一种Bcl－2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸抗癌药物及其制备方法与用途

摘要

涉及一种核苷酸，尤其是一种抑制人体恶性肿瘤细胞生长的Bcl－2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸抗癌药物及其制备方法与用途。所说的Bcl－2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸的DNA序列为5’－TCCCAGCGTGCGCCATCC－3’。能特异性地与肿瘤细胞Bcl－2mRNA以碱基互补结合，封闭其表达，从而促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞生长，达到抗癌治癌的目的。

说明书

(1)技术领域

本发明涉及一种核苷酸，尤其是一种抑制人体恶性肿瘤细胞生长的Bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸抗癌药物及其制备方法与用途。

(2)背景技术

不少生物技术新药对于人体多种疾病的临床试验已取得很大的进展，其中包括治疗一些病毒、炎症引发的疾病，乃至爱滋病、戒毒和恶性肿瘤等。CN1119830A号发明专利申请提供一种反义抑制C-myc以调节平滑肌细胞的增殖反义序法。CN1175281A号发明专利申请提供一种立体特异性硫代磷酸寡核苷酸的合成方法。在该方法中，一种包括多个脱氧核糖核苷酸和在5¹末端或5¹倒数第二位的一个核糖核苷酸的引物与模板退火。该结构与脱氧核苷α-三磷酸Sp非对映异构体和DNA聚合酶的混合物接触，形成一种PS-Rp寡脱氧核苷酸延伸物，该延伸物通过在引物中的核糖核酸之后裂解而作为单链PS-Rp寡核苷酸释出。CN1153476A号发明专利申请提供一种寡核苷酸硫代磷酸酯在排除补体和降低血压中的应用，将一种寡核苷酸施用灵长类动物，然后测定血压的降低或补体的活性的降低。所施用的寡核苷酸长度为2～50个核苷酸，具有至少一个硫代磷酸酯核苷酸间连接键。CN1150431A号发明专利申请公开一种用阴离子交换层析法纯化寡脱氧核苷酸硫代磷酸酯的改进方法，应用DMAE离子交换层析来分离和纯化寡核苷酸硫代磷酸酯。CN1227227A号专利申请公开一种抑制人体恶性肿瘤生长的反义核苷，其DNA序列是：5’AGGTGGAGCTGCCTGGACAT3’。它能抑制内Bcl-2基因的表达，以阻止Bcl-2蛋白的合成，而Bcl-2的高表达与多种肿瘤发生和发展有关，从而排除了肿瘤细胞走凋亡途径的障碍，达到杀死肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞发展，最终达到治疗人体恶性肿瘤的目的。

(3)发明内容

本发明旨在提供一种能特异性地与肿瘤细胞Bcl-2 mRNA以碱基互补结合，封闭其表达，从而促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞生长，达到抗癌治癌目的的Bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸抗癌药物及其制备方法。

本发明所说的Bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸的DNA序列为5’-TCCCAGCGTGCGCCATCC-3’。

Bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸(Bcl-2 AS-PS-ODN)的特点

1、Bcl-2 AS-PS-ODN的分子量：5376。

2、Bcl-2 AS-PS-ODN的链数：单链。

3、Bcl-2 AS-PS-ODN的长度：18bp。

4、Bcl-2 AS-PS-ODN的类型：反义单链DNA。

5、Bcl-2 AS-PS-ODN的化学修饰：以硫原子取代寡脱氧核苷酸中磷酸二酯键上的氧原子。

6、Bcl-2 AS-PS-ODN的结构式：

            腺嘌呤            鸟嘌呤             胞嘧啶             胸腺嘧啶

Bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸的制备工艺为：1)、取载体和碱基单体，加二氯乙酸进行脱三苯甲基；2)、加四唑催化偶联反应，形成3’-5’亚磷酸三酯；3)、加硫代试剂Beaucage进行硫代反应；4)、在N-甲基咪唑催化下，加乙酸酐完成封闭反应；5)、合成产物进行离子交换纯化和脱盐；6)、经浓缩、定量、灌装、冻干而成。

所说的Bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸可应用于抑制人体恶性肿瘤细胞的生长，起防治的作用。通过动物药代动力学研究表明，Bcl-2 AS-PS-ODN静脉给药后血浆分布半衰期及血浆消除半衰期均较短，说明药物较快从血液循环中到达各脏器组织，提示该药将会较快发挥效能。同时该药在各脏器组织中停留时间较长，其发挥效能的持续时间较长。通过Bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸的药效学研究表明，本发明对恶性肿瘤有明显的治疗结果，有明显抑制肿瘤细胞生长和促进肿瘤细胞凋亡的作用。综上所述，Bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸的特性为

1、能通过肿瘤细胞的细胞膜进入肿瘤细胞内。

2、能在肿瘤细胞内停留。

3、具有对抗肿瘤细胞内和血浆、体液中的核酸酶的降解作用。

4、能与肿瘤细胞内的抗凋亡癌基因Bcl-2 mRNA以碱基互补结合成稳定的复合物，从而封闭Bcl-2 mRNA的表达，促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞生长。

(4)附图说明

图1为F951不同剂量在不同时间的血浆药物浓度曲线。(横坐标为时间t，纵坐标为血浆药物浓度M)。

图2为F951 10mg/Kg iv后各时间点、各脏器内药物的分布曲线。(横坐标为时间t，纵坐标为放射性活度值P，曲线1肾，2脾，3肺，4骨髓，5肝，6心，7脑，8脂肪，9肠，10肌肉，11皮肤，12生殖器)。

图3为F951的排泄曲线。(横坐标为时间t，纵坐标为排泄量(给药量的百分比，曲线1粪+尿排泄量，2尿排泄量，3粪排泄量)。

图4为恶性淋巴瘤裸鼠治疗前各组(a盐水对照组、b无义对照组，c反义药物组)肿瘤大小对比。

图5为恶性淋巴瘤裸鼠治疗第21天各组(同图4)肿瘤大小对比。

图6为各组(同图4)离体瘤块大小对比。

图7为治疗后各组(同图4)肿瘤组织病理检查结果对比。

图8为治疗后各组(同图4)肿瘤细胞原位凋亡TUNEL检测结果。

图9为肿瘤细胞Bcl-2蛋白流式细胞仪检测结果。

(5)具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

Bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸的制备方法如下：

(一)本发明所说的Bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸抗癌药物的制备工艺流程如下：1)、取载体和碱基单体，加二氯乙酸进行脱三苯甲基；2)、加四唑催化偶联反应，形成3’-5’亚磷酸三酯；3)、加硫代试剂Beaucage进行硫代反应；4)、在N-甲基咪唑催化下，加乙酸酐完成封闭反应；5)、合成产物进行离子交换纯化和脱盐；6)、经浓缩、定量、灌装、冻干而成。

(二)Bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸合成反应式

1、脱三苯甲基

2、偶联反应

3.硫代反应

4.封闭反应

(三)Bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸合成的条件、方法和步骤

1.连接电源及UPS，顺序打开主机、电脑。

2.将各试剂空瓶装上ACN，用手动控制清洗 各管道及阀门(从System Control中的manual打开对话框，点击flowpath的solvent及Amidite去Waste，INSERT。再Execute，再转换点击pump的flow reagent设置流速为20ml/min，冲洗一段时间后按pause。

3.合成前作一个P50 Calbration校正流速，按PC机提示完成，其中将T管道取下放入100ml量筒中，收集ACN。

4.配制单体的浓度：

0.2mT(5g包装)加33.5ml ACN溶解混匀，并加入适量分子筛，以盖过单体保护过滤皿为最低标准

0.2mdA(5g)加29ml ACN溶解混匀，并加入分子筛。

0.2mdC(5g)加30ml ACN溶解混匀，并加入分子筛。

0.2mdG(5g)加29ml ACN溶解混匀，并加入分子筛。

并将四种碱基装在仪器上，将管道套上过滤头，伸入到底部，让分子筛盖过它。

5.标准四种碱基位置及其缺省的位置都用空瓶装上ACN。

6.将1-HTetrazole打开放入分子筛(检查是否已套上Filter)，将capB2倒入capbl，用力混匀，再将乙腈(8升)倒入大瓶，再将DCA装入中瓶中(4×12)。

7.取制备硫代试剂(Beaucage)1g加入10ml ACN(以新分子筛处理之ACN为合)，每次现用现配。从Sys comtrol到manual的flowpth，选择solvent的ACN，点击insert和excute，再选择pump的flonreagent冲洗一段(约5ml)后，按pause，换上硫代试剂(Beaucage)，按continue，先让管道充满试剂。过试剂泵后，约让其冲4毫升。

装好各试剂后，运行各试剂，File到meth中的presyspuge

8.各试剂都连接好后，称柱，并将装好的柱子装上仪器。

9.在sys单的File选择NEW的meth中的fix column recycling点击ok，选择sequence，选择DNA，Six，修饰输入序列，最后一个碱基改成O(标准)，最后Save AS。再create建立一个方法名称(若前面已建立可选择)，Toff

10.将参数对话框打开，填入载体重量及载体的浓度，并选择Efficeacy threchold为-1，再点击保存工具栏上(试剂的设置参数在桌面上的右下目录，建立一个方法后可在此查看试剂用量)。

11.设定好方法及参数后，回到主菜单，选择方法(右键)Run，填写好各对话框后按next，最后按开始。

12.合成好后，将柱子取下，抽真空30min，并称其重量。打开盖子，将其载体倒入玻璃瓶中，并取25ml氨水(6.3ml)倒入瓶中，混匀，放入65℃水浴八小时，后放置到4℃30min。

13.用真空抽滤去载体，并用50％乙醇清洗，合并在一起为100ml备纯化用。

(四)Bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸的纯化和脱盐

1.连接电源及UPS，顺序打开主机、电脑。

2.将A1及B1放入相应的缓冲液中，用封口膜将瓶口封好。

3.在sys.control菜单下，下拉manual的folw，设置1ml/min流速，装上离子交换柱(RESOURCE 6ml)，装柱时先装上端后装下端。装好柱后，运行洗泵程序。

4.上样，将2ml合成好的oligo溶液用注射器加入样品环中，不要将注射器拨出。

5.运行已预先编辑好的程度(Resource 6ml)，条件如下：

柱子：Resource 6ml，(16×30mm)A＝2cm2

梯度：40～100％Bin 30CV 10ml/min＝300cm/h

缓冲液：A(10mmNaOH，0.5MNacl)B(10mmNaoH，2MNacl)

收集：每管8ml从50％至90％B

6.检测每管的OD值，收集峰值最高部分，混合均匀，再测其OD值，打印纯化报告。

7.最后清洗柱子程序：将A1B1放入H2O中，运行pump wash，然后设置流速为10ml/min，直到电导值下降至平稳不变时停止运行。

8.将A1放入20％乙醇中，5ml/min，运行5CV，最后取下柱子，取柱时顺序与装柱时相反。

9.关上电脑及主机、电源，整理好实验器材及物品。

(五)Bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸的灌装

1.旋转氮气瓶阀，使压力表指示在5～7bar之间，打开灌装机后面电源开关，仪器前面模式纽处于“Auto”位置。

2.将瓶子放置于转盘上，自动进入瓶闸，传感器检测到瓶子后，将瓶子推向进样区自动进样。

3.进样结束后，另一空瓶又被推向进样区，同时将灌装好样品的瓶子推入出口托盘处，每一瓶子加塞，塞至胶塞1/3位置。

4.出口托盘放满瓶子后，可再更换另一空盘。

5.灌装结束后，用三蒸水清洗硅胶管，从蠕动泵上取下管子，37℃烤箱烘干，高压备用。

(六)Bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸的真空冷冻干燥

1.无菌分装液体药品于小瓶内，塞上瓶塞，塞至瓶塞1/3位置，放于冻干箱板层上，每一板层各选一瓶伸入冻干机温度探头。

2.打开总电源开关，设定好温控表上降温数值，再开板温控制开关，板层开始降温。

3.观察药品已预冻结实，温控表显示药品温度已降至设定值后，开冷阱降温开关，开始冷阱降温。

4.冷阱温度降至-40℃以下后，旋紧冻干机右侧放气阀，顺时针方向关闭主蝶阀，再打开真空泵开关，此时冷阱门橡皮圈吸住，1分钟后，逆时针方向打开主蝶阀，冻干箱门橡皮圈也被吸住。

5.真空度显示表数值达到2×10^-1mbar左右，设定温控表温度在0℃～-5℃之间，进行产品第一阶段升华干燥，在此过程中可见产品体积越来越小，直到呈棉絮状，将温控表温度上调至25℃左右，进行第二阶段解吸干燥，持续2～3小时。

6.冻干结束，按液压缸下降钮，下压板层，待瓶塞全部进入瓶内，停止按压，关闭真空泵、冷阱降温、板温控制和总电源开关，再关闭主蝶阀，打开放气阀，取出冻干药品，扎盖机扎盖后，4℃保存药品。

Bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸的动物药代动力学研究

(一)试验目的：了解反义药物Bcl-2 AS-PS-ODN在动物体内动态变化的规律及特点，观察该药在小鼠体内分布、平衡、消除、排泄的动态过程，并计算出各种药代动力学参数，为临床合理用药提供药代动力学数据及参考。

(二)受试药物：

1.名称：Bcl-2 AS-PS-ODN

2.编号：F951。

3.含量、效价、制剂标示量：10mg/瓶。

4.溶剂：0.05m PBS，PH7.8。

5.配制方法：Bcl-2 AS-PS-ODN用³H标记，放射性浓度0.5mCi/ml，放射比活度～0.8mCi/mg，溶剂0.05m PBS，PH7.8。

A液配制：未标记F951 11.5mg+dH₂O 2.3ml，配成5mg/ml(-20℃保存)。

B液配制：³H-F951放射性浓度0.5mCi/ml。

20mg/kg组的配制：A液0.4ml(含F951 2.0mg)+B液0.2ml(含100μCi)+PBS 0.4ml＝1ml，供5只动物使用，每只0.4mg，20μCi，0.2ml

10mg/kg组的配制：A液0.2ml(含F9511.0mg)+B液0.1ml(含50μCi)+PBS0.7ml＝1ml，供5只动物使用，每只0.2mg，10μCi，0.2ml

5mg/kg组的配制：A液0.1ml(含F951 0.5mg)+B液0.2ml(含25μCi)+PBS0.85ml＝1ml，供5只动物使用，每只0.1mg，20μCi，0.2ml

(三)试验动物

1.来源、种属、品系、合格证：BALB/C小鼠由中国科学院上海实验动物中心提供，有合格证。

2.体重：16～20g。

3.性别：均为雄性。

4.动物总数：40只。

(四)试验内容

1.代动力学参数测定。

2.药物的分布。

3.药物的排泄。

(五)试验方法

1.药代动力学参数测定：

1.1.器设备：XH-6901型液体闪烁计数仪，西安二六二厂生产。

1.2.剂量组设置：在有效安全剂量内选用下列3个剂量：³H-F951 5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg。

1.3.每组动物数：每组5只，3个剂量组共15只。

1.4.给药途径：尾静脉注射。

1.5.给药效数：单次给药。

1.6.试验步骤：药物单次静泳注射后，在5’、10’、30’、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h等共10个时间点眼眶采用，分离血浆，通过液体闪烁计数仪测定血浆内的药物浓度，计算各种药代动力学参数，并绘制药-时曲线。

2.药物分布

2.1.仪器设备：XH-6901型液体闪烁计数仪，西安二六二厂生产。

2.2.选一个有效剂量：³H-F951 10mg/kg

2.3.选4个时间点：0.5h、2.0h、8.0h、24.0h分别代表分布相、平衡相、消除相的药物分布。

2.4.每组动物数：每个时间点动物5只，4个时间点共20只。

2.5.给药途径：尾静脉注射。

2.6.给药次数：单次给药。

2.7.试验步骤：药物单次尾静脉注射后，于给药后0.5h、2h、8h、24h等4个时间点分别各处死5只小鼠，称完整的心、肺、肝、脾、肾、脑等脏器的重量，剪取少许心、肺、肝、脾、肾、脑、骨髓、肠、肌肉、脂肪、皮肤、生殖器等12种器官组织，通过液体闪烁计数仪测定各脏器的药物分布。

3.药物的排泄

3.1.选择一个有效剂量：³H-F951 10mg/kg。

3.2.动物：BALB/C小鼠5只。

3.3.给药途径：尾静脉注射。

3.4.给药次数：单次给药。

3.5.试验步骤：取体重相仿约20g的小鼠5只，按压下腹部提尾使小鼠排空膀胱后，尾静脉注射³H-F951 10mg/kg 0.5μCi/g，放入代谢笼，自由摄食饮水，常规饲养，分别收集给药后0～6h、7～12h、13～18h、19～24h、25～32h、33～40h、41～48h、49～56h、57～64h、65～72h共10个时间段的尿、粪，每个时间段交界时按压小鼠下腹部挤出尿、粪收集，并清理代谢笼的收集漏斗。收集的尿、粪立即-20℃保存。

(六)试验结果

1.Bcl-2 AS-PS-ODN药代动力学参数测定结果：

1.1.血浆分布半衰期：Bcl-2 AS-PS-ODN静脉给药后在血浆中分布迅速，血浆分布半衰期(t1/2α)10mg/kg组为0.1673±0.0379(见表1)。

1.2.血浆消除半衰期：Bcl-2 AS-PS-ODN静脉给药后在血浆中的消除也较快，消除半衰期(t1/2β)10mg/kg组为2.2328±1.0965(见表1)。

1.3.血浆药代动力学的其他参数：见表1。

                   表1 F951药代动力学参数

                                  剂量组

参数          5mg/kg              10mg/kg            20mg/kg

t1/2α(h)     0.2760±0.1255      0.1673±0.0379     0.2601±0.1332

t1/2β(h)     2.830±1.2971       2.2328±1.0965     4.4247±3.3333

K₂₁(h^-1)    0.3932±0.1562      0.6810±0.2738     0.3655±0.2348

K₁₀(h^-1)    2.1653±0.8318      2.5085±0.8246     1.9621±0.3992

K₁₂(h^-1)    0.7406±0.8951      1.5442±1.1010     1.0010±0.7411

V₁           2.0256±1.4396      0.8502±0.2731     0.7581±0.1941

V₂           14.2196±11.2341    5.3084±2.6287     9.4728±10.5030

V             16.2452±12.3892    6.1586±2.7542     9.8309±10.9301

CL            3.6386±1.4217      1.9882±0.3207     1.4475±0.3362

AUC           1.5205±0.4781      5.1445±0.9025     14.3257±2.7610

1.4.血药浓度-时间曲线(药-时曲线)：低剂量(5mg/kg)、中剂量(10mg/kg)、高剂量(20mg/kg)等三个剂量组在5’、10’、30’、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h等10个时间点的血浆浓度见表2。其药-时曲线见图1。

       表2  F951不同剂量在不同时间的血浆药物浓度

                 血浆药物浓度(μg/ml)

时间(分钟)

         5mg/kg            10mg/kg            20mg/kg

5        3.5018±0.6701    10.3658±3.0277    23.866±5.1706

10       1.8600±0.7747    6.0350±1.8068     16.8052±2.9260

30       0.8512±0.6317    1.8656±0.3582     5.9188±1.0031

60       0.3404±0.2347    0.7656±0.1421     3.0426±2.1876

120      0.1176±0.1159    0.3390±0.1992     0.8198±0.4954

240      0.0778±0.0780    0.2268±0.1842     0.4500±0.3960

480      0.0330±0.0188    0.1918±0.0628     0.3425±0.3808

720      0.0440±0.0572    0.0514±0.0298     0.2486±0.3287

1440     0.0062±0.0139    0.0902±0.1490     0.1866±0.1774

2880     0                 0                  0.001±0.0017

2.Bcl-2 AS-PS-ODN在脏器中的分布。

2.1.分布的脏器：Bcl-2 AS-PS-ODN 10mg/kg剂量静脉给药后，广泛分布在各脏器中。静脉给药后2小时药物在各脏器中分布多少(放射性活度值dpm/10mg)依次为肾、骨髓、肝、脾、肌肉、心脏、生殖器、脑、脂肪、肺、皮肤、肠(见表3)。

2.2.脏器分布的时间：静脉给药10mg/kg后半小时，药物即开始在各脏器中分布，给药后24小时，各脏器仍有较多的药物分布(见表3)。各时间点、各脏器内药物的分布曲线见图2。

                表3 F951 10mg/kg iv后各时间点、各脏器内药物的分布

                               放射性活度值(dpm/10mg)

脏器       0.5h             2.0h                8.0h                24.0h

肾      10826.64±664.01    12708.66±17276.23  6437.02±4622.79    4388.95±5367.09

骨髓    6239.08±3551.91    4775.01±2263.88    4508.13±4594.88    1902.54±2366.43

肝      4797.44±3871.78    3951.17±3539.89    5189.35±6197.34    1664.29±1063.08

脾      4188.68±1774.51    3133.70±1557.25    4466.15±4433.40    4457.10±6738.32

肌肉    1314.68±694.90     2456.45±2896.02    1021.73±609.65     944.71±1002.16

心      2813.59±2980.93    2102.18±1564.16    2522.99±2806.46    1339.32±1176.39

生殖器  1216.97±581.65     1723.02±1319.29    2033.31±1181.58    568.85±384.91

脑      972.26±664.01      1626.47±1275.82    2831.51±4517.07    1184.81±1283.24

脂肪    1395.44±818.19     1447.48±1377.38    1403.84±837.76     1132.53±1345.34

肺      2474.36±911.17     1179.11±1137.11    3207.29±3968.59    2448.18±3384.84

皮肤    1054.59±203.62     1074.56±409.19     1587.65±1412.50    808.66±560.00

肠      1627.74±1175.29    1053.62±608.30     1397.36±441.80     1068.59±797.23

3.Bcl-2 AS-PS-ODN的排泄

3.1.排泄途径：Bcl-2 AS-PS-ODN静脉给药后主要排泄途径为尿排泄，少量从粪排泄，静脉给药后24小时，50.47％的药物从尿中排泄，仅3.60％从粪中排泄(见表4)。

3.2.排泄时间：Bcl-2 AS-PS-ODN静脉给药后6小时，即开始有药物从尿中(36.63％)及粪中(1.26％)排泄，第一天排泄较快，尿、粪共排出54.07％，第2天只排出3.90％，第3天只排出1.88％，随着时间的延长，每日排泄量逐渐减少。给药后72小时，从尿、粪中仅排泄出59.85％。各时间点尿、粪排出量见表4，排泄曲线见图3。

               表4 F951的排泄

时间         尿排泄        粪排泄       尿+粪

(h)           (％)          (％)        (％)

0             0             0           0

6             36.63         1.26        37.89

12            44.93         2.16        47.09

18            49.53         3.14        52.67

24            50.47         3.60        54.07

32            51.52         4.17        55.69

40            52.22         4.40        56.62

48            53.17         4.80        57.97

56            53.64         5.01        58.65

64            54.03         5.28        59.31

72            54.31         5.54        59.85

(七)Bcl-2 AS-PS-ODN药代动力学研究结论

1.Bcl-2 AS-PS-ODN静脉给药后血浆分布半衰期及血浆消除半衰期均较短，说明药物较快从血液循环中到达各脏器组织，提示该药将会较快发挥效能。

2.Bcl-2 AS-PS-ODN静脉给药后广泛分布到各脏器组织，包括肾、骨髓、肝、脾、肌肉、心脏、生殖器、脑、脂肪、肺、皮肤、肠等，提示各脏器组织的肿瘤可能都是Bcl-2 AS-PS-ODN发挥效能的场所，尤其是分布较多的脏器肾、骨髓、肝、脾、肌肉等，可能是该药发挥效能的主要场所。

3.Bcl-2 AS-PS-ODN静脉给药后排泄较慢，第一天尿、粪排泄出给药量的54.07％，第2天尿、粪排泄出3.90％，第3天尿、粪排泄出1.88％，随着时间延长，每日排泄逐渐减少。说明该药在各脏器组织中停留时间较长，提示其发挥效能的持续时间较长。

Bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸的药效学研究

药效学研究首先成功建成恶性淋巴瘤裸鼠模型，取恶性淋巴瘤裸鼠15只，随机分为3组，每组5只。A组为盐水对照组(NS对照组)，注射0.2ml生理盐水。B组为无义对照组(FNS18对照组)，注射0.2ml无义核酸(剂量10mg/kg，无义核酸序列的碱基总数及各种碱基数和反义药物相同，但排序杂乱，不能和肿癌细胞的Bcl-2mRNA互补结合)。C组为反义药物组(F951治疗组)，注射0.2ml反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸(剂量10mg/kg)。3组均为肿瘤局部注射，每日1次，共注射21天。实验结果如下：

1.治疗前3组肿瘤大小相似(见图4)。治疗21天后，反义药物组肿瘤明显小于盐水对照组及无义对照组(见图5)；此外，盐水对照组及无义对照组肿瘤表面均无黑色结痂，而反义药物组有3只出现黑色结痂，其病理检查是无菌性坏死灶，肿瘤细胞稀少，是疗效好的征象。上述说明该抗癌新药对恶性肿瘤有明显的治疗结果。

2.治疗结束后，完整剥离瘤块，称重量，计算抑瘤率，公式如下：

治疗结果：反义药物组离体瘤块明显小于盐水对照组及无义对照组(见图6)。瘤块重量反义药物组明显小于盐水对照组及无义对照组，而抑瘤率反义药物组则明显大于盐水对照组及无义对照组(见表5)，说明该抗癌新药对恶性肿瘤有明显的治疗结果。

        表5 离体瘤块的重量及抑瘤率

组别         瘤重(g，mean±s)    抑瘤率(％)

盐水对照组    4.957±0.828        ----

无义对照组    3.496±1.953        29.5

反义药物组    0.576±0.495*       88.4

              ^*P＜0.01

3.肿瘤组织病理检查结果：盐水对照组见肿瘤细胞分布密集，呈弥漫性生长。无义对照组和盐水对照组相似，并可见肿瘤组织向邻近肌肉组织内浸润生长。反义药物组肿瘤组织变性坏死，呈片状的嗜伊红结构，瘤细胞稀少，体积变小，细胞核固缩(见图7)，说明该抗癌新药有明显抑制肿瘤细胞生长的作用。

4.肿瘤细胞原位凋亡TUNEL检测结果：反义药物组肿瘤组织内检出较多细胞核呈棕黑色的凋亡细胞，而盐水对照组及无义对照组肿瘤组织内仅偶见少数凋亡细胞(见图8)，说明该抗癌新药有明显促进肿瘤细胞凋亡的作用。

5.肿瘤细胞Bcl-2蛋白流式细胞仪检测结果：盐水对照组肿瘤细胞Bcl-2蛋白表达阳性率高达84.56％，无义对照组肿瘤细胞Bcl-2蛋白表达阳性率高达81.81％，而反义药物组肿瘤细胞Bcl-2蛋白表达阳性率仅为56.95％(见图9)，说明该抗癌新药具有明显抑制肿瘤细胞Bcl-2 mRNA表达的作用。