毛蕊花甙的新用途

摘要

本发明公开多酚类化合物毛蕊花甙在癌症治疗的药物中的应用。本发明中，毛蕊花甙是在口服的，或者在静脉注射的，或者在肌肉注射的，或者在腹腔注射的癌症治疗药物中应用。

说明书

技术领域

本发明涉及多酚类化合物毛蕊花甙的一种用途。

背景技术

毛蕊花甙是一种从玄参科植物(Scrophulariaceae)中提取的多酚类化合物。其分子式为C₂₉O₁₅H₃₆，分子量为624，结构的物理常数为：

比旋光：[α]_D²⁰，-68(C＝0.4，MeOH)

紫外：UVλ_max^MeOH(nm)：208(lgε4.30)，217(lgε4.45)

292(lgε4.10)，329(lgε4.25)

红外：IR v_max^KBr(cm^-1)：3400(OH)，2932(C-H)，1700(共轭酯基)，1631(C＝C)，1604，1521(芳环)。

氢谱：¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆，TMS)δppm：0.97(d，J＝6.0Hz，3H，鼠李糖的甲基)，2.70(t，J＝7.0Hz，2H，Ar-CH₂-CH₂)，4.36(d，J＝7.2Hz，1H，葡萄糖的H-1)，4.72(t，J＝9.6Hz，1H，葡萄糖的H-4)，5.03(d，J＝1.1Hz，1H，鼠李糖的H-1)，6.21(d，J＝15.8Hz，1H，Ar-CH＝CH)，6.49-7.01(6H，芳环H)，7.47(d，J＝15.8Hz，1H，Ar-CH＝CH)，8.69，8.75，9.19，9.62(4×OH)。

碳谱：¹³CNMR(100MHz，DMSO-d₆，TMS)δppm：129.1(C-1)，116.3(C-2)，145.0(C-3)，143.5(C-4)，115.8(C-5)，119.5(C-6)，70.2(C-α)，35.0(C-β)，125.5(C-1’)，114.7(C-2’)，145.5(C-3’)，148.4(C-4’)，113.6(C-5’)，121.4(C-6’)，115.5(C-α’)，145.5(C-β’)，165.7(C＝O)。葡萄糖：102.3(C-1)，74.5(C-2)，79.1(C-3)，69.1(C-4)，74.5(C-5)，60.7(C-6)。鼠李糖：101.2(C-1)，70.5(C-2)，70.4(C-3)，71.7(C-4)，68.7(C-5)，18.1(C-6)。

质谱：FABMS(m/s)：631[M+Li]⁺，64.7[M+Na]⁺。

其分子结构如下：

中国发明专利申请99123015.9公开了毛蕊花甙的提取方法。在中国发明专利申请99123009.4中曾公开了毛蕊花甙在治疗肌肉疲劳的药物中的应用。但毛蕊花甙在药物中的其它应用尚未有披露。

发明内容

本发明是关于毛蕊花甙的新用途。具体讲是毛蕊花甙用于癌症治疗的药物。

在本发明中，毛蕊花甙是在口服的，或者在静脉注射的，或者在肌肉注射的，或者在腹腔注射的癌症治疗药物中的应用。

现所用的各类治疗癌症的药物一般会对正常的组织都有破坏作用，甚至有部分治疗癌症的药物有较大的毒性，正是由于这些原因，使其在临床应用中受到很大的限制，同时也使其治疗效果受到影响。但经发明人研究表明，采用毛蕊花甙于治疗癌症治疗基本上不会对正常组织产生破坏或负面的影响，也基本上没有毒副作用。本发明还惊奇地发现毛蕊花甙还具有使已癌变的组织诱导逆转为正常组织的现象，而这一现象在已披露的研究中还未见过报道。本发明将结合具体实施例详细说明。

具体实施例

实施例1

将裸鼠饲养于SPF(特殊隔离病源)级别的实验室内，实验室采用空气过滤隔离罩隔离。裸鼠的饲养管理和使用按照国家卫生部颁布的“实验动物管理和使用指南”操作。

先将人肝癌细胞(MHCC97-H)接种到一只健康裸鼠皮下，待长成瘤块后，把瘤块剥离下来，切成多个3mm³的小块。取健康的裸鼠12只，在每只裸鼠的左侧背部接种一个小块。然后对受试鼠正常饲养10天。10天后受试鼠身上的瘤块长大，再将受试裸鼠随机分为给药组和对照组，每组6只鼠。将毛蕊花甙用生理盐水溶解，给药组鼠按200mg/kg剂量，用腹腔注射方式给药，每天一次，连续给药17天；对照组腹腔注射与给药组等量的生理盐水。待第18天，处死受试鼠，剥离瘤块，并测其体积和重量，同时测血清的甲胎蛋白含量，所测数据见表1

表1                 药物对裸鼠体内移植人肝癌瘤块的抑制    剂量    (mg/kg)  瘤块体积  (cm3)  瘤块重量  (mg)    甲胎蛋白    (μg/L)对照组(n＝6)    0×17d  0.62±0.20  613±115    16.0±8.6给药组(n＝6)    200×17d  0.16±0.15^**  198±184^**    4.9±4.8^**

^*p＜0.05，^**p＜0.01，n为实验鼠的只数

结果表明本发明的药物可以明显抑制瘤块的生长，对瘤块体积和重量，分抑制了74.2％和67.7％。并且本发明还可使作为肝癌恶性标志的血清甲胎蛋白有明显的减少，使甲胎蛋白降低了69.4％。这表明本发明可使肝癌的恶性大大降低。

实施例2

先将人胃腺癌细胞(MGc80-3)温育(即在温度为37℃，5％二氧化碳的细胞培养箱中进行培养)于浓度为20μmol/L毛蕊花甙的RPMI-1640培养液中，同时将等量的人胃腺癌细胞温育于不含药物，却含有DMSO的RPMI-1640培养液中作为对照组。温育7天后收集细胞，常规清洗3次后，制成5×10⁷/mL的细胞溶液。取健康裸鼠8只，在每只鼠臀部一侧用注射器注入经药处理过的5×10⁶个细胞，再在每只鼠臀部另一侧用注射器注入等量的对照组的细胞作为对照。正常饲养四周后8只裸鼠的对照侧部位均长出较重的瘤块，其平均重量约1g，而经药物处理侧只有一只鼠长出约0.5g重的瘤块。这一实验表明本发明能使人胃癌细胞丢失恶性，向正常细胞逆转。

实施例3

用人胃腺癌细胞(MGc80-3)和人胃癌细胞(MKN45)作为本实施例的实验材料。

将5×10⁴/mL的人胃腺癌细胞放入RPMI-1640培养液中，在37℃，5％的二氧化碳条件下培养24小时。弃去培养液后，将这些胃腺癌细胞分成两份，一份放入含20μmol/L的毛蕊花甙的RPMI-1640培养液进行培养，另外一份放入不含毛蕊花甙，但含200mmol/LDMSO的RPMI-1640培养液中作为对照进行培养。温育7天后收获细胞，用D-Hank’s溶液洗三次，配成1×10⁶个细胞/mL的细胞液。测细胞表面电荷和细胞数倍增时间。另取部分细胞置盖玻片上培养，用含2.5％戊酰醛，pH值为7.4的0.1mol/L的磷酸缓冲液在4℃固定样品，然后用乙醇脱水，置于临界干燥器内干燥处理，再给细胞镀金。用日立产S-520扫描电镜观察细胞表面形态变化。

将人胃癌细胞(MKN45)分为等量的若干组，分别置于含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养液中，给药组分别加入不同浓度的的毛蕊花甙水溶液，对照组不加入任何药物，仅加入等量的蒸馏水。将各组在前述溶液中，37℃，5％的二氧化碳条件下温育48小时。收获细胞，用SDS溶解剂使细胞溶解，置于冰上30分钟后，在4℃ 1600rpm转速下离心20分钟，再用PCR ELISA端粒酶试剂盒测端粒酶活性。用端粒酶半抑制浓度的毛蕊花甙(17.7μg/ml)温育人胃癌细胞8周后进行离心处理，再分离细胞基因组DNA，按常规程序测端粒长度；并用流式细胞仪测癌细胞凋亡。

经上述实验后的分析表明本发明有如下效果：

1、可使人胃腺癌细胞生长减慢。对照组的细胞倍增时间为48.2小时，而经药物处理组的细胞倍增时间延长到68.5小时。

2、可使癌细胞表面电荷减少。经药物处理组细胞的表面电荷比对照组细胞的表面电荷减少28.4％以上。

3、对细胞表面形态的观察表明，本发明可使癌细胞表面微纤毛脱落，变得接近正常细胞那样光滑。

4、可使人胃癌细胞的端粒酶活性降低50％以上。

5、可使端粒长度明显缩短。对照组的癌细胞端粒长度为7.31kb，而经本发明的药物处理过的癌细胞的端粒长度则缩短到6.20kb。

6、适度的药物浓度可使癌细胞凋亡。在上述的实验中发现，当药物浓度为17.8μg/ml时癌细胞凋亡18.3％，而对照组不发生癌细胞的凋亡现象。

以上的结果表明毛蕊花甙可使癌细胞趋向于逆转，成为正常细胞，同时还可使癌细胞凋亡。上述效果的1和4还表明本发明可以使癌细胞永久分裂能力明显降低，这也表明经毛蕊花甙处理后癌细胞的恶性变弱了。

实施例4

取健康的昆明小白鼠40只，雌雄各半，分为对照组(10只鼠)、实验一组(15只鼠)和实验二组(15只鼠)等三组，每3-5只鼠一笼，雌雄分养。在禁食24小时后按预设药物剂量进行注射，各组实验如下：

对照组：生理盐水注射，0.4ml/只，每天腹腔注射一次，共14天。

实验一组：0.8g(毛蕊花甙)/kg(鼠体重)，0.4ml/只，每天腹腔注射一次，共14天，累计毛蕊花甙总剂量为11.2g/kg。

实验二组：2.0g(毛蕊花甙)/kg(鼠体重)，0.4ml/只，每天腹腔注射一次，共14天，累计毛蕊花甙总剂量为28.0g/kg。

实验中在每次腹腔注射后30～40分钟内观察受试鼠有无肉眼可见之异常反应，在实验的14天内观测鼠的饮食、粪便、行为、皮毛等情况。于第15天将鼠处死，进行尸检，肉眼检测鼠的心、肝、脾、肾、肺等器官，并做病理切片进行镜检和染色体检查。实验结果如下：

(1)每次注射后的30～40分钟中：

对照组：雌鼠嗜舔皮肤针口，稍后开始正常进食和饮水，鼠行动自如；

实验组(包括实验一组和实验二组)：注射后鼠缩在一角不动，约5分钟后开始行动，似略有不适；食欲不如对照组强，约10分钟后各鼠行动基本正常，皮毛干燥，同时雌鼠嗜舔皮肤针口。

(2)连续注射14天期间：

两个实验组鼠体重与对照组相当，参见表2。鼠的皮毛干燥、光滑，无出汗和倒毛现象，饮食、粪便和行动均正常，详细情况见表3。在实验期间无一鼠死亡。

(3)尸检结果：

肉眼观察：各受试鼠的心、肝、脾、肾、肺等器官均无可见异常，各器官色泽正常，无斑点等病态反应见表3

(4)病理组织切片镜检：

心脏：心肌组织正常，心肌细胞核染色清晰，心肌纤维形态正常，无肥大

等异常现象。

肝：肝组织结构正常，肝细胞核染色清晰，形态与正常对照组相同，肝细

胞结构完整，无肿胀现象。

胃：胃粘膜上皮组织正常，胃腺正常。

肾：肾组织结构正常，肾小体及肾小管各段与正常对照组无区别。

结论：依据我国卫生部药政局颁布的《新药(西药)临床前研究指导原则汇编》中关于大鼠长期毒性指导原则中有关限度实验的要求：“如小鼠急性毒性的口服给予药剂量大于5g/kg体重，注射剂量大于20g/kg重仍未产生毒性反应和死亡或仅个别有毒性反应时，可考虑只做一个高于拟用于临床剂量50倍的剂量组”可以看出毛蕊花甙基本是属于无毒的。完全可以作为口服用药，或者局部肌肉注射用药，或者是静脉注射用药，或者是腹腔注射用药。

表2                        对照组和实验组注射7天内小鼠体重(g)变化                   对照组                    实验组    雌    雌    雄    雄    雌    雌    雄    雄第1天    16.0    15.5    16.0    16.5    15.8    16.3    16.0    16.5第2天    20.3    21.0    21.7    20.0    21.1    20.0    21.5    21.7第5天    24.5    25.3    26.5    23.5    24.5    24.5    24.5    25.3第7天    27.0    25.5    28.0    24.5    26.0    24.5    26.0    27.0  表3                 腹腔连续注射毛蕊花甙14天受试鼠行为及尸检结果          对照组         实验一组          实验二组  外形各鼠皮毛干燥光滑；行为、精神、饮食和排泄均正常一切与对照组相同，仅在注射第6天，鼠的睾丸颜色稍暗一切与对照组相同，仅在注射第6天，鼠的睾丸稍暗，鼠后肢活动略显迟缓  尸检各受试鼠的心、肝、脾、肾、肺等器官均正常一切与对照组相同鼠的心、肝、脾、肾、肺等器官颜色稍暗，但无斑点和出血状况