一种通过分割处理获得无选择标记转基因植物的技术

摘要

本发明涉及一种通过分割处理获得无选择标记转基因植物的技术。其技术要点是将转化后形成的愈伤组织切分成≤1mm3的小块，切分处理的次数≥2次，用可直接对基因进行检测的方法对目标基因进行追踪，通过多次的分割处理，便可分离出纯合及准纯合的转化体，进而获得无选择标记的转基因植株。本发明的有益效果是避免了转基因植物中的选择标记可能产生的不利影响，并且跨跃了现有的各种去除选择标记技术所存在的局限性及缺点，它还具有操作简便、便于推广应用的特点，本发明适用于所有可组织培养成功的植物。

说明书

                         技术领域

本发明涉及一种通过分割处理获得无选择标记转基因植物的技术，属于植物转基因技术。

                         背景技术

转基因作物已成为当今最有市场诱惑力的高科技产品，但目前的转基因技术大都依赖选择标记。转基因植物中的选择标记，可能会从多方面产生不利影响，发展无选择标记的转基因技术是当前的迫切需求。

自1983年首次获得转基因烟草以来，植物转基因枝术不断改进或创新，发展出了若干种方法，如农杆菌介导法、基因枪法、微注射法、花粉管通道法等。其中，应用得最为成功的是农杆菌介导法和基因枪法。但由于目前所有转基因技术的效率都比较低，“目的基因”的导入通常需要串连上易于识别的标记基因来选择。这种标记基因又称为“选择标记”或“筛选标记”。绝大多数的转基因植物都是借助“筛选标记”获得的。这些“标记”虽帮人们实现了转化子的选择，但是也带来或潜伏了一系列的问题。大体可分为五个方面：1、可能会影响基因的表达。2、限制多个基因转化。3、可能会影响作物的某些性状。4、可能会影响环境安全。5、可能会危及人身安全。

对于选择标记可能带来的诸多不利，科学家们早就有了认识，并较早地开始了有关去除选择标记的转化方法的探索。归结起来，主要有以下几个方面：

1、利用共转化法  将目的基因和选择标记分别整合于两个T-DNA，将其构建于一个载体上或分别构建于两个载体，用这样的一个载体或两个载体同时转化受体植物，通过筛选获得共转化体后借助遗传分离原理从共转化体分离出只含有目的基因的后代。但利用共转化法获得不含选择标记的转化后代，前提是共转化效率要高，而且其共转化体中的两个基因可以分离，对于许多重要作物来说，由于共转化率较低，极大的限制了此法的应用和应用后的效果。

2、利用位点特异性重组技术位点特异性重组体系是一类独特的DNA序列，一般可将其分为两部分，一部分是编码重组酶的基因，另一部分是可将插入的基因自动切除的特异性位点。其中研究得较多的是Cre/lox系统。利用Cre/lox系统去除筛选标记的原理是，将标记基因构建于lox系统的两个34bp特异序列之间，即lox位点，将目的基因构建于lox位点之外，筛选到转化子后，诱导Cre酶表达，将位于lox位点的选择标记切除。特异位点重组系统，虽表现了较高的可控性，但过于复杂，另外还有一个致命弱点，即无法切除特异位点。这对于被改造植物来说如同选择标记一样仍是不必要的“垃圾”。

3、利用转座子转座的方法转座子转座是借助转座子系统中转座酶的转座作用实现基因的重新组合。转座子由自主成员和非自主成员两部分组成，如玉米的Ac/Ds系统，其自主成员Ac基因编码转座酶用于自身和非自主成员Ds基因的转座。非自主成员的两端有数百个核苷酸序列，中间可以换成或插入较大的外源基因。插入外源基因的非自主成员仍会同自主成员一起被转座酶转移。把目的基因置于整个转座子的外部，将选择标记设于非自主成员内部，转化后的植物可通过转座作用将选择标记转走，最后分离出无标记的转基因后代。但是，目前可利用转座子机制的作物还比较少，在许多重要的作物中转座子的活性很小，转座发生的频率很低。

4、利用同源重组作用  即重新导入一段与选择标记两侧DNA完全相同的序列，通过同源序重组将包含有选择标记的DNA片段置换，从而获得选择标记剔除掉的转基因植株。这种技术又叫做基因打靶，在微生物和动物上应用的很成功，但在植物上还处于探索阶段、尚无有说服力的证据。

5、利用其他方法  主要是利用某种对植物和人有用的基因代替选择标记，如颜色、抗旱、抗盐等。但这方面的基因大都体积大、结构复杂，在选择效果上难以判断。另外，来自这方面的可用做选择标记的基因为数很少。

                        发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种通过分割处理获得无选择标记转基因植物的技术。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案：

将转化后形成的愈伤组织切分成尽可能小的小块，小块的体积≤1mm³，待小块长大后用可直接对基因进行检测(鉴定)的方法对有目标基因的细胞或组织进行追踪，通过多次的分割处理，分割处理次数≥2次，便可分离出纯合及准纯合的转化体，进而获得无选择标记的转基因植株；其技术流程如下：

(1)、转化处理转化的受体可以是外植体，也可以是愈伤组织；可以是农杆菌介导转化，也可以上基因枪介导转化。

(2)、组织培养将转化处理后的外植体诱导成愈伤组织并通过培养进一步扩增，将转化处理后的愈伤组织通过培养进一步扩增。

(3)、分割处理将转化处理后获得的愈伤组织分割成尽可能小的小块，小块的体积≤1mm³，并按各小块在原来愈伤组织的位置关系有规律的排布于培养基上；待分割后的愈伤组织长大后，用可直接对目标基因进行检测(鉴定)的方法选出有转化的愈伤组织，再将其分割成≤1mm³的小块；待第二次分割后的愈伤长大后，先找出转化愈伤组织多的区域，再对该区域内的愈伤组织进行逐一检测，确定出转化愈伤的具体分布，然后从转化愈伤组织密集区的中心区域选取转化了的愈伤组织分化植株或进行进一步的分割、鉴定及植株再生；分割处理的次数≥2次。

(4)、分子检测用PCR等可直接对目标基因进行检测(鉴定)的方法选出有转化的愈伤组织。

(5)、植株再生将选出的转化了的愈伤分化成再生植株。

(6)、植株鉴定对再生植株逐一进行鉴定，保留所有最上部两个叶片均为阳性的植株。

在第一次分割后，待愈伤组织长大后采用减半排除法对其进行鉴定，减半排除法为：将分割后长大的愈伤组织分成两组，分别放于两个小离心管进行鉴定，淘汰无反应组，将阳性组中的愈伤组织再均为两组取样，进行鉴定，如此反复直至找到有转化的愈伤组织。为了防止取样对愈伤组织的影响，多次取样时应给愈伤组织留出一定的让其恢复的时间间隔。

在第二次分割后，待愈伤组织长大后采用分组法对其进行检测，分组法为：对于分割块数较多的处理，按愈伤组织在平皿上的排布关系进行分组，同一组的放同一小离心管，根据检测结果确定有转化的愈伤组织及转化愈伤组织最多的组别，然后对该组中的所有愈伤组织逐一检测，确定有转化愈伤组织的分布，选取最中央的一块。

本发明的有益效果是避免了转基因植物中的选择标记可能产生的不利影响，并且跨越了现有的各种去除选择标记的技术所存在的局限性及缺点，它还具有操作简便、便于推广应用的特点，本发明适用于所有可组织培养成功的植物。

                           附图说明

图1为进行64分的示意图。

图2为起始愈伤组织上转化细胞的分布情况(深色部位为转化了的部分)。

图3为第一次64分后的转化愈伤组织(深色部位为转化了的部分)。

图4为第二次64分后的转化愈伤组织(深色部位为转化了的部分)。

图5为转基因的毛T-5番茄。

                         具体实施方式

实施例1：利用分割法将GUS基因导入烟草。

用农杆菌介导法进行转化，受体烟草为品种SR1，供体为携带有GUS基因的pCAMBIA1301质粒，农杆菌菌株为LBA4404。侵染和共培养的培养基为：B5+谷氨酰胺584mg/l+甜菜碱117.2mg/l+脯氨酸0.12mg/l+肌醇400mg/l+30g/l蔗糖，pH5.5。侵染时农杆菌的OD₆₀₀值为0.5，附加5mg/l乙酰丁香酮，侵染30分钟。共培养在附加10mg/l Agar的培养基上进行，时间为3天。培养愈伤组织的培养基为B5+584mg/l谷氨酰胺+0.6mg/l BA+0.03mg/l IAA+250mg/lCarb。当转化处理后的愈伤组织长至直径0.5cm左右时，按图1示意的方法(六十四分法)进行分割，每次分成64块。为便于将检测结果与转化部位对应起来，均分后的小细胞团按原来相邻的关系顺序摆放在培养基上。为了分析分割的效果，用“每次的分割块数×分割次数”或“每次分割处理所分块数的和”作为分割递进度。第1次分割后，对长大的愈伤组织，用“减半排除法”进行鉴定，选出有转化的愈伤组织，再将其分割成64块继续进行培养。第2次分割后，对长大的愈伤组织，用“分组法”进行检测，先找到转化愈伤组织多的区域，再对该区域内的愈伤组织进行逐一检测，确定出转化愈伤组织的具体分布，然后转化愈伤组织密集区的中心区域选取转化了的愈伤组织。依此递进，共进行了5次分割处理。

实验结果表明，转化处理后的外植体，在无选择压力的培养基上培养12天就会长到直径近0.5cm。随机抽取一定数量的愈伤进行X-gluc染色分析，80-90％的原始愈伤组织都是有转化的，但转化细胞数在整块愈伤组织中的比率很低，转化事件主要发生在外植体外围的伤口部分(见图2)。

将转化后直径0.5cm的愈伤组织匀分成64块，再培养至原来的大小约需11天。一次分割后的分割递进度为64×1＝64。对一次分割后长大的愈伤组织进行检测的结果表明，在有转化的愈伤组织中转化了的细胞已显示了一定的富集(见图3)。

二次分割后的分割递进度为64×2＝128。检测结果表明，二次分割后的转化愈伤组织已开始连片出现，有转化的愈伤组织在总愈伤组织数中的比率明显提高，而且二次分割后长大的有转化的愈伤组织中转化细胞的富集度也明显提高(见图4)。对由二次分割后的愈伤组织分化出的80株再生苗进行检测的结果显示，其中有纯合体45株、准纯合体3株、嵌合体10株、未转化的22株。准纯合体以上植株(纯合体+准纯合体)在总株树中所占的比率(即有效转化率)为：(45+3)/80＝60.0％。

三次分割后的分割递进度为64×3＝192。检测三次分割的子愈伤组织，其中有转化的愈伤组织呈现为大幅度扩展了的连片分布，在总愈伤组织数中已占到了相当高的比率，而且转化愈伤组织分布区中的大部分愈伤组织已成为纯转化了的愈伤组织。在由其分化出的80株再生苗中，纯合体67株、准纯合体3株、嵌合体6株、未转化的4株，有效转化率为87.5％。

四次分割后的分割进度为64×4＝256。检测四次分割的子愈伤组织，几乎全部为有转化愈伤组织，绝大部分有转化的愈伤组织已成为纯转化了的愈伤组织。对由其再生的80株再生苗进行检测，纯合体78株、准纯合体0株、嵌合体2株、未转化的0株，有效转化率达到了97.5％。

五次分割后分割进度为64×5＝320。检测五次分割的子愈伤组织，全部为纯转化了的愈伤组织，80株再生苗全部为纯合转化体。

用“三十二分法”进行分割也可获得转化植株，与“六十四分法”相比，当分割递进度相近时，分割的效果也相近(见附表1)。

实施例2：利用分割法将几丁质酶基因导入烟草

受体同实施例1，供体变为携带有几丁质酶基因的pAHCGG1质粒，农杆菌菌株为LBA4404。分割递度为64+32+32的处理，从诱导到再生植株共花了37天时间，10株再生苗中有纯合体3株，准纯合体3株，嵌合体2株，未转化的2株。

实施例3：利用分割法将“β-1，3-葡聚糖酶基因”导入烟草

受体同实施例1，供体变为携带有β-1，3-葡聚糖酶基因的pAHGGG1质粒，农杆菌菌株为LBA4404。分割递进度为64+64的处理，从诱导到再生植株总共花了34天时间，20株再生苗中有纯合体3株、准合体3株、嵌合体1株、未转化的3株。分割递进度为64+32+32的处理，从诱导到再生植株总共花了37天时间，20株再生苗中有纯合体2株、准纯合体4株、嵌合体2株、未转化的2株。

实施例4：利用分割法将“β-1，3-葡聚糖酶基因”转入番茄(见图5)

受体变为番茄，品种为毛T-5(当前生产上广泛种植的品种)，供体变为携带有β-1，3-葡聚糖酶基因的pAHGGG1质粒，农杆菌菌株为LBA4404。愈伤组织培养时的培养基激素调整为BA 1.2mg/l+IAA 0.2mg/l。分割递进度为32+32+32+32(128)的处理，从诱导愈伤到再生植株，总共花了48天时间。对来自20块随机愈伤的20株再生苗进行检测的结果为：纯合体6株、准纯合体5株、嵌合体4株、未转化的5株，有效转化率为55.0％。

附表1：分割递进度作用效果一览表

  切分块  数  切分次  数    分割递    进度    需要时    间(d)    嵌合体    数(株)    准纯合    体数    (株)    纯合体    数(株)  有效转  化株数  (株)    有效转    化率(％)  32  2    64    29    8    5    13  18    22.5  3    96    36    16    9    18  27    33.8  4    128    43    14    9    38  47    61.3  5    160    50    12    10    42  52    65.0  64  2    128    34    10    3    45  48    60.0  3    192    45    4    3    67  70    87.5  4    256    56    2    0    78  78    97.5  5    320    67    0    0    80  80    100.0