的实验结果。
图2显示了CpG刺激外周血单个核细胞产生IL-6的实验结果。
具体实施方式
在本发明的上下文中，所使用的术语除非另外说明，一般具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。
本发明的数种含CpG单链脱氧寡核苷酸，特别是可增强狂犬疫苗、乙型肝炎疫苗、流感疫苗和其它蛋白类疫苗免疫效果的含CpG单链脱氧寡核苷酸由含一个或多个CpG的寡核苷酸单链DNA分子构成，其磷酸二酯键可以是部分硫化的，全部硫化的，也可以是未硫化的。优选地，本发明的含CpG单链脱氧寡核苷酸具有如下所示的序列：
101 5’-TcgTCgAgggCgCCggTgAC-3’
102 5’-TCgTCgCCggTgggggTgTg-3’
103 5’-TCgTCgTACgCAATTgTCTT-3’
104 5’-TCgCCTCgTCgCCTTCgAgC-3’
201 5’-TCgCCCACCggTgggggggg-3’
202 5’-TCgTCgCAgACCggTCTgggg-3’
203 5’-gggggACgTCgCCggggggg-3’
204 5’-ggATCCgTACgCATgggggg-3’
205 5’-TCgTCgCggCCggCgCCCCC-3’
206 5’-TCgTCgCggCCgCgAggggg-3’
301 5’-TCgTCgTTACCgATgACgTCgCCgT-3’
302 5’-TCgTCgggTgCgACgTCgCAgggggg-3’
303 5’-TCgTCgggTgCgACgATCgTCgggggg-3’
304 5’TCgTCgTTTgCATCgATgCAgTCgTCgTT-3’
305 5’-TCgTCgTTTgCATCgATgCAggggggg-3’
306 5’-ACCggTATCgATgCCggTgggggg-3’
307 5’-ggggTCCATgACgTTCCTgAAgggggg-3’
308 5’-TCgTCgTTTTgACgATCgTCgggggg-3’
309 5’-TTCgTCgTTTgATCgATgTTCgTTgggggg-3’
310 5’-TTCgTCgTTgTgATCgATgggggg-3’
311 5’-TATCgATgTTTTCgTCgTCgTTgggggg-3’
312 5’-TTCgTTgCATCgATgCATCgTTgggggg-3’
313 5’-TTCgCTTCgCTTTTCgCTTCgCTT-3’
601 5’-TCgAggACAAgATTCTCgTgC-3’
602 5’-TCgAggACAAgATTCTCgTgCAggCC-3’
603 5’-TCgTgCAggCCAACgAggCCg-3’
604 5’-ACCgCCAAggAgAAgCCgCAggAggg-3’
605 5’-TCgTTgCCgTCggCCC-3’
606 5’-TACAACggCgAggAATACC-3’
607 5’-TCggCACgCgACgTgCTggCCgTCgTTTCC-3’
608 5’-gTACAACggCgAggAATACCT-3’
609 5’-ACCgTCgTTgCCgTCggCCC-3’
610 5’-TgCTggCCgTCgTT-3’
611 5’-gTCggCACgCgACg-3’
612 5’-gTCggCACgCgACgggggg-3’
613 5’-gTCggCACgCgACgCCCCCC-3’
614 5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCCCCC-3’
615 5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCC-3’
616 5’-TCgTTgCCgTCggCCCCC-3’
617 5’-TCgTTgCCgTCggCCCC-3’
618 5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCCC-3’
619 5’-TCgTTgCCgTCgg-3’
620 5’-TCgTTgCCgTCggg-3’
621 5’-TCgTTgCCgTCgggg-3’
622 5’-TCgTTgCCgTCggggg-3’
623 5’-TCgTTgCCgTCgggggg-3’
624 5’-TCgTTgCCgTCggggggg-3’
625 5’-TCgTTgCCgTCgggggggg-3’
626 5’-TCgTTgCCgTCggggggggg-3’
627 5’-TCgAggACAAgATTCTCgT-3’
628 5’-TCCCgCTggACgTT-3’
629 5’-TCggCACgCgACgTgCTggCCgTCgTT-3’
631 5’-TCgTCgCgCCgTCACgggggg-3’
632 5’-TCgTgTgCgTgCCgTTggg-3’
633 5’-TCgTCgCCgTTgggCggg-3’
634 5’-TCgTCgACgTCgTTgggCggg-3’
635 5’-TCgCAgTTgTCgTAACgTTgggCggg-3’
636 5’-TTACCggTTAACgTTggCCggCC-3’
637 5’-ACCggTTAACgTTgTCCCCgggg-3’
638 5’-TCgTCgTTggTATgTT-3’
639 5’-TCgTCgTCgTCgTTgTCgTT-3’
640 5’-TCgTCgTCgTCgTTgTCgTTgggg-3’
641 5’-TCgTTCggggTgCCg-3’
642 5’-TCgTTCggggTAACgATT-3’
643 5’-TCgTTCggggTAACgTT-3’
644 5’-TCgTTCggggTACCgAT-3’
645 5’-TCgTTCggggTACCgATgggg-3’
646 5’-TCgTTgCgCTCCCATgCCgggggg-3’
647 5’-TCgTCgTTTCgTCgTTgggg-3’
648 5’-TCgTTgTCgTTTCgCTgCCggCggggg-3’
649 5’-CgTTgACgATCgTCCCATggCggg-3’
650 5’-TCTgCggCCTTCgTCg-3’
651 5’-TAgTAACCggTCCggCgCCCCC-3’
652 5’-TTgCAgCgCTgCCggTggg-3’
653 5’-TCgTACggCCgCCgTACggCggg-3’
654 5’-CggCCCATCgAgggCgACggC-3’
655 5’-TCgCgTCgACTCCCCTCgAgggg-3’
656 5’-TCgTCgTCgACTCgTggTCggggg-3’
657 5’-TCgggCgCCCgATCgggggg-3’
658 5’-TCgTCggTCTTTCgAAATT-3’
659 5’-TCgTgACgTCCTCgAgTT-3’
以上所述的序列可以是部分硫化的，全部硫化的，也可以是未硫化的。
本发明的CpG单链脱氧核苷酸可通过已知的方法生产，例如采用固相亚磷酰胺三酯法进行生产。以下的实施例详细地例举了一种生产本发明的CpG单链脱氧核苷酸的方法。
在这些含CpG单链脱氧寡核苷酸用于制备可增强狂犬疫苗、乙型肝炎疫苗、流感病毒疫苗和其它蛋白类疫苗免疫效果的生物制剂的用途中，含CpG单链脱氧寡核苷酸与狂犬疫苗、乙型肝炎疫苗、流感病毒疫苗和其它蛋白类疫苗的使用量的比例为1∶1-100∶1(摩尔比)。
本发明的含CpG单链脱氧寡核苷酸的使用方式包括与常规蛋白类疫苗、DNA疫苗混合使用，与常用的佐剂(如铝佐剂、弗氏佐剂等)联合应用来增强疫苗免疫效果、与常规蛋白类疫苗通过交联剂共价偶联使用；
免疫方式包括皮下应用、粘膜表面应用、肌肉应用、胃肠应用、腹腔应用等常用的免疫方式。
CpG单链脱氧寡核苷酸使用时间可为常规疫苗免疫前应用、与常规疫苗同时应用、常规疫苗免疫后应用。
在小鼠试验中CpG单链脱氧寡核苷酸的使用量为1-500微克/小鼠，如进行人体试验则按标准的换算方法进行换算。
下面结合具体的制备实施例和生物学效果实施例，并参照附图进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例
在如下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，例如合成采用固相亚磷酰胺三酯法、ELISA采用间接法。
在如下实施例中，所用试剂的来源、商品名和/或有必要列出其组成成分者，均只标明一次。在其后所用相同试剂如无特殊说明，不在赘述上述内容。
实施例1CpG单链脱氧核苷酸的制备(上海生工合成)
合成采用固相亚磷酰胺三酯法，合成方法(上海生工提供)如下：
材料和方法：
三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA)、可控多孔玻璃(Controlled PoreGlass)、DMT(二甲氧基三苯甲基)、四氮唑活化剂、乙酸酐、N-甲基咪唑、ABI DNA合成仪、高效液相色谱层析仪等。
A、T、C、G四种核苷酸单体：合成所用单体为核苷亚磷酰胺，是经过化学修饰的核苷酸，含下面几个功能基团：
1.3’位P上二异丙胺基，缩合所用的功能基
2.3’位P上晴乙基，保护基，合成完毕后脱去。
3.5’-Dmt，保护基，缩合前脱去。
4.A和C的杂环氨基上的苯甲酸保护基，合成完毕后脱去。
5.G上嘌呤环氨基上的异丙酰保护基，合成完毕后脱去。
具体的反应步骤如下：
一、脱保护基
用三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA)脱去连结在可控多孔玻璃(Controlled Pore Glass)上的核苷酸的保护基团二甲氧基三苯甲基(DMT)，获得游离的5’-羟基端，以供下一步缩合反应。
二、活化
将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3’-端已被活化，但5’-端仍受DMT保护)，此中间体将与可控多孔玻璃上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。
三、连接
亚磷酰胺四唑活性中间体遇到可控多孔玻璃上已脱保护基的核苷酸时，将与其5’-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。
四、封闭
缩合反应后为了防止连在可控多孔玻璃上的未参与反应的5’-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。
五、氧化
缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在可控多孔玻璃上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。
经过以上五个步骤后，一个脱氧核苷酸就被连到可控多孔玻璃的核苷酸上，同样再用三氯乙酸脱去新连上的脱氧核苷酸5’-羟基上的保护基团DMT后，重复以上的活化、连接、封闭、氧化过程即可得到一DNA片段粗品。最后对其进行切割、脱保护基(一般对A、C碱基采用苯甲酰基保护；G碱基用异丁酰基保护；T碱基不必保护；亚磷酸用腈乙基保护)、纯化(常用的有HAP，PAGE，HPLC，C18，OPC等方法)、定量等合成后处理即可得到符合实验要求的寡核苷酸片段。
未硫化的CpG单链脱氧核苷酸在ABI 3900 DNA合成仪上合成(上海生工生物技术服务有限公司)，而全硫化及部分硫化的CpG单链脱氧核苷酸的合成采用置换法，在ABI 394 DNA合成仪上合成(上海生工生物技术服务有限公司)。
实施例2CpG刺激人外周血单个核细胞增生实验
(一)人外周血单个核细胞的分离
1、试剂和材料：
肝素抗凝的人全血：长春市中心血站。
聚蔗糖-泛影葡胺：比重1.077±0.001，北京鼎国生物技术有限公司。
细胞培养常用的仪器设备：低温冰箱、二氧化碳孵箱、超净工作台、倒置显微镜、液氮罐、蒸馏水器、真空泵、细胞培养瓶、滤菌器、滤过瓶、各种规格的吸管、加样器、滴管、血球计数板、水平式离心机等。
RPMI1640培养液：
含L-谷氨酰胺的RPMI1640(GIBCOBRL) 10.4克
碳酸氢钠 2.0克
庆大霉素 10万单位
加三蒸水至体积1000毫升
0.22微米的滤膜真空泵抽滤除菌、分装。
小牛血清灭活：小牛血清(Invitrogen)-20℃取出，4℃冰箱融化后，56℃水浴30min。
10％小牛血清的RPMI1640：
灭活的小牛血清 10毫升
RPMI 1640培养液 90毫升
Hank’s液(无钙离子、镁离子)的配制：
氯化钠 8.0克
氯化钾 0.4克
磷酸氢二钠(带一个结晶水) 0.06克
磷酸二氢钾 0.06克
碳酸氢钠 0.35克
葡萄糖 1.0克
酚红 0.02克
加入双蒸水至1000毫升。
将上列成分混合后溶化，8磅15min灭菌，4℃冰箱保存。临用时用7.4％NaHCO3调pH至7.3～7.6。
2％台酚兰染色液：
台酚兰 2克
生理盐水 100毫升
2、方法：
肝素抗凝的人外周血缓慢沿管壁缓慢加于比重为1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺淋巴细胞分层液面上，分离液与外周血的比例约为2∶1。
水平离心机离心1,000xg 15-20min，离心后管内分为3层，用吸管吸取白色云雾层狭窄带，置入另一管中。
加入等倍或以上体积的Hank’s液(无血清)，800-1,000xg 10-15min，弃上清，加入Hank’s液，洗涤细胞两次。
末次离心后，弃上清，加入培养基2ml，重悬细胞。
取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板计数四个大方格内的细胞总数，单个核细胞浓度(细胞数/1毫升细胞悬液)＝4个大方格内细胞总数/4×104×2(稀释倍数)。
(二)3H-TDR掺入试验
1、器材和试剂
RPMI1640培养液：
含L-谷氨酰胺的RPMI1640(GIBCOBRL) 10.4克
碳酸氢钠 2.0克
庆大霉素 10万单位
加三蒸水至体积1000毫升
0.22微米的滤膜真空泵抽滤除菌、分装。
小牛血清灭活：小牛血清(Invitrogen)-20℃取出，4℃冰箱融化后，56℃水浴30min。
10％小牛血清的RPMI1640：
灭活的小牛血清 10毫升
RPMI 1640培养液 90毫升
TE缓冲液TE缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，HCl调节pH至7.0。高压灭菌，滤膜过滤)配制的CpG ODN
3H-TDR(25μl中含25μCi3H-TDR)
96孔板(平底)
Eppendorf管(0.5ml、1.5ml)
细胞收集器
液闪计数器
37℃ CO2孵箱
2、方法
用完全培养基调节人外周血单个核细胞(PBMC)至终浓度3×106个/ml。
将PBMC加到96孔板中，每孔100μl(3×105个/孔)，其中含终浓度为0.6μg/ml的硫代的CpG，每个CpG三复孔。
培养24-48小时后，每孔加入稀释后的3H-TDR(3H-TDR用完全培养基稀释至25μCi/ml)20μl，即每孔内含0.5μCi 3H-TDR，继续培养16-18d。
用细胞收集器收集细胞到滤纸上，60℃孵箱烘烤滤纸2-3h，将滤纸放入液闪瓶内，加入闪烁液，测cpm值
(三)实验结果(cpm值)：
阴性对照(未加CpG ODN)三个复孔的cpm值：574 544 390以下为各CpG ODN刺激组三个复孔的cpm值：
203：826 1450 1302
205：12514 10594 11006
302：7252 6630 6248
303：5284 5624 5396
305：2950 9136 10120
306：6770 3830 3844
307：1740 1718 1962
304：11524 13148 11574
310；10854 10210 10258
607：12406 15204 14110
608：3118 2446 2994
610：4228 4362 4624
619：2196 7738 7304
623：8598 8056 7576
631：6152 6688 6240
634：12038 12068 12478
639：4194 17894 17652
640：16078 16966 17026
645：12100 12424 11556
647：17022 14588 16372
654：5246 4272 5010
656：11704 12446 12378
657：4244 3910 4200
658：16206 16602 15506
659：4332 16392 16284
实施例3CpG ODN刺激人外周单个核细胞表达CD19
(一)人外周血单个核细胞的分离
1、试剂和材料：
肝素抗凝的人全血：长春市中心血站。
聚蔗糖-泛影葡胺：比重1.077±0.001，北京鼎国生物技术有限公司。
细胞培养常用的仪器设备：低温冰箱、二氧化碳孵箱、超净工作台、倒置显微镜、液氮罐、蒸馏水器、真空泵、细胞培养瓶、滤菌器、滤过瓶、各种规格的吸管、加样器、滴管、血球计数板、水平式离心机等。
RPMI1640培养液：
含L-谷氨酰胺的RPMI1640(GIBCOBRL) 10.4克
碳酸氢钠 2.0克
庆大霉素 10万单位
加三蒸水至体积1000毫升
0.22微米的滤膜真空泵抽滤除菌、分装。
小牛血清灭活：小牛血清(Invitrogen)-20℃取出，4℃冰箱融化后，56℃水浴30min。
10％小牛血清的RPMI1640：
灭活的小牛血清 10毫升
RPMI 1640培养液 90毫升
Hank’s液(无钙离子、镁离子)的配制：
氯化钠 8.0克
氯化钾 0.4克
磷酸氢二钠(带一个结晶水) 0.06克
磷酸二氢钾 0.06克
碳酸氢钠 0.35克
葡萄糖 1.0克
酚红 0.02克
加入双蒸水至1000毫升。
将上列成分混合后溶化，8磅15min灭菌，4℃冰箱保存。临用时用7.4％NaHCO3调pH至7.3～7.6。
2％台酚兰染色液：
台酚兰 2克
生理盐水 100毫升
2、方法：
肝素抗凝的人外周血缓慢沿管壁缓慢加于比重为1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺淋巴细胞分层液面上，分离液与外周血的比例约为2∶1。
水平离心机离心1,000xg 15-20min离心后管内分为三层，用吸管吸取白色云雾层狭窄带，置入另一管中。
加入等倍或以上体积的Hank’s液(无血清)，800-1,000xg 10-15min，弃上清，加入Hank’s液，洗涤细胞两次。末次离心后，弃上清，加入培养基2ml，重悬细胞。
取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板计数四个大方格内的细胞总数，单个核细胞浓度(细胞数/1毫升细胞悬液)＝4个大方格内细胞总数/4×104×2(稀释倍数)。
3、用流式细胞仪测定人外周血单个核细胞(PBMC)表达的CD19
1)用完全培养基调人外周血单个核细胞(PBMC)至终浓度3×106/ml。将PBMC加到96孔板中，每孔100μl(3×105个/孔)。
2)每孔加入硫代的CpG ODN，终浓度为0.6μg/ml，每种CpG ODN设三复孔。37℃5％ CO2培养24-48h。
3)将96孔板4℃ 1260转/分钟离心5min。
4)弃上清，以PBS缓冲液4℃ 1260转/分钟离心5min洗两次。
5)弃上清，以50微升PBS缓冲液重悬细胞。
6)每孔按1∶50加入异硫氰酸荧光素标记的CD19抗体，轻弹96孔板混匀。冰上避光孵育30min。
7)以PBS缓冲液4℃ 1260转/分钟离心5min洗两次。
8)以200μlPBS缓冲液重悬细胞，并移入测试管中，进行流式细胞仪(FACS)检测。结果如图1所示。
实施例4刺激外周血单个核细胞产生IL-6
(一)人外周血单个核细胞的分离
1、试剂和材料：
肝素抗凝的人全血：长春市中心血站。
聚蔗糖-泛影葡胺：比重1.077±0.001，北京鼎国生物技术有限公司。
细胞培养常用的仪器设备：低温冰箱、二氧化碳孵箱、超净工作台、倒置显微、液氮罐蒸馏水器、真空泵、细胞培养瓶、滤菌器、滤过瓶、各种规格的吸管、加样器、滴管、血球计数板、水平式离心机等。
RPMI1640培养液：
含L-谷氨酰胺的RPMI1640(GIBCOBRL) 10.4克
碳酸氢钠 2.0克
庆大霉素 10万单位
加三蒸水至体积1000毫升
0.22微米的滤膜真空泵抽滤除菌、分装。
小牛血清灭活：小牛血清(Invitrogen)-20℃取出，4℃冰箱融化后，56℃水浴30min。
10％小牛血清的RPMI1640：
灭活的小牛血清 10毫升
RPMI 1640培养液 90毫升
Hank’s液(无钙离子、镁离子)的配制：
氯化钠 8.0克
氯化钾 0.4克
磷酸氢二钠(带一个结晶水) 0.06克
磷酸二氢钾 0.06克
碳酸氢钠 0.35克
葡萄糖 1.0克
酚红 0.02克
加入双蒸水至1000毫升。
将上列成分混合后溶化，8磅15min灭菌，4℃冰箱保存。临用时用7.4％ NaHCO3调pH至7.3～7.6。
2％台酚兰染色液：
台酚兰 2克
生理盐水 100毫升
2、方法：
肝素抗凝的人外周血缓慢沿管壁缓慢加于比重为1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺淋巴
细胞分层液面上，分离液与外周血的比例约为2∶1。
水平离心机离心1,000xg 15-20min，离心后管内分为三层，用吸管吸取白色云雾层狭窄带，置入另一管中。
加入等倍或以上体积的Hank’s液(无血清)，800-1,000xg 10-15min，弃上清，加入Hank’s液，洗涤细胞两次。
末次离心后，弃上清，加入培养基2ml，重悬细胞。
取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板计数四个大方格内的细胞总数，单个核细胞浓度(细胞数/1毫升细胞悬液)＝4个大方格内细胞总数/4×104×2(稀释倍数)。
3、IL-6的测定
用完全培养基调节人外周血单个核细胞(PBMC)至终浓度3×106个/ml。
将PBMC加到96孔板中，每孔100μl(3×105个/孔)，其中含终浓度为0.6μg/ml的硫代的CpG ODN，每个CpG ODN，三复孔。培养24-48小时后，取上清测IL-6。
ELISA试剂盒(Quantikine R & D)测定IL-6的步骤：
(1)备齐各种试剂和标准品；
(2)每孔加入100ul RD1A试验稀释液；
(3)加入IL-6标准品或样品(即上清)100μl/孔，置室温孵育2h；
(4)甩干并以缓冲液洗4次；
(5)加入200μl/孔酶标抗体，置室温孵育2h；
(6)甩干并以缓冲液洗4四次；
(7)加入200μl/孔底物，置室温20min；
(8)加入50μl/孔终止液，450nm处读值，结果如图2所示。
实施例5增强狂犬疫苗免疫效果实验(病毒攻击法)
狂犬病疫苗增效试验(NIH法)
(1)实验材料
攻击毒株的制备攻击毒株CVS由卫生部中国药品生物制品检定所提供，启开冻干毒种稀释成10-2悬液，用体重11-13g小鼠脑内接种0.03ml连续传2-3代，收脑时选择4-5d出现典型狂犬病症状的小鼠，将鼠脑研磨加入适量含正常马血清或小牛血清蒸馏水制成20％悬液，1000r/min离心10min，用体重18-20g小鼠10只做病毒滴定，符合要求，分装小管，-60℃保存。标准狂犬疫苗由中国药品生物制品检定所提供
(2)实验步骤
狂犬疫苗分组：①狂犬疫苗(长春生物制品研究所提供)；②狂犬疫苗+AL(OH)3③CpG640(10微克/小鼠)+狂犬疫苗；④CpG647(10微克/小鼠)+狂犬疫苗；⑤CpG640(10微克/小鼠)+AL(OH)3+狂犬疫苗；⑥CpG647(10微克/小鼠)+狂犬疫苗+AL(OH)3。每组狂犬疫苗取5×、25×、125×三个稀释浓度。
标准狂犬疫苗：取25×、125×、625×三个稀释浓度。选用体重12-14g小鼠15只，每只腹腔接种0.5ml，间隔一周后再免疫一次，并预留40只同批小鼠用来测定攻击病毒的LD50。
攻击：小鼠第一次免疫后14d，预先测定毒株CVS的效力为每0.03ml含5-100×LD50病毒量。将病毒液按100、10-1、10-2、10-3稀释。然后用各个稀释度的病毒(0.03ml)分别对各组小鼠进行脑内攻击，每组10只小鼠。CpG+狂犬疫苗组15只小鼠。所有小鼠自攻击之日起观察14d，攻击后最初4日内死亡的小鼠不作统计，第5d后死亡和呈现典型脑病症状的小鼠进行计算统计。疫苗效力测定不低于2.5国际单位(IU)/剂为合格。结果见下表(表1-表8)。
表1狂犬疫苗(长春生物制品研究所)免疫效果
效力试验 疫苗(长春生物制品研究所)
免疫日期 1次免疫日期：2002.7.26 攻击日期：2002.8.09
2次免疫日期：2002.8.02. 判定日期：2002.8.23
组 疫苗浓 小鼠数 死亡日期及死亡数 14日 换算 ED50
别 度 生 死 生 死 死亡％
被 5× 15 71 91 13 2 30 2
检 25× 15 72 92 11 4 17 6 26.1
苗 125× 15 74 94 111 6 9 6 15 71.4
ED50＝1.4+(50-26.1)×0.7/(71.4-26.1)＝1.77
IU＝10(1.77-2.29)×6.7＝2.02
表2狂犬疫苗(长春生物制品研究所)+AL(OH)3组免疫效果
效力试验 疫苗(长春生物制品研究所)
免疫日期 1次免疫日期：2002.7.26 攻击日期：2002.8.09
2次免疫日期：2002.8.02. 判定日期：2002.8.23
组 疫苗浓 小鼠数 死亡日期及死亡数 14日 换算 ED50
别 度 生 死 生 死 死亡％
被 5× 15 91 14 1 34 1
检 25× 15 71 92 12 3 20 4 20
苗 125× 15 73 92 112 8 7 8 11 57.9
ED50＝1.4+(50-20)×0.7/(57.9-20)＝1.95
IU＝10(1.95-2.29)×6.7＝3.06
表3CpG640+狂犬疫苗(长春生物制品研究所)组免疫效果
效力试验 疫苗(长春生物制品研究所)
免疫日期 1次免疫日期：2002.7.26 攻击日期：2002.8.09
2次免疫日期：2002.8.02. 判定日期：2002.8.23
组 疫苗浓 小鼠数 死亡日期及死亡数 14日 换算 ED50
别 度 生 死 生 死 死亡％
被 5× 15 91 14 1 33 1
检 25× 15 71 91 13 2 19 3 13.6
苗 125× 15 74 94 111 6 9 6 12 66.7
ED50＝1.4+(50-13.6)×0.7/(66.7-13.6)＝1.88
IU＝10(1.88-2.29)×6.7＝2.60
表4CpG647+狂犬疫苗(长春生物制品研究所)组免疫效果
效力试验 疫苗(长春生物制品研究所)
免疫日期 1次免疫日期：2002.7.26 攻击日期：2002.8.09
2次免疫日期：2002.8.02. 判定日期：2002.8.23
组 疫苗浓 小鼠数 死亡日期及死亡数 14日 换算 ED50
别 度 生 死 生 死 死亡％
被 5× 15 91 14 1 32 1
检 25× 15 72 91 12 3 18 4 18.2
苗 125× 15 75 93 111 6 9 6 13 68.4
ED50＝1.4+(50-18.2)×0.7/(68.4-18.2)＝1.84
IU＝10(1.84-2.29)×6.7＝2.37
表5CpG640+狂犬疫苗(长春生物制品研究所)+AL(OH)3组免疫效果
效力试验 疫苗(长春生物制品研究所)
免疫日期 1次免疫日期：2002.7.26 攻击日期：2002.8.09
2次免疫日期：2002.8.02. 判定日期：2002.8.23
组 疫苗浓 小鼠数 死亡日期及死亡数 14日 换算 ED50
别 度 生 死 生 死 死亡％
被 5× 15 91 14 1 34 1
检 25× 15 91 111 13 2 20 3 13
苗 125× 15 73 94 111 7 8 7 11 61.1
ED50＝1.4+(50-13)×0.7/(61.1-13)＝1.94
IU＝10(1.94-2.29)×6.7＝2.99
表6CpG647+狂犬疫苗(长春生物制品研究所)+AL(OH)3免疫效果
效力试验 疫苗(长春生物制品研究所)
免疫日期 1次免疫日期：2002.7.26 攻击日期：2002.8.09
2次免疫日期：2002.8.02. 判定日期：2002.8.23
组 疫苗浓 小鼠数 死亡日期及死亡数 14日 换算 ED50
别 度 生 死 生 死 死亡％
被 5× 15 71 14 1 33 1
检 25× 15 71 91 111 12 3 19 4 17.4
苗 125× 15 73 94 111 7 8 7 12 63.2
ED50＝1.4+(50-17.4)×0.7/(63.2-17.4)＝1.90
IU＝10(1.90-2.29)×6.7＝2.73
表7标准苗(中国药品生物制品检定所)组免疫效果
效力试验 疫苗
免疫日期 1次免疫日期：2002.7.26 攻击日期：2002.8.09
2次免疫日期：2002.8.02. 判定日期：2002.8.23
组 疫苗浓 小鼠数 死亡日期及死亡数 14日 换算 ED50
别 度 (只) (dn) 生 死 生 死 死亡％
标 25× 15 71 91 13 2 26 2
准 125× 15 72 93 111 9 6 13 8 38.1
苗 625× 15 74 82 103 122 4 11 4 19 82.6
ED50＝2.1+(50-38.1)×0.7/(82.6-38.1)＝2.29
IU＝6.7
表8攻击毒测定结果
毒株CVS的效力 攻击日期：2002.8.09
判定日期：2002.8.23
组 病毒稀 小鼠数 死亡日期及死亡数 14日 换算 ED50
别 释度 (只) 生 死 生 死 死亡％
攻 100 10 710 0 10 0 24 1.91
击 10-1 10 7693 1 9 1 14 93.3
毒 10-2 10 7392 5 5 6 5 45.5
测 10-3 10 10 0 16 0
定
(3)结论
各组IU值如下：
表1狂犬疫苗组：2.02
表2狂犬疫苗+AL(OH)：3.06
表3CpG640+狂犬疫苗组：2.60
表4CpG647+狂犬疫苗组：2.37
表5CpG640+狂犬疫苗+AL(OH)：2.99
表6CpG647+狂犬疫苗+AL(OH)：2.73
从各组结果中可以看出，除了第1组(狂犬疫苗组IU＝2.02)和第4组(CpG647+狂犬疫苗组IU＝2.37)IU＜2.5之外，其余各组IU均大于2.5，证明CpG ODN确实可以增强狂犬疫苗的免疫效果。
在狂犬疫苗的稀释度为25倍稀释时各组受试小鼠的死亡率分别为：
表1狂犬疫苗组：26.1
表2狂犬疫苗+AL(OH)：20
表3CpG640+狂犬疫苗组：13.6
表4CpG647+狂犬疫苗组：18.2
表5CpG640+狂犬疫苗+AL(OH)：13
表6CpG647+狂犬疫苗+AL(OH)：17.4
上述结果表明CpG640、CpG647对狂犬疫苗有增效作用。
实施例6增强狂犬疫苗免疫效果实验(抗体检测法)
一、实验动物及分组：
70只7周龄昆明种小鼠，体重20±2克，随机分为14组，每组5只，分笼饲养，免疫前先适应2天。
二、免疫途径及剂量：
1-13组小鼠：肌肉注射1μg重组狂犬疫苗(长春生物制品研究所)/100μl PBS加10μg CpG ODN，分两点注射，即双后肢肌肉每点注射50μl。
14组：肌肉注射1μg重组重组狂犬疫苗(长春生物制品研究所)/100μlPBS，(无CpG ODN)，分两点注射，即双后肢肌肉每点注射50μl。
三、免疫程序：
于0、21d免疫，第二次免疫后7d经尾动脉采血，每只小鼠分离10ul血清，直接检测抗体滴度或置-20℃冻存。
四、抗体效价的测定(间接法ELISA)
试剂器材：
包被缓冲液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6)：
Na2CO3 1.59克
NaHCO3 2.93克
加蒸馏水至1000毫升
洗涤缓冲液(PBS-T)：含0.05％吐温-20，pH7.4
K2HPO4 0.2克
Na2HPO4·12H2O 2.9克
NaCl 8.0克
KCl 0.2克
Tween-20 0.5毫升
加蒸馏水至1000ml
样品稀释液：
牛血清白蛋白(BSA) 0.1克
加洗涤缓冲液至100毫升
封闭液(2％BSA)：
牛血清白蛋白(BSA) 2克
加PBS(pH7.4)至100毫升
底物缓冲液(磷酸-柠檬酸缓冲液，pH＝5.0)：
●甲液(0.1mol/L柠檬酸)
柠檬酸 1.92克
加蒸馏水至100毫升
●乙液(0.2mol/L Na2HPO4)
Na2HPO4·12H2O 7.17克
加蒸馏水至100毫升
取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加蒸馏水至100毫升
四甲基联苯胺溶液(TMB)：2毫克/毫升
TMB 10毫克
乙醇 5毫升
底物溶液：
底物缓冲液 10毫升
TMB(2毫克/毫升) 0.5毫升
30％H2O2 10微升
终止液：
浓H2SO4 22ml
蒸馏水 178ml
步骤
1.包被：用包被缓冲液稀释狂犬疫苗(中国长春生物制品研究所提供)至1-10微克/毫升，加入酶标板，100ul/孔，4℃，过夜。
2.洗涤：用洗涤缓冲液洗板3次，5min/次。
3.封闭：加入2％BSA封闭，200ul/孔。37℃，1.5h。
4.洗涤：用洗涤缓冲液洗板3次，5min/次。
5.加样：将待测血清用样品稀释液做400倍稀释，100ul/孔。空白对照孔加样品稀释液，100ul/孔，每个样品设3个复孔。37℃，60min。
6.洗涤：用洗涤缓冲液洗板3次，5min/次。
7.加酶标抗体：将兔抗鼠IgG-HRP(北京鼎国生物0.1ml，1∶1000)用洗涤缓冲液稀释500倍，100ul/孔，37℃，60min。
8.洗涤：用洗涤缓冲液洗板3次，5min/次。
9.显色：加入底物溶液，100ul/孔。室温避光反应10-30min。
10.终止：50ul/孔2M H2SO4。
11.酶标仪(BIO-RAD Model 550)测A450。
五、结果
1-13组小鼠(肌肉注射1μg狂犬病毒疫苗/100μl PBS加10μg CpG ODN)14组小鼠(肌肉注射1μg狂犬病毒疫苗/100μl PBS)
1组(205)：1).0.576 0.566 0.587
2).0.682 0.618 0.657
3).0.510 0.538 0.566
4).0.656 0.751 0.715
5).0.658 0.689 0.611
2组(302)：1).0.775 0.734 0.691
2).0.759 0.790 0.719
3).0.630 0.615 0.626
4).0.688 0.657 0.663
5).0.943 0.847 0.899
3组(304)：1).0.824 0.834 0.810
2).0.681 0.658 0.615
3).0.619 0.647 0.656
4).0.607 0.634 0.612
5).0.787 0.768 0.754
4组(310)：1).0.645 0.674 0.652
2).0.749 0.690 0.724
3).0.775 0.784 0.732
4).0.644 0.674 0.646
5).0.688 0.693 0.648
5组(607)：1).0.723 0.719 0.747
2).0.702 0.635 0.697
3).0.818 0.787 0.800
4).0.790 0.786 0.691
5).0.890 0.831 0.817
6组(634)：1).0.754 0.699 0.658
2).0.655 0.606 0.677
3).0.727 0.787 0.719
4).0.693 0.685 0.732
5).0.556 0.588 0.543
7组(639)：1).0.976 0.919 0.923
2).0.768 0.717 0.699
3).0.886 0.876 0.832
4).1.012 1.007 1.188
5).0.868 0.839 0.861
8组(640)：1).0.819 0.836 0.822
2).0.670 0.625 0.611
3).1.283 1.186 1.005
4).1.366 1.212 1.266
5).0.975 0.980 0.931
9组(645)：1).0.876 0.827 0.834
2).0.925 0.898 0.953
3).0.732 0.744 0.712
4).0.850 0.824 0.833
5).0.689 0.723 0.756
10组(647)：1).0.968 0.978 0.951
2).0.983 0.982 1.002
3).0.988 0.980 0.985
4).1.179 1.280 1.214
5).1.006 0.979 0.980
11组(656)：1).0.682 0.672 0.656
2).0.796 0.752 0.743
3).0.658 0.686 0.619
4).0.615 0.597 0.637
5).0.687 0.690 0.711
12组(657)：1).0.778 0.729 0.710
2).0.628 0.710 0.699
3).0.676 0.667 0.701
4).0.635 0.721 0.677
5).0.690 0.682 0.735
13组(658)：1).0.673 0.667 0.712
2).0.615 0.710 0.694
3).0.834 0.876 0.887
4).0.870 0.818 0.823
5).0.673 0.685 0.655
14组(659)：1).1.327 1.289 1.017
2).0.968 0.972 0.991
3).1.117 1.276 0.991
4).0.860 0.874 0.870
5).0.886 0.816 0.854
15组(对照)：1).0.477 0.423 0.456
2).0.506 0.497 0.486
3).0.399 0.401 0.435
4).0.455 0.427 0.417
5).0.368 0.398 0.406
背景值：0.332 0.287 0.319
上述结果表明，1-13组内抗体效价都明显高与对照组，其中以第7组(CpG ODN 639)，第8组(CpG ODN 640)，第10组(CpG ODN 647)，第14组(CpG ODN 659)抗体滴度升高最明显。
实施例7增强乙型肝炎疫苗的免疫效果实验
一.实验动物及分组：
156只7周龄昆明种小鼠，体重20±2克，随机分为26组，每组6只，分笼饲养，免疫前先适应2d。
二.免疫途径及剂量：
1-25组小鼠：肌肉注射1μg重组HBsAg(中国长春生物制品研究所提供)/100μl PBS加10μg CpG ODN，分两点注射，即双后肢肌肉每点注射50μl。
26组：肌肉注射1μg重组HBsAg/100μl PBS，未加CpG ODN，分两点注射，即双后肢肌肉每点注射50μl。
三.免疫程序：
0d、21d免疫，第二次免疫后7天静脉采血，每只小鼠分离10ul血清，直接测抗体滴度或置-20℃冻存。
四、抗体效价的测定(间接法ELISA)
试剂器材：
包被缓冲液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6)：
Na2CO3 1.59克
NaHCO3 2.93克
加蒸馏水至1000毫升
洗涤缓冲液(PBS-T)：含0.05％吐温-20，pH7.4
K2HPO4 0.2克
Na2HPO4·12H2O 2.9克
NaCl 8.0克
KCl 0.2克
Tween-20 0.5毫升
加蒸馏水至1000ml
样品稀释液：
牛血清白蛋白(BSA) 0.1克
加洗涤缓冲液至100毫升
封闭液(2％BSA)：
牛血清白蛋白(BSA) 2克
加PBS(pH7.4)至100毫升
底物缓冲液(磷酸-柠檬酸缓冲液，pH＝5.0)：
●甲液(0.1mol/L柠檬酸)
柠檬酸 1.92克
加蒸馏水至100毫升
●乙液(0.2mol/L Na2HPO4)
Na2HPO4·12H2O 7.17克
加蒸馏水至100毫升
取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加蒸馏水至100毫升
四甲基联苯胺溶液(TMB)：2毫克/毫升
TMB 10毫克
乙醇 5毫升
底物溶液：
底物缓冲液 10毫升
TMB(2毫克/毫升) 0.5毫升
30％H2O2 10微升
终止液：
浓H2SO4 22ml
蒸馏水 178ml
步骤
1.包被：用包被缓冲液稀释HBsAg(中国长春生物制品研究所提供)至1-10微克/毫升，加入酶标板，100ul/孔，4℃，过夜。
2.洗涤：用洗涤缓冲液洗板3次，5min/次。
3.封闭：加入2％BSA封闭，200ul/孔。37℃，1.5h。
4.洗涤：用洗涤缓冲液洗板3次，5min/次。
5.加样：将待测血清用样品稀释液做400倍稀释，100ul/孔。空白对照孔加样品稀释液，100ul/孔，每个样品设3个复孔。37℃，60min。
6.洗涤：用洗涤缓冲液洗板3次，5min/次。
7.加酶标抗体：将兔抗鼠IgG-HRP(北京鼎国生物0.1ml，1∶1000)用洗涤缓冲液稀释500倍，100ul/孔，37℃，60min。
8.洗涤：用洗涤缓冲液洗板3次，5min/次。
9.显色：加入底物溶液，100ul/孔。室温避光反应10-30min。
10.终止：50ul/孔2M H2SO4。
11.酶标仪(BIO-RAD Model 550)测A450。
四、结果
1-25组小鼠：(肌肉注射1μg重组HBsAg/100μl PBS加10μg CpGODN)
1组(203)：1).0.562 0.573 0.575
2).0.581 0.573 0.570
3).0.580 0.580 0.576
4).0.561 0.555 0.560
5).0.577 0.578 0.573
6).0.555 0.548 0.559
2组(205)：1).0.762 0.777 0.775
2).0.589 0.582 0.590
3).0.681 0.684 0.686
4).0.600 0.655 0.661
5).0.878 0.885 0.866
6).0.644 0.654 0.668
3组(302) 1).0.762 0.777 0.775
2).0.589 0.582 0.590
3).0.681 0.684 0.686
4).0.600 0.655 0.661
5).0.878 0.885 0.866
6).0.644 0.654 0.668
4组(303) 1).0.444 0.479 0.500
2).0.498 0.500 0.490
3).0.580 0.584 0.568
4).0.443 0.455 0.462
5).0.478 0.481 0.486
6).0.640 0.645 0.681
5组(305)：1).0.645 0.700 0.665
2).0.749 0.665 0.691
3).0.880 0.883 0.800
4).0.920 0.895 0.914
5).0.900 0.879 0.886
6).0.886 0.876 0.811
6组(306)：1).0.545 0.601 0.577
2).0.557 0.606 0.609
3).0.780 0.893 0.789
4).0.691 0.677 0.694
5).0.567 0.579 0.559
6).0.666 0.677 0.632
7组(307)：1).0.762 0.775 0.757
2).0.658 0.665 0.661
3).0.583 0.586 0.579
4).0.665 0.656 0.668
5).0.757 0.800 0.754
6).0.555 0.548 0.559
8组(304)：1).0.876 0.887 0.854
2).0.958 0.889 0.959
3).0.766 0.749 0.776
4).0.860 0.845 0.866
5).0.879 0.858 0.786
6).0.464 0.455 0.458
9组(310)：1).0.773 0.701 0.690
2).0.879 0.866 0.882
3).0.880 0.800 0.854
4).0.792 0.805 0.811
5).0.669 0.739 0.808
6).0.668 0.678 0.651
10组(607)：1).0.676 0.680 0.733
2).0.968 0.890 0.955
3).0.588 0.586 0.573
4).0.665 0.721 0.776
5).0.887 0.802 0.811
6).0.875 0.885 0.659
11组(608)：1).0.776 0.769 0.717
2).0.658 0.715 0.691
3).0.776 0.768 0.761
4).0.760 0.716 0.776
5).0.687 0.681 0.666
6).0.764 0.786 0.778
12组(610)：1).0.762 0.777 0.775
2).0.589 0.582 0.590
3).0.681 0.684 0.686
4).0.600 0.655 0.661
5).0.878 0.885 0.866
6).0.644 0.654 0.668
13组(619)：1).0.7325 0.697 0.765
2).0.674 0.656 0.682
3).0.880 0.883 0.800
4).0.920 0.895 0.914
5).0.900 0.879 0.886
6).0.688 0.675 0.684
14组(623)：1).0.544 0.587 0.545
2).0.695 0.668 0.659
3).0.557 0.517 0.565
4).0.600 0.645 0.586
5).0.587 0.557 0.499
6).0.564 0.555 0.612
15组(631)：1).0.817 0.855 0.823
2).0.912 0.899 0.887
3).0.576 0.677 0.605
4).0.816 0.824 0.800
5).0.789 0.758 0.715
6).0.590 0.612 0.630
16组(634)：1).0.668 0.612 0.634
2).0.758 0.781 0.796
3).0.666 0.712 0.734
4).0.686 0.684 0.785
5).0.647 0.585 0.703
6).0.844 0.820 0.894
17组(639)：1).1.277 1.101 1.169
2).1.118 1.008 1.082
3).9.880 9.908 9.485
4).9.779 9.811 9.998
5).0.866 0.799 0.818
6).1.266 1.344 1.116
18组(640)：1).1.133 1.112 1.331
2).1.216 1.200 1.228
3).0.771 0.912 0.884
4).0.878 0.833 0.773
5).0.944 0.899 0.912
6).1.441 1.432 1.500
19组(645)：1).0.722 0.754 0.733
2).0.685 0.671 0.657
3).0.814 0.851 0.811
4).0.971 0.918 0.932
5).0.766 0.745 0.789
6).0.866 0.701 0.816
20组(647)：1).1.327 1.310 1.216
2).1.222 1.108 1.130
3).9.999 9.904 9.749
4).1.277 1.311 1.291
5).0.867 0.813 0.828
6).1.126 1.135 1.131
21组(654)：1).0.667 0.736 0.728
2).0.776 0.766 0.752
3).0.977 0.912 0.899
4).0.751 0.713 0.722
5).0.611 0.644 0.601
6).0.876 0.889 0.793
22组(656)：1).0.567 0.568 0.536
2).0.896 0.811 0.895
3).0.658 0.651 0.662
4).0.886 0.821 0.779
5).1.118 0.980 1.198
6).0.769 0.802 0.798
23组(657)：1).1.222 1.198 1.009
2).0.689 0.585 0.599
3).0.768 0.714 0.745
4).0.760 0.672 0.611
5).0.812 0.856 0.825
6).0.649 0.657 0.689
24组(658)：1).0.777 0.768 0.705
2).0.699 0.658 0.643
3).0.581 0.605 0.616
4).0.656 0.678 0.690
5).0.811 0.856 0.844
6).0.764 0.776 0.800
25组(659)：1).1.127 1.111 1.136
2).1.008 1.008 1.032
3).0.780 0.811 0.854
4).1.002 1.238 1.349
5).0.986 0.989 0.811
6).1.126 1.134 1.117
26组小鼠(对照，肌肉注射1μg重组HBsAg/100μl PBS)
1).0.441 0.456 0.399
2).0.458 0.473 0.412
3).0.397 0.401 0.423
4).0.500 0.515 0.492
5).0.445 0.413 0.523
6).0.387 0.392 0.328
背景值：0.311 0.259 0.289
上述实验结果显示，1-25组HbsAb的滴度普遍高于26组(对照)，其中以20组(647)和25组(659)最高，其次为17组(639)，18组(640)，22组(656)以及23组(657)，说明CpG ODN增强了HbsAg的免疫原性，促进HbsAb的产生。
实施例8：增强流感病毒疫苗的免疫效果
一.实验动物及分组：
70只7周龄昆明种小鼠，体重20±2克，随机分为14组，每组5只，分笼饲养，免疫前先适应2d。
二.免疫途径及剂量：
1-13组小鼠：肌肉注射1μg流感病毒疫苗(长春生物制品研究所)/100μlPBS加10μg CpG ODN，分两点注射，即双后肢肌肉每点注射50μl。
14组：肌肉注射1μg流感病毒疫苗(长春生物制品研究所)/100μlPBS，(无CpG ODN)，分两点注射，即双后肢肌肉每点注射50μl。
三.免疫程序：
0、21d免疫，第二次免疫后7d经尾动脉采血，每只小鼠分离10ul血清，直接测抗体滴度或置-20℃冻存。
五、抗体效价的测定(间接法ELISA)
试剂器材：
包被缓冲液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6)：
Na2CO3 1.59克
NaHCO3 2.93克
加蒸馏水至1000毫升
洗涤缓冲液(PBS-T)：含0.05％吐温-20，pH7.4
K2HPO4 0.2克
Na2HPO4·12H2O 2.9克
NaCl 8.0克
KCl 0.2克
Tween-20 0.5毫升
加蒸馏水至1000ml
样品稀释液：
牛血清白蛋白(BSA) 0.1克
加洗涤缓冲液至100毫升
封闭液(2％BSA)：
牛血清白蛋白(BSA) 2克
加PBS(pH7.4)至100毫升
底物缓冲液(磷酸-柠檬酸缓冲液，pH＝5.0)：
●甲液(0.1mol/L柠檬酸)
柠檬酸 1.92克
加蒸馏水至100毫升
●乙液(0.2mol/L Na2HPO4)
Na2HPO4·12H2O 7.17克
加蒸馏水至100毫升
取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加蒸馏水至100毫升
四甲基联苯胺溶液(TMB)：2毫克/毫升
TMB 10毫克
乙醇 5毫升
底物溶液：
底物缓冲液 10毫升
TMB(2毫克/毫升) 0.5毫升
30％H2O2 10微升
终止液：
浓H2SO4 22ml
蒸馏水 178ml
步骤
1.包被：用包被缓冲液稀释流感病毒疫苗(中国长春生物制品研究所提供)至1-10微克/毫升，加入酶标板，100ul/孔，4℃，过夜。
2.洗涤：用洗涤缓冲液洗板3次，5min/次。
3.封闭：加入2％BSA封闭，200ul/孔。37℃，1.5h。
4.洗涤：用洗涤缓冲液洗板3次，5min/次。
5.加样：将待测血清用样品稀释液做400倍稀释，100ul/孔。空白对照孔加样品稀释液，100ul/孔，每个样品设3个复孔。37℃，60min。
6.洗涤：用洗涤缓冲液洗板3次，5min/次。
7.加酶标抗体：将兔抗鼠IgG-HRP(北京鼎国生物0.1ml，1∶1000)用洗涤缓冲液稀释500倍，100ul/孔，37℃，60min。
8.洗涤：用洗涤缓冲液洗板3次，5min/次。
9.显色：加入底物溶液，100ul/孔。室温避光反应10-30min。
10.终止：50ul/孔2M H2SO4。
11.酶标仪(BIO-RAD Model 550)测A450。
四、结果
1-13组小鼠(肌肉注射1μg流感病毒疫苗/100μl PBS加10μg CpG ODN)
14组小鼠(肌肉注射1μg流感病毒疫苗/100μl PBS)
1组(205)：1).0.632 0.598 0.653
2).0.628 0.675 0.634
3).0.528 0.563 0.577
4).0.633 0.701 0.680
5).0.695 0.639 0.629
2组(302)：1).0.723 0.769 0.693
2).0.734 0.786 0.723
3).0.613 0.678 0.645
4).0.636 0.668 0.654
5).0.899 0.864 0.874
3组(304)：1).0.837 0.898 0.829
2).0.676 0.669 0.632
3).0.696 0.637 0.685
4).0.707 0.689 0.670
5).0.887 0.912 0.943
4组(310)：1).0.623 0.659 0.672
2).0.720 0.790 0.728
3).0.767 0.745 0.744
4).0.674 0.614 0.675
5).0.617 0.635 0.677
5组(607)：1).0.872 0.819 0.856
2).0.670 0.635 0.690
3).0.835 0.887 0.876
4).0.679 0.705 0.691
5).0.834 0.825 0.856
6组(634)：1).0.745 0.678 0.677
2).0.634 0.655 0.689
3).0.766 0.746 0.734
4).0.869 0.876 0.821
5).0.734 0.797 0.738
7组(639)：1).0.913 0.945 0.949
2).0.676 0.617 0.690
3).0.782 0.785 0.732
4).1.101 1.206 1.218
5).0.768 0.735 0.795
8组(640)：1).0.778 0.821 0.823
2).0.767 0.768 0.753
3).1.008 1.318 1.104
4).1.237 1.134 1.231
5).0.900 0.918 0.922
9组(645)：1).0.887 0.898 0.825
2).0.892 0.875 0.895
3).0.767 0.735 0.723
4).0.785 0.756 0.801
5).0.638 0.776 0.732
10组(647)：1).0.974 0.932 0.998
2).0.912 0.967 1.055
3).0.898 0.998 0.938
4).1.217 1.223 1.021
5).1.105 0.956 0.923
11组(656)：1).0.658 0.644 0.689
2).0.813 0.876 0.874
3).0.768 0.695 0.684
4).0.634 0.612 0.673
5).0.611 0.649 0.673
12组(657)：1).0.769 0.714 0.783
2).0.634 0.705 0.701
3).0.654 0.698 0.708
4).0.763 0.765 0.699
5).0.790 0.745 0.783
13组(658)：1).0.767 0.745 0.798
2).0.761 0.703 0.685
3).0.790 0.804 0.812
4).0.752 0.758 0.782
5).0.688 0.675 0.685
14组(659)：1).0.932 0.978 1.015
2).0.896 0.921 0.943
3).1.007 1.234 0.995
4).0.786 0.723 0.759
5).0.988 0.908 0.954
15组(对照)：1).0.444 0.428 0.432
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<110>长春华普生物技术有限公司
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<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
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<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<400>5
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<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
<400>6
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<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<400>7
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<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
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<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
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<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
<400>22
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<212>DNA
<213>Artificial
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<210>24
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<211>26
<212>DNA
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<212>DNA
<213>Artificial
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<213>Artificial
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<211>30
<212>DNA
<213>Artificial
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<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
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<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<211>14
<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
<400>36
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<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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tcgttgccgt cggccccccc 20
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<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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tcgttgccgt cggggggg 18
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<212>DNA
<213>Artificial
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tcgttgccgt cgggggggg 19
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<212>DNA
<213>Artificial
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tcgttgccgt cggggggggg 20
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<211>19
<212>DNA
<213>Artificial
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tcgaggacaa gattctcgt 19
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<212>DNA
<213>Artificial
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tcccgctgga cgtt 14
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<212>DNA
<213>Artificial
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<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
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<213>Artificial
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<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
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<210>62
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial
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<210>63
<211>15
<212>DNA
<213>Artificial
<400>63
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<210>64
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial
<400>64
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<211>17
<212>DNA
<213>Artificial
<400>65
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<211>17
<212>DNA
<213>Artificial
<400>66
tcgttcgggg taccgat 17
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<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
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tcgttcgggg taccgatggg g 21
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<211>24
<212>DNA
<213>Artificial
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<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<400>69
tcgtcgtttc gtcgttgggg 20
<210>70
<211>27
<212>DNA
<213>Artificial
<400>70
tcgttgtcgt ttcgctgccg gcggggg 27
<210>71
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial
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<210>72
<211>16
<212>DNA
<213>Artificial
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<210>73
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial
<400>73
tagtaaccgg tccggcgccc cc 22
<210>74
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<213>Artificial
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ttgcagcgct gccggtggg 19
<210>75
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial
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<211>21
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cggcccatcg agggcgacgg c 21
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<211>24
<212>DNA
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<400>78
tcgtcgtcga ctcgtggtcg gggg 24
<210>79
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<400>79
tcgggcgccc gatcgggggg 20
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<211>19
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<213>Artificial
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tcgtcggtct ttcgaaatt 19
<210>81
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial
<400>81
tcgtgacgtc ctcgagtt 18
机译： 人工CpG单链脱氧寡核苷酸及其抗病毒用途
机译： 人工CPG单链脱氧寡核苷酸及其抗病毒用途
机译： 人工cpg单链脱氧-寡核苷酸及其抗病毒应用
