一种解毒酶基因在家蚕中稳定表达系统的构建方法

摘要

本发明公开了一种解毒酶基因在家蚕中稳定表达系统的构建方法，首先是设计合成寡聚脱氧核糖核苷酸引物；其次是将解毒酶基因的cDNA或其氨基酸序列对应的DNA序列与家蚕丝蛋白L链启动子和终止子相连构建融合基因，并一起插入转座因子piggyBac的两个反向重复末端序列之间，得到重组的转座子；第三是用转座酶基因构建转座酶基因表达载体；第四是将得到的重组转座因子和转座酶基因表达载体同时转化家蚕卵；第五是通过培养和筛选被转化的家蚕卵形成的幼蚕，得到稳定表达外源解毒酶脂酶B1的转基因家蚕。本发明方法易行、操作简便、转化率高、家蚕蛹中脂酶B1含量为52％。

说明书

                          技术领域

本发明涉及解毒酶基因在转基因家蚕中的表达，更具体涉及一种解毒酶基因在家蚕中稳定表达系统的构建方法。

                          背景技术

农药中毒和农药对生态环境的破坏作用越来越受到全世界的关注。1997年全球仅农药中毒就有50万起，1995年中国农药中毒事件10万余例，其中主要是高毒类农药中毒。除了急性中毒以外，农药残留以及对土壤、水体、空气等的污染也愈来愈大，产生迟发性神经毒性、生态平衡失调。对于农药中毒和农药污染，目前主要是采用阿托品和解磷定类药物，这些药物有一定的副作用。

利用解毒酶对农药中毒、作物和环境中的农药残留进行分解，是一条新的途径。近年来，对于微生物和抗性昆虫中解毒酶的研究相当活跃，已发展到分子生物学水平，国内外学者虽已开展了多种解毒酶基因测序、克隆和转基因研究，尤其是对脂酶B1的研究更为细致，并在大肠杆菌、蓝藻、革兰氏阳性菌、黄杆菌等进行了成功表达，但利用这些微生物和藻类表达的脂酶B1不能进行糖基化修饰，给表达后的分离、提纯工作带来相当难度。以家蚕作为生物反应器合成具有经济价值的多肽、蛋白等，是目前众多研究者和投资者关注热点，但目前还未见以家蚕作为外源蛋白基因受体表达解毒酶基因的报道。

                        发明内容

本发明的目的在于提供一种解毒酶基因(脂酶B1)在家蚕中稳定表达的构建方法。其方法易行、操作简便、转化率高，获得了重组家蚕脂酶B1蛋白和转基因家蚕。

本发明在家蚕中表达脂酶B1基因的表达系统的构建方法包括以下步骤：

(1)引物设计及多个基因的克隆

设计合成14个寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物，见下表：

  A3-0      5’tgg atc cgc ggc gcg tta cca tat atg 3’  A3-1      5’gcg ata tca cgc cct gat gg3’  A3-2      5’gcg gat ccc atc ttg aat tag tct gc3’  A3-3   23      5’agtccatgggccttccgacgatc3’  L-1   32      Ctggatccataacagaccactaaaatgaagcc  L-2   26      Cgaagcttgtcgcgtcattaccgttg  L-3   30      Cgtctagactcgaggtggtgcctatcccac  L-4   29      Gcggatccaatcggtatatactatacagg  L-5   20      Cgaagcttagttgctaatgc  L-6   22      Ctggtaccatgtacccactgtc  Tra-1      5’gcg gat cct ctt tag acg atg3’  Tra-2      5’tac tgc agg tca tca cag 3’  Gfp-1   24      5′-gtggatccgcggccgctttacttg-3′  Gfp-2      Acggatccatggtgagcaagggc

从5龄幼蚕中取出后部丝腺提取总DNA。以此总DNA为模板，分别用上述引物进行PCR扩增反应，再用相应的限制酶消化，与经过同样酶切处理的质粒Bluescript M13(pBS)连接，筛选重组子，获得了各PCR扩增片段的克隆，克隆的DNA片段分别是：①细胞质肌动蛋白基因启动子的不同长度DNA序列，有的不含信号肽序列，与转座子piggyBac的转座酶编码区融合构建成辅助质粒，有的含信号肽序列和部分编码区，可与报告基因—多管水母绿色荧光蛋白基因gfp融合；②家蚕丝心蛋白轻链(Light chain)基因启动子；③家蚕丝心蛋白轻链(Light chain)基因终止子序列；④转座酶编码区部分序列；⑤绿色荧光蛋白基因编码区部分序列。

(2)将解毒酶基因的cDNA或其氨基酸序列高度重复部分对应的DNA序列与家蚕丝蛋白L链基因cDNA融合，并将融合的DNA片段置于L链基因启动子之后及L链基因终止子之前，构建得到完整的融合基因，将完整的融合基因与一种报告基因相连，并一起插入转座因子piggyBac的两个反向重复末端序列之间，得到重组的转座因子；

(3)用转座酶基因构建转座酶基因表达载体；

(4)将步骤(2)中得到的重组转座因子和步骤(3)中得到转座酶基因表达载体同时转化家蚕卵；

(5)通过培养和筛选由步骤(4)获得的被转化的家蚕卵形成的幼蚕，得到稳定表达外源解毒酶脂酶B1的转基因家蚕。

脂酶B1基因表达单元的正确构建对于其在家蚕体内的表达、分泌、调控以及酶蛋白的形成，都有决定性作用。因此本发明将脂酶B1基因融合在家蚕丝蛋白L链基因的下游，利用家蚕丝蛋白L链的合成来引导解毒酶的合成和分泌。

本发明利用家蚕自身的L链基因启动子来启动L链-脂酶B1融合基因的转录：将脂酶B1基因cDNA或其氨基酸序列高度重复部分对应的DNA片段的5’端紧接在蚕丝蛋白L链基因cDNA的3’末端，形成正确通读的融合基因，并将该融合基因置于家蚕自身L链基因启动子和终止子的紧密控制下，构建成完整的“蚕丝L链-脂酶B1”重组基因表达单元。因此该融合基因在家蚕体内的表达L链基因启动子和终止子而受到家蚕自身的精确调控；而蚕丝L链蛋白的存在又确保了融合基因表达产物的分泌和酶蛋白的形成。蚕丝L链基因启动子和终止子可通过家蚕基因组DNA经PCR扩增获取，L链基因cDNA则可通过提取五龄家蚕后部丝腺中总RNA或mRNA，经RT-PCR(逆转录PCR)扩增获取。

本发明将GFP报告基因置于家蚕细胞质肌动蛋白基因A3的启动子的下游，便于对转基因家蚕进行筛选和鉴定。

为了将“蚕丝L链-脂酶B1”融合基因有效地转移到家蚕基因组中，本发明采用根据转座子piggyBac构建的基因转化系统。转座子piggyBac约2kb大小，来自鳞翅目昆虫粉纹夜蛾Trichoplusia ni。研究表明，该转座子能够在多种鳞翅目和双翅目昆虫中转座。其发生转座的机理在于：piggyBac转座子两末端各有一个重复序列，两个重复序列的排列方向相反，称作反向末端重复序列。两个反向末端重复序列之间包括两个阅读框，其中一个阅读框编码转座酶。发生转座时，转座酶通过识别反向末端重复序列促进两反向末端重复序列之间的DNA片段的转座。本发明利用DNA重组技术，将完整的重组“蚕丝L链-脂酶B1”基因和完整的GFP报告基因通过一个人工接头相连，并用正确连接得到的DAN片段替代piggyBac转座子反向末端重复序列之间的序列，从而将来piggyBac转座子改造成为基因转移载体。该基因转移载体能够稳定地将目的基因转移并整合到家蚕基因组中。

转座子发生转座除需要反向末端重复序列之外，还必需转座酶的参与。转座酶识别反向末端重复序列，并实现两个反向末端重复序列及其内部的DNA片段发生转座。为实现转移的基因稳定整合到家蚕基因组中，可将转座酶从piggyBac转座子的两个反向末端重复序列之间分离出来，将其克隆至另一载体中，并在其前端加上A3启动子，以此构成辅助质粒载体。在进行转基因家蚕试验时，辅助质粒上的转座酶基因发生瞬时表达，保证转座反应的顺利进行。

这种由piggyBac转座子改建的双质粒转基因系统将需转座的目的基因和转座酶分离，不但可以实现目的基因在家蚕基因组中的高频率整合，而且保证了转基因家蚕中整合基因的遗传稳定性。

将上述得到的脂酶B1基因与蚕丝L链融合基因表达载体和含转座酶的辅助质粒同时转化家蚕卵。注射后的家蚕卵经过常规孵化和培养，形成幼蚕。

注射后的蚕卵经过常规饲养，直到长到5龄幼蚕，在波长390纳米酶紫外线下检测家蚕中报告基因GFP的表达水平，标记GFP阳性个体。家蚕上簇结茧后，对GFP阳性个体蚕茧理化性质进行检测，标记含解毒酶成分的个体。对含解毒酶成分的个体进行杂交育种，通过培养和筛选被转化的家蚕，得到稳定表达外源解毒酶基因的转基因家蚕。选育得到的这种转基因家蚕在结茧时，能合成和分泌解毒酶蛋白，在其基因组内含有脂酶B1基因的核酸序列，并在蛹体中得到高效表达。

本发明中采用的piggyBac转座子的反向末端重复序列具有特异的DNA序列，能被转座酶所识别，并在转座酶的作用下，带动包含在反向末端重复序列内部的DNA片段发生转座。可采用人工合成与piggyBac转座子的反向末端重复序列相同的DNA序列，便于DNA重组操作。另一人工合成序列为完整的蚕丝蛋白L链cDNA-脂酶B1基因cDNA表达单元与GFP报告基因表达单元之间的连接序列：一段30bp长的多克隆位点区的人工接头。

本发明将脂酶B1基因cDNA与家蚕L链基因cDNA相连，形成重组基因。一方面保证了解毒酶的顺利合成、分泌，另一方面，该重组基因的产物为脂酶B1和家蚕丝蛋白L链的融合蛋白，解毒酶成为这种新型家蚕蛋白的一个有机组成部分。

本发明采用双质粒系统进行目的基因转移：将来自粉纹夜蛾的piggyBac转座子改造成为基因转移载体，可以把蚕丝L链基因和脂酶B1基因组成的重组基因高频整合到家蚕的基因组中；而将转座酶基因从基因转移载体中删除，构建成瞬时表达的辅助载体。因此整合到家蚕基因组中的重组脂酶B1基因可以稳定地保持在基因组中。通过杂交育种和筛选获得的纯合重组脂酶B1基因的转基因家蚕，其分泌重组解毒酶的特性将随转基因家蚕染色体的复制、分离而稳定地遗传给子代。

综上所述，该发明获得的由基因载体质粒和辅助质粒二者共同构成的家蚕基因转移系统，可以确保外源目的基因在家蚕基因组中的多拷贝、高频率整合，进一步提高外源基因的表达水平。因此，研制的整合载体，通过转座的方式，可实现外源基因在家蚕基因组中高频率的整合，转化频率可达7％。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：方法易行，操作简便，转化率高，经检测转基因家蚕蛹中脂酶B1含量为52％，为获得解毒酶开辟了新的途径，具有显著的社会和经济效益。

                          附图说明

图1转基因家蚕快速分子鉴定和Southern杂交分析

其中：图2-1：PCR扩增阳性产物；7：阴性对照 图2-2：PCR扩增阳性产物；7：阴性对照

图2转座子表达质粒pZAGFP的构建

                       具体实施方式

实施例1

“蚕丝蛋白L链-脂酶B1”融合基因表达单元的构建

首先提取家蚕后部丝腺中的mRNA，根据已知的家蚕丝蛋白L链基因的序列，设计上、下游引物(上、下游引物序列分别为：5’-tggatccgcggcgcgttaccatatatg-3’，5’-gcgatatcacgccctgatgg-3’)，经RT-PCR扩增获得家蚕丝蛋白L链cDNA，大约为0.8Kb，其中包括信号肽序列。

从家蚕总DNA中，根据已知序列设计引物(上游引物序列：5’-tggatccgcggcgcgttaccatatatg-3’，下游引物序列：5’-gcgatatcacgccctgatgg-3’)，扩增出L链5’端及其上游的启动子区域约1.2Kb的DNA片段，以及L链3’端0.5Kb的终止子片段。

按照Mouches等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1990，87：2574-2578。Mouches C et al.)报道的脂酶B1cDAN序列，提取抗双硫磷致倦库蚊(TEM-R)的mRNA，设计引物(上游引物序列：5’-cgcatatgatgagtttggaaagc-3’，下游引物序列：5’-ctcccagacattacgatacgc-3’)，经RT-PCR扩增获取脂酶B1cDNA起始秘码子ATG以后的665bp片段脂酶B1 cDNA 5’端B1(a)。将其与脂酶B13’端cDNA 1.33kb的B1(b)一起构建成全长脂酶B1基因。

将上述片段按正确的读码框连接成融合的蚕丝L链-脂酶B1基因。首先将脂酶B1基因cDNA的PCR扩增序列按正确的读码框插入到L链cDNA的3’末端区域第7个外显子之中，构建成L-EB1融合片段，然后分别在此融合片段的5’端和3’端加上L链启动子序列和终止子序列，形成完整的脂酶B1与L链的融合基因L-EB1。

实施例2

整合型基因载体的构建

提取家蚕基因组DNA，根据家蚕细胞质肌的动蛋白基因(A3)序列经PCR扩增获得A3启动子片段。将A3启动子片段以适当的阅读框与GFP基因编码区序列连接。将SV40polyA信号序列，插入到融合的GFP基因下游，形成完整的GFP基因表达单元。在完整的GFP基因片段上游加上一段长30bp的多克隆位点区(MCS)的人工接头(核苷酸序列为：

5’-ACCGCGGTCTAGAGGATCCCGGGCTGCAGT-3’)。将脂酶B1基因与L链的融合基因L-EB1表达单元与完整的GFP基因表达单元通过多克隆位点区连接在一起，得到重组DNA片段。在重组DNA片段基因的外侧分别加上piggyBac转座子的反向末端重复序列(核苷酸序列5’-CGCCGCGGCC CTAGAAAGATAGTCTGCGTA AAATTGACGC ATGCTGCAGT G-3’)，并将该片段克隆在载体pBS中，构建成家蚕转基因系统的基因运载质粒。

实施例3

辅助质粒构建

将piggyBac转座子中的转座酶编码区序列采用PCR技术进行克隆。在转座酶基因的编码区前边加上A3启动子，并克隆至质粒pUC18中，即为基因转移系统的辅助质粒。L-EB1基因载体质粒和辅助质粒二者共同构成了家蚕基因转移系统。该系统通过转座的方式，实现外源基因在家蚕基因组中高频率的整合，转化频率可达7％。该系统可以确保外源目的基因在家蚕基因组中的多拷贝、高频率整合，进一步提高外源基因的表达水平。

实施例4

转脂酶B1基因家蚕的获得

家蚕的基因转化。把上述构建的基因转移系统，用显微注射仪注入家蚕蚕卵中，25℃培养，孵化，形成蚁蚕，用桑叶喂养。转基因家蚕的筛选和鉴定。家蚕进入5龄期的第二天，即可用于转基因家蚕的鉴定。用350nm-390nm荧光检验仪，通过对GFP报告基因的检测，初步鉴定出转基因家蚕。研究中，注射了1500只蚕卵中，成活825头幼蚕，510条能形成产卵的蛾子，G0代中7％显示荧光蛋白阳性。对转基因家蚕进行继代培养，其GFP荧光特性表现为孟德尔式遗传。将获得的荧光蛋白阳性家蚕进行回交和姊妹交配，将产下的蚕卵(G₁代)分为两份，一份采用荧光蛋白基因的上下引物进行PCR扩增，若显示阴性，弃去另一份蚕卵，若为阳性，则保留另一份，并于5龄以后第二天，再用荧光仪检测。对荧光检测的阳性G₁代部分个体，提取总DNA，用针对GFP基因的引物进行PCR快速分子鉴定，并对阳性个体的总DNA用针对脂酶B1基因的特异性探针进行Southern杂交分析(图1为以脂酶B1基因特异性片段为探针进行的Southern杂交的结果)。对阳性个体进一步进行姊妹交，以纯化转基因家蚕直至G3代，获得的G3后代阳性个体即为外源基因稳定整合的转基因家蚕。抽取转基因家蚕后部丝腺的蛋白质，抽检蚕蛹中的蛋白质，进行SDS-PAGE分析等系列鉴定，结果表明脂酶B1蛋白含量高，约占总蛋白质的52％。

                                 序列表

家蚕胞质肌动蛋白基因启动子及部分编码区序列：

调控序列SRE，ActE1，TATA及起始密码子分别被标识，第一行：A3.1片段测序结果：

第二行：欧洲200×300家蚕品种BmA3基因相应序列；第三行：BmA4基因相应序列

                         SRE                                                       ActEl

A3.1：     CCGCOTTACCATATATGGTGC-AAAA-CTGAGT-----------CAGCUCGCGATTGGTGGAAAAACAAACTGGAGCCGATACTGTGTAAATTGTGATAAC--G

           ||||||||||||||||||||  |||| ||||||           |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||  |

Europ A3：GCGCGTTACCATATATCOTGACAAAAAUTGAGT-----------CAOCCCCCOATTOOTGGAAAAACAAACTGGAGCCGATACTGTGTAAATTOTOATAAC--G

BmA4：    Gtaa--TACCATATATGGacacaaaa-cttcGTgtattgtaccctAGCGCGCGATTGGAGGAgAgtctgcggcggcggGgcaggGgcgcccc---GATAACcaG

          TATA-box                 +l

9l GCTCTTTTATATAGTTTATCCTCACGAGTCGGTTCTCATTTACT---AAGGTGTGCTCGAACAGTGCGCATTCGCATCTACGTACCTACTTGT

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18l CACTTATTTAATAATACTATGTAAGTTTTAATTTTAAAATTGCGAAAGAAAAAAAAACATATTTATTTATTTGTAAAATTTGAATTTCGA

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75l TTCCCCTCGATCGTCGGAAGGCGCCGCCATCAGGGCGTGATG

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    TTCCCCTCGATCGTCGGAAGGCCCCGCCATCAGGGCGTGATC

家蚕丝蛋白L链cDNA的核酸序列：

ACCACTAAAA TGAAGCTATA       TTTTTGGTAT    TACTCGTCGC    TACAAGCGCC                   50

TACGCTGCAC     CATCGGTGAC     CATCAATCAA    TACAGTGATA    ATGAAATTCC     ACGCGACATT    110

GATGATGGAA     AAGCTAGTTC     CGTAATCTCA    CGTGCATGGG    ACTACGTCGA     TGACACTGAC    170

AAAAGCATCG     CCATCCTCAA     CGTTCAAGAG    ATCTTGAAGG    ACATGGCCAG     CCAGGGCGAT    230

TATGCAAGTC     AAGCATCAGC     GGTGGCCCAA    ACCGCCGGAA    TTATCGCCCA     TCTATCTGCC    290

             G GT

AGGTCCGGAA     ACTTCGCCGG     CTTCAGACAA    TCTCTCGGTC    CCTTCTTCGG     ACACGTGGGA    410

CAAAACTTGA     ATCTTATCAA     TCAACTCGTC    ATCAACCCTG    GTCAACTCCG     ATACTCTGTC    470

GGACCAGCCC     TGGGTTGTGC     CGGAGGTGGA    AGAATCTATG    ACTTCGAAGC     CGCTTGGGAT    530

                                   AGT

                                                                 ATA

     CCT

GGCGTTGGCA     ACGGTAATGC    GCGAC                                                     735

L-链启动子片段的核苷酸序列：

1    GGCTATATTC AGACTCGCCA AGTTACGTCA GTCGTATTGT AATGAGCGAT TTAGTGGGCA

                   C

61   ACTTCATTCT GTTAATTTTG TGTCACGGTG CGCGCGCATC GTAAAATTTC ACTCTCATAG

                                                         C

121  ATTTTTCATA ACGTGCCTAA AGAAGTATAA CTTCAATGAT TTAAATT AA AAAAAAACAT

                                             A          T

181  GCATAGAATA ATTATATGAA TTATTTAAAA TGTCATTTAC CGACATTGAC ATAACAGACG

241  ACGTTAACAC TACAAAACAT TTTAATTCCA CATTGTTACA TATTCAACAG TTAAATTTGC

                                7                            6

301 GTTAATTCTC GATGCGAACA AATATAAGAA CAATCGGATC AATTAGATCG CTTTGTTTCG

                                                   5

361  AGCAACACTT AGTTTAACTA GAGGCGTACA CCTCAAGAAA TCATCTTCAT TAGAAACTAA

    A                                              4

421  ACCTTAAAAT CGCATTAATA AAGCATAGTC AATTTTAACT GAAATGCAAA ATCTTTTGAA

                    A  3                                      G

481  CGTTAGATGC TGTCAGCGTT CGTTGGTACA GTTGTTTGAT ATTTATTTTA ATTGTCTTTT

                                                  2

541 TATATATAAA TAGTGGAACA TTAATCACGG AATCCT

                            1             +1

L链3’端终止子片段的核酸序列：

taaataa gaactgtaaa taatgtatat atataattat ataaaagata tatataacca

tatacaaaca tatatatcat tataagacaa tctacctata taaaaacaga ctaaaattaa

taattatgta tactttaatt gtgtttagga cattttatgc aaattgtgtt tgcgttagga

ttttttttgg aagtttttta gattatttat gaatatataa ataaatatac gttaatataa

tatatattat ataaatcaac gacacggctt ttcattttgg tgatgatcaa tcttattgtt

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