白血病细胞诱导生成树突状细胞的培养基及其培养方法与应用

摘要

本发明涉及一种白血病细胞诱导生成树突状细胞DC的培养基及其培养方法与应用。本发明的技术方案为是在常规的白血病细胞无血清培养基中加入当归多糖。当归多糖浓度为10－800ug/ml。当归多糖浓度为50－400ug/ml。当归多糖对造血细胞有促进作用，能诱导白血病细胞株K

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞的培养基及其培养方法与应用，尤其是白血病细胞诱导生成树突状细胞的培养基及其培养方法与应用。

背景技术

树突状细胞(dendritic cells，DC)是启动T细胞初始反应的最重要抗原提呈细胞，DC可用于肿瘤的免疫治疗。传统的DC制备均采用骨髓造血祖细胞和外周血单核细胞。制备方法是在有血清培养体系中加入粒—巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，白细胞介素4(IL-4)、肿瘤坏死因子(TNF)。此外，在制备过程中还需加入从肿瘤细胞提取的特异性抗原冲击培养，工艺复杂，培养时间长，约15天。近年来也有从白血病细胞制备DC，此种方法制备DC本身携带肿瘤特异性抗原，可激活T细胞的特异性反应而产生抗肿瘤作用。因此可省去制备过程中提取肿瘤抗原和加抗原冲击培养的步骤，简化工艺。但不足之处是用传统方法制备白血病DC，抗原共刺激分子表达低，激活T细胞作用差，培养时间仍较长，约13天。为此，缩短培养时间，寻找更好的制备白血病DC的方法显得十分重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种培养时间短的白血病细胞诱导生成树突状细胞的培养基及其培养方法与应用。

本发明的技术方案为：

白血病细胞诱导生成树突状细胞的培养基，在常规的白血病细胞无血清培养基中加入当归多糖。当归多糖英文为Angelica Polysaccharide简称APS。

较优的技术方案有下列：

当归多糖浓度为10-800ug/ml。

当归多糖浓度为50-400ug/ml。

白血病细胞诱导生成树突状细胞的培养基，在IMDM培养基中加入5-15％的无血清培养基血清替在物，其中无血清培养基血清替在物主要由牛血清白蛋白，过氧化氢酶，人转铁蛋白，胆固醇，胰岛素组成。

白血病细胞诱导生成树突状细胞的培养基，使用磷酸盐缓冲液调配当归多糖的浓度。

白血病细胞诱导生成树突状细胞的培养基的细胞培养方法，白血病患者抗凝骨髓，经淋巴细胞分离液分离单个核细胞，调整细胞浓度为0.5-5×10⁶/ml，悬浮于IMDM培养基中，加入终浓度为50-400ug/ml的当归多糖，置于常规的细胞培养箱中培养，常规换液，和常规补充新鲜培养基及相应的细胞因子，培养1-10天。

白血病细胞诱导生成树突状细胞的培养基的细胞培养方法，置于常规37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养，每周半量换液2次，补充新鲜培养基及相应的细胞因子，培养3-5天。

白血病细胞诱导生成树突状细胞的培养基的细胞培养方法，培养的10天后加入TNF-α，继续培养3天，收集细胞。

白血病细胞诱导生成树突状细胞的培养基用于白血病细胞、树突状细胞分析检测。

本发明的原理和优点在于：

当归多糖对造血细胞生长有促进作用，能诱导白血病细胞株K₅₆₂分化，可促进免疫功能，增强单核巨噬细胞的吞噬功能，因此，当归多糖用于制备DC具有充分的理论依据。

采用主要由牛血清白蛋白，过氧化氢酶，人转铁蛋白，胆固醇，胰岛素组成的无血清培养基血清替代物制备白血病性DC，制备所需时间与有血清培养相似，但无血清条件下制备的DC激活T细胞作用比有血清制备强，同时，避免了加入血清可能带来的肝炎病毒、艾滋病病毒感染的可能。

与不加当归多糖比较，加当归多糖组制备的DC，其抗原共刺激分子(CD₈₀、CD₈₆)表达明显升高，制备时间只需3-5天，细胞活性比不加当归多糖组好。因此，当归多糖能促进白血病性DC的诱生和成熟，是制备白血病DC良好的诱生剂。

具体实施方式

实施例1、白血病细胞诱导生成树突状细胞的培养基，在常规的白血病细胞无血清培养基中加入当归多糖。

实施例2、白血病细胞诱导生成树突状细胞的培养基，当归多糖浓度为10-800ug/ml。

实施例3、白血病细胞诱导生成树突状细胞的培养基，当归多糖浓度为50-400ug/ml。

实施例4、白血病细胞诱导生成树突状细胞的培养基，在IMDM培养基中加入5-15％的无血清培养基血清替在物，其中无血清培养基血清替在物主要由牛血清白蛋白，过氧化氢酶，人转铁蛋白，胆固醇，胰岛素组成。

实施例5、白血病细胞诱导生成树突状细胞的培养基，使用磷酸盐缓冲液调配当归多糖的浓度。

实施例6、白血病细胞诱导生成树突状细胞的培养基的细胞培养方法，白血病患者抗凝骨髓，经淋巴细胞分离液分离单个核细胞，调整细胞浓度为0.5-5×10⁶/ml，悬浮于IMDM培养基中，加入终浓度为50-400ug/ml的当归多糖，置于常规的细胞培养箱中培养，常规换液，和常规补充新鲜培养基及相应的细胞因子，培养1-10天。

实施例7、白血病细胞诱导生成树突状细胞的培养基的细胞培养方法，置于常规37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养，每周半量换液2次，补充新鲜培养基及相应的细胞因子，培养3-5天。

实施例8、白血病细胞诱导生成树突状细胞的培养基的细胞培养方法，培养的10天后加入TNF-α，继续培养3天，收集细胞。

实施例9、白血病细胞诱导生成树突状细胞的培养基用于白血病细胞、树突状细胞分析检测。

实施例10、

(1)、按传统方法建立有血清制备人白血病细胞DC方法，取白血病患者(包括急性髓性白血病、慢性粒细胞白血病)骨髓细胞，分离单个细胞，镜下观察白血病幼稚细胞占80-90％。调整细胞浓度为1×10⁶个/ml。培养方法：用IMDM培养基+10％人AB型血清，再补充GM-CSF，IL-4，TNF等细胞因子。置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，每周用含上述细胞因子的新鲜培养基换液两次。

(2)、建立无血清条件下制备人白血病DC的方法：用IMDM培养基+10％无血清培养基血清替在物(主要含牛血清白蛋白，过氧化氢酶，人转铁蛋白，胆固醇，胰岛素等)。

(3)、从中药当归(甘肃岷县产)中提取当归多糖，纯度＞98％，将当归多糖用磷酸盐缓冲液PBS配制成适当浓度，过滤除菌备用。

(4)、将当归多糖加入已建立的无血清培养体系中制备白血病DC，观察不同浓度、不同培养时间制备的DC，采用形态学，细胞免疫表型和混合淋巴细胞反应观察，当归多糖对制备白血病DC的影响。

1材料和方法

1.1  标本来源

6例慢性期CML，经bcr/abl融合基因检测为阳性。

1.2主要药品和试剂

APS由上海中医药大学分离提取，纯度＞95％，配制成所需浓度工作液，过滤除菌。GM-CSF购自先灵宝雅公司，IL-4、TNF-α、丝裂霉素C购于Sigma公司，淋巴细胞分离液购于中国科学院血液学研究所。FITC-HLA-DR、FITC-CD80、FITC-CD83、FITC-CD86单抗购于BD公司，完全培养基包括IMDM和胎牛血清购于Gibco公司。

1.3细胞培养

CML患者抗凝骨髓，经淋巴细胞分离液分离单个核细胞，调整细胞浓度为1×10⁶/ml，悬浮于含10％胎牛血清的IMDM培养基中，加入浓度为1000u/mlrhGm-CSF，1000u/ml rhIL-4作为对照组，实验组在上述培养体系中再分别加入终浓度为50-400ug/ml的APS。置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养，每周半量换液2次，补充新鲜培养基及相应的细胞因子，培养第10天加入终浓度的100ug/ml的TNF-α，继续培养3天，收集细胞，一部分用细胞表型分析，其余在液氮中冻存。

1.4细胞免疫表型鉴定和形态学观察：见我们已报道的方法^[2]。

1.5APS对CML-DC增殖的影响：分别在培养第1、3、5、7、10天取样，进行台酚蓝染色，计数活细胞数。

1.6混合淋巴细胞反应

取健康人(输血员)和治疗后达CR患者外周血，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，调整细胞浓度2×10⁶/ml加入含5％胎牛血清的IMDM中，置于塑料培养瓶，在37℃静置60min，收集非吸附细胞。调整适当细胞浓度备用。在37℃水浴中复苏DC，洗涤3次，加入含终浓度为25ug/ml丝裂霉素IMDM，在37℃孵育45min，IMDM培养基洗涤3次，用含10％胎牛血清IMDM培养基调整细胞浓度，分别以1×10³/孔，3×10³/孔，1×10⁴/孔加入96孔培养板，每组接种3个复孔，每孔再加2×10⁵个健康人或患者(CD)外周血淋巴细胞，在37℃、5％CO2细胞培养和中培养96小时后加入MTT(5ug/ml，10ul/孔，Sigmn公司)，培养结束后加入二甲基亚砜(DMSO)150ul/孔，用酶标仪检测波长570nm时的OD值，结果取均值。

2  结果

2.1  细胞计数和细胞成活率观察

以GM-CSF、IL-4为基本诱导DC条件，加入不同APS浓度时培养细胞的计数和成活率的变化见表1、表2，从表中可以看出，当APS浓度为100ug/ml时，细胞的增殖和成活率为最好，最佳的时间是在培养3-5天时。

           表1    同APS浓度培养细胞数的变化(×10⁶/ml)

                        培养时间(天)

分组   APS(ug/ml)

                     0      1       3       5       7       10

1      0            1.00    1.10    0.93    0.82    0.43    0.18

2      50           1.00    1.01    1.08    0.80    1.02    0.83

3      100          1.00    1.02    1.53    2.02    1.91    1.83

4      200          1.00    0.89    1.02    1.12    1.23    1.45

5      400          1.00    1.03    1.02    1.34    1.82    1.35

        表2    同APS浓度培养时细胞成活率的变化(％)   

                            培养时间(天)

分组    APS(ug/ml)

                    0      1     3     5     7     10

1        0          100    95    82    62    45    35

2        50         100    90    90    83    70    60

3        100        100    96    94    90    89    87

4        200        100    94    76    86    78    63

5        400        100    92    91    87    66    48

2.2细胞形态学观察

6例CML骨髓单个核细胞，经GM-CSF、IL-4联合诱导培养后可部分出现了细胞体积增大，并伸出突出，随着培养时间的延长，总细胞数量减少，大部分细胞死亡，但剩余的细胞在培养时10天时再加入TNF-α，出现树突样的DC比例增多。而加入APS后培养的细胞，培养次日即出现了呈树枝状突起的细胞，到培养3-5天时出现DC形态细胞比例明显增加，且细胞生长状态比未加APS好，细胞总数亦增多。培养10天时细胞总数也未减少。

2.3细胞表型变化    

由于从动态观察中发现加入100ug/ml APS时，细胞增殖和成活率达到最佳，因此，我们选择加入100ug/ml APS组的DC细胞作表型分析，并与不加APS相对比(见表3)。从表3中可提示：加入APS组，细胞DC相关表而分子表达率明显升高，且在培养后的第一天就开始上升，其中在3-5天时升高最为明显。如CD83为40.6％，CD80 44.6％，CD86 50.6％，HLA-DR 60.3％；而未加APS组，DC相关表而分子升高不明显，到第10天时CD83才为18.6％，CD80 14.1％，CD86 15.1％，HLA-DR 21.8％。此时，在未加APS组中再加入TNT-α后继续培养3天，则CD83的比率可升高到36.4％，但培养体系中大部分细胞死亡，细胞总数明显减少。

            表3 APS对培养DC的细胞表型变化(％)

细胞表                                        培养时间(天)

      APS(ug/ml)

型                    0           1           3            5           7            10

CD83      0       1.2±0.4    1.8±0.8    4.6±2.3     6.8±2.1    9.1±1.9     18.6±2.4

CD83      100     1.2±0.4    19.3±1.9   36.4±5.2    40.6±7.0   39.8±6.6    35.5±10.1

CD80      0       3.4±1.1    2.9±1.1    41.1±1.3    8.3±2.9    10.1±2.3    14.1±3.4

CD80      100     3.4±1.1    16.2±2.2   42.3±6.4    44.6±5.9   42.1±7.0    39.7±12.1

CD86      0       2.8±0.9    3.4±1.2    5.3±1.8     9.1±2.2    11.8±2.3    15.1±3.7

CD86      100     2.8±0.9    17.3±3.4   39.4±4.2    50.6±11.6  48.1±10.6   45.1±7.6

HLA-DR    0       6.6±2.2    7.6±2.5    18.4±2.9    19.6±2.4   20.8±7.2    21.8±3.1

HLA-DR    100     6.6±2.2    20.1±4.1   45.1±6.3    60.3±11.8  55.4±14.8   49.3±10.1

2.4 APS对CML-DC刺激淋巴细胞增殖的影响

我们收集培养第10天的未加APS组CML-DC和收集培养第5天加入APS的CML-DC用于混合淋巴细胞反应(见表4)，结果提示：两组CML-DC故能刺激自体或同种异体淋巴细胞增殖，但加入APS组诱导的CML-DC激活淋巴细胞增殖的能力比未加APS组强。

         表4 APS对CML-DC刺激淋巴细胞增殖的影响(OD)

                        培养时间(天)

分组    APS(ug/ml)

               1×10³/孔        3×10³/孔        1×10⁴/孔

自体淋巴细胞

自体淋巴细胞     0      0.32±0.10    0.53±0.14    0.81±0.17

正常人淋巴细    100     0.48±0.12    0.81±0.11    1.19±0.18

胞              0       0.36±0.15    0.67±0.18    0.89±0.16

正常人淋巴细    100     0.50±0.20    0.93±0.14    1.34±0.20

胞

3讨论

CML患者的白血病细胞可以诱导生成树突状细胞。由于CML-DC携带肿瘤特异性抗原，若其具有正常DC相似的抗原功能，则可激活特特异性T细胞免疫反应，从而达到特异性杀伤的白血细胞的作用。但采用以往方法培养的CML-DC抗原共刺激分子表达较低，且培养诱导时间较长，因此，其刺激T细胞反应能力受限，同时难以短期获得成熟的CML-DC。而培养时间延长，则细胞成活率明显降低。

当归多糖(APS)是中医药学补血要药当归的重要有效成分。APS对造血有促进作用，且能诱导白血病细胞株K562分化；APS也能增强免疫功能，可增强单核巨噬细胞的吞噬功能。我们在以往加IL-4、GM-CSF诱导培养CML-DC的基础上，再加入APS培养诱导CML-DC，结果显示：细胞增殖能力和成活率与未加APS组明显提高，以APS浓度为100ug/ml、培养3-5天时为最好。细胞表型分析：加入APS组培养第1天的细胞CD83、CD86、CD80、HLA-DR表达比率明显增多，且在第3-5天时升高到高峰。混合淋巴细胞反应提示加入APS组诱生的CML-DC，刺激淋巴细胞增殖能力强于未加APS组。本研究结果证明：APS能促进CML-DC的诱生和成熟，且能提高抗原共刺激分子的表达，增强CML-DC激活T细胞的能力。

实施例11、

1、2％当归多糖注射正常小鼠和(4Gy钴60照射)贫血小鼠，取各组小鼠骨髓培养，观察当归多糖对单核-巨噬细胞生成的影响。

注射当归多糖对粒—单细胞集落细胞形成的影响(/5×10⁴BMC)

组别        n     对照组(X±S)    n      当归多糖组(X±S)    P

正常鼠     20     108.7±16.0     20     146.7±15.7       ＜0.01

贫血鼠     15     17.5±1.6       14     39.5±3.8         ＜0.01

证明当归多糖能促进粒细胞、单核细胞生成。

2、当归多糖促进骨髓细胞增殖(MTT法)

                           当归多糖浓度/mg·mL-1

分组                  1              0.5            0.25                0

对照组(加溶剂)                                                    0.107±0.007

当归多糖组        0.767±0.501    0.697±0.546    0.842±0.601

3、当归多糖对骨髓有核细胞DNA合成影响(3H-TdR标记法)

                                   药物浓度

分组                  1              0.5            0.25                0

对照组(加溶剂)                                                    80.41±48.21

当归多糖组       881.87±376.23   981.39±481.05  686.03±193.22

4、当归多糖对小鼠树突状细胞的影响。

5％当归多糖皮下注射正常小鼠后，对照实验表明：

①脾重量增加；②脾小体生发中心反应减弱；③树突状细胞增多；④腹腔单核-巨噬细胞对鸡红细胞吞噬能力显著增强。实施例11、下面是一组技术参数：

当归多糖浓度为2ug/ml。其余同实施例10。

当归多糖浓度为1000ug/ml。其余同实施例10。

当归多糖浓度为1500ug/ml。其余同实施例10。

当归多糖浓度为800ug/ml。其余同实施例10。

当归多糖浓度为50ug/ml。其余同实施例10。

当归多糖浓度为25ug/ml。其余同实施例10。

当归多糖浓度为400ug/ml。其余同实施例10。

当归多糖浓度为200ug/ml。其余同实施例10。

当归多糖浓度为500ug/ml。其余同实施例10。

在IMDM培养基中加入5％的无血清培养基血清替在物，其中无血清培养基血清替在物主要由牛血清白蛋白，过氧化氢酶，人转铁蛋白，胆固醇，胰岛素组成。其余同实施例10。

在IMDM培养基中加入15％的无血清培养基血清替在物，其中无血清培养基血清替在物主要由牛血清白蛋白，过氧化氢酶，人转铁蛋白，胆固醇，胰岛素组成。其余同实施例10。

在IMDM培养基中加入12％的无血清培养基血清替在物，其中无血清培养基血清替在物主要由牛血清白蛋白，过氧化氢酶，人转铁蛋白，胆固醇，胰岛素组成。其余同实施例10。

白血病患者抗凝骨髓，经淋巴细胞分离液分离单个核细胞，调整细胞浓度为0.5-5×10⁶/ml，悬浮于IMDM培养基中，加入终浓度为400ug/ml的当归多糖，置于常规的细胞培养箱中培养，常规换液，和常规补充新鲜培养基及相应的细胞因子，培养1天。其余同实施例10。

白血病患者抗凝骨髓，经淋巴细胞分离液分离单个核细胞，调整细胞浓度为5×10⁶/ml，悬浮于IMDM培养基中，加入终浓度为50ug/ml的当归多糖，置于常规的细胞培养箱中培养，常规换液，和常规补充新鲜培养基及相应的细胞因子，培养3天。其余同实施例10。

白血病患者抗凝骨髓，经淋巴细胞分离液分离单个核细胞，调整细胞浓度为3×10⁶/ml，悬浮于IMDM培养基中，加入终浓度为300ug/ml的当归多糖，置于常规的细胞培养箱中培养，常规换液，和常规补充新鲜培养基及相应的细胞因子，培养10天。其余同实施例10。

白血病患者抗凝骨髓，经淋巴细胞分离液分离单个核细胞，调整细胞浓度为0.5-5×10⁶/ml，悬浮于IMDM培养基中，加入终浓度为50-400ug/ml的当归多糖，置于常规的细胞培养箱中培养，常规换液，和常规补充新鲜培养基及相应的细胞因子，培养4天。其余同实施例10。

白血病患者抗凝骨髓，经淋巴细胞分离液分离单个核细胞，调整细胞浓度为0.5-5×10⁶/ml，悬浮于IMDM培养基中，加入终浓度为50-400ug/ml的当归多糖，置于常规的细胞培养箱中培养，常规换液，和常规补充新鲜培养基及相应的细胞因子，培养5天。其余同实施例10。