增强低免疫原性抗原的免疫原性的药物组合物

摘要

本发明涉及免疫学领域，更特别涉及含有肽、多肽、蛋白质、其相应的DNA序列、细胞或其溶胞产物以及极小蛋白脂质体(VSSP)的免疫原性组合物，后者是通过将脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白复合体(CPME)与神经节苷脂通过疏水键的方式相结合而形成的。具体地说，本发明显示了如何制备所述免疫刺激组合物，其能产生抗原特异性免疫应答，甚至在无免疫应答的宿主中，如癌症或慢性病毒或细菌感染患者。通过对这些患者施用本发明所公开的疫苗组合物，可恢复其免疫系统部分的功能。本发明中公开的疫苗组合物可用于抵抗或治疗感染性、恶性和自身免疫性疾病。

说明书

技术领域

本发明涉及人类医学，特别涉及赋予针对感染性疾病和自身免疫病以及癌症的保护的保护性和/或治疗性疫苗；本发明特别提供诱导或增强对低免疫原性抗原的免疫应答的疫苗组合物。

现有技术

迄今为止在使用疫苗预防和治疗一组感染性疾病、癌症和自身免疫病中取得的效果不佳是由于多种因素的组合。其中主要是：相关抗原的低免疫原性，不知道如何操纵免疫系统调节，和病原体及肿瘤的逃避策略，以及宿主免疫抑制等等。

在现有技术中，已知低免疫原性抗原是那些存在于肿瘤和正常组织中或与病原体有关的肽、多肽和蛋白(或其相应的DNA序列)，其通过逃避免疫系统的作用而产生慢性感染。

在低免疫原性抗原之中，具有在酪氨酸残基的激酶活性的生长因子受体已显示出与肿瘤的发生发展及肿瘤转移密切相关，在某些情况下，它们已显示出作为癌症预后不良的指示而具有价值，对于诸如表皮生长因子受体(EGF-R)，也称为HER-1；表皮生长因子受体2(HER-2)；和血小板衍生生长因子受体(PDGF-R)这些受体，就是这种情况。

这些受体在某些类别肿瘤(主要是上皮起源的)中的过量表达已成为癌症免疫治疗中的目标靶，这种情况是乳腺、膀胱、卵巢、外阴、结肠、肺、脑、前列腺和头颈部的肿瘤。已证实EGF-R的存在指示乳腺癌预后不良(Perez R等人，1984，Breast Cancer and Treatment 4：189-193)。尽管EGF/EGF-R系统在肿瘤生长调节中的作用仍未知，已提示EGF-R在肿瘤细胞中的表达提供了一种自分泌刺激的机制，其导致所述细胞增殖障碍(Schlessinger J等人，(1983)Crit Rev Biochem14(2)：93-111)。

由于在肿瘤中高度表达，表皮生长因子受体已成为用天然形式的单克隆抗体与药物、毒素和放射性同位素相结合进行被动免疫治疗(PI)的目标靶(Vollmar AM等人，(1987)J Cell Physiol 131：418-425)。几项对单克隆抗体(MAb)的临床研究正在进行之中，其中某些已显示出预期的结果，那是在对Mab C225在乳腺癌、胰腺细胞和肾细胞(II期)以及头颈部(III期)中的临床研究(MendelsohnJ等人，(1999)American Society of Clinical Oncology Meeting)。另一项显示出好结果的II期临床试验是针对Mab IOR egf/r3在头颈部肿瘤中进行的(Crombet T等人，(2000)Cancer Biotherapy andBiopharmaceutical，原稿已接受)。

另一方面，使用EGF-R作为目标靶的特异性主动免疫治疗(SAI)从未被开发过，原因是其作为自身分子免疫原性低，及其在组织中广泛表达，这些问题阻止了免疫学家考虑这一选择(Disis ML和CheeverMA，(1996)Current Opinion in Immunology 8：637-642)。SAI优于PI，因为PI不激活免疫应答的特异性细胞效应途径，并且其效果取决于所使用的抗体的半衰期，为了获得所希望的作用通常必需实施连续再输注。

为了发展出有效的疫苗，载体和佐剂必需通过适当调节免疫系统而发挥作用以克服相关抗原的低免疫原性，并且共同抵抗病原体和肿瘤的逃避策略。为此，搜寻新的载体和佐剂系统在当前构成了重要的研究领域。

在过去几年中，有关免疫系统调节的新理论和出现的知识已开辟了崭新的试验领域来开发更为有效的载体和佐剂。Fearon等人(Science，Vol.272，pp50-53，1996)已教导了保护性免疫是两个关键系统之间相互作用的结果：先天免疫，和获得性免疫。负责获得性免疫的细胞不能区分需要免疫应答的结构和不需要免疫应答的结构，因此它们需要由先天免疫系统细胞来指导。先天免疫和获得性免疫之间的必要连接是由抗原呈递细胞(APC)来提供的，其中树突细胞(DC)是免疫应答的最有效诱导物，包括初级DC和次级DC。尤其，因为DC是唯一能活化处女型T淋巴细胞的APC，因此DC是至关重要的。

与先天免疫相关的分子近来已得到鉴定，可考虑将它们作为新一代的载体和佐剂，因为它们能使DC成熟并介导与其相连的抗原的交叉呈递。

在现有技术中在这一方面有一系列的工作。Giroir，(Crit CareMed，Vol.5，PP 780-789，1993)，Cella等人(Nature，Vol.388，pp782-787，1997)和Hailman等人(J Exp Med，Vol.79，PP 269-277，1994)教导了脂多糖(LPS)与先天免疫识别系统之间的相互作用是所有中最为有效力的，并刺激单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞中细胞因子和促炎介质的产生，从而额外增加粘附分子的表达。这些炎性细胞因子在对感染和肿瘤的反应中非常重要，但其过量分泌导致败血症性休克，这对于患者可能是致命的，并阻止了使用LPS作为疫苗佐剂。所述反应是由LPS与称为脂多糖结合蛋白(LBP)的结合蛋白之间形成的复合物介导的，其依次与CD14分子发生相互作用。该分子促进LPS与称为Toll受体(TLR)的信号分子的相互作用。很多证据指向Toll受体4(TLR4)作为参与LPS信号转导的Toll家族的分子。

Ulrich等人(在Vaccine Design：The subunit and adjuvantapproach p 495，MF Powel和MJ Newman编著，Plenum Press，NewYork，1995)，Tholen等人(Vaccine，Vol.16，p 708，1998)，De Becker等人(Int Immunol，Vol.12，PP 807-815，2000)指出存在无毒的LPS衍生物，即单磷酰脂A(MPLA)，其在免疫应答的细胞途径和体液途径中具有佐剂活性，并已在几项临床试验中被施用于人类。尽管指出MPLA保持了LPS的免疫刺激特性，以上作者已证实MPLA在体内诱导DC的迁移和功能成熟，但水平比起对LPS所观察到的要低。

Tamura等人(Science，Vol.278，pp 117-120，1997)和Binder等人(Nature Immunol，Vol.1，PP 151-155，2000)报道了热休克蛋白(HSP)是有效力的载体，通过对其陪伴抗原的抗原交叉呈递现象而刺激细胞免疫。从肿瘤获得的HSP在不同模型中显示出令人感兴趣的抗肿瘤作用。鉴定CD91为HSP gp96的受体可能反映出DC对HSP的特异性捕获途径的存在，其发展为有效募集与抗原、感染原或破坏细胞相关的肽，并将它们呈现于I型主要组织相容性复合体(MHCI)。但是，使用HSP作为疫苗载体具有要从原始来源获得的不便，例如，来自肿瘤。这使得操作复杂而且昂贵，并且从不确切了解何种抗原产生该作用。

Hartmann等人(Proc Natl Acad Sci USA，Vol.96，PP 9305-9310，1999)，Hemmi等人(Nature，Vol.6813，PP 740-5，2000)，Sparwasser等人(Eur.J.Immunol，Vol.12，PP 3591-3597，2000)，Hochreiter等人(Int.Arch.Allergy Immunol，Vol.124，PP 406-410，2001)和Deng等人(Arthritis Res，Vol.3，PP 48-53，2001)显示在与先天免疫相关的分子中，鉴定为DC成熟诱导物，发现了细菌DNA的CpG序列。最近证实对CpG序列的细胞应答是由TLR9介导的，从而表明该受体能区分细菌DNA及其自身DNA。诱导针对不同可溶性抗原的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)已在经基因修饰(对CD40，CD4或MHC II标记阴性)的小鼠中得到再现。由此产生结论，由CpG介导的CTL-活化在缺乏来自CD4 T细胞的辅助下发生，从而赋予这些类别的分子以佐剂特性。然而，CpG序列在体内将应答模式从Th2偏向Th1的能力完全取决于抗原性质和免疫条件，这一点当它们是蛋白时格外有效。这将会对有效应用CpG寡核苷酸作为佐剂构成障碍，主要是在无免疫应答宿主中。细菌CpG序列可能会诱导关节炎也曾被描述过。

Jeannin等人(Nature Immunol.，Vol.6，PP 502-509.2000)和Miconnet等人(J.Immunol.，Vol.166，PP 4612-4619.2001)特别在一种革兰氏阴性细菌肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoneae)的OmpA蛋白中发现了重要的免疫刺激特性。用通过重组技术表达的该蛋白进行的实验显示，该蛋白结合并诱导完全DC成熟，使用TLR2分子作为信号分子。该蛋白显示的另一重要特性是其引导抗原通过I类呈递途径的能力，条件是该抗原是疏水或共价偶联的。事实上，这是其作为疫苗载体的主要局限，因为共价结合技术具有对蛋白本身和对抗原产生化学修饰的不便，而疏水结合只能用于疏水性抗原亚群。

Lowell在美国专利5,726,292中描述了一种增加肽、多肽和蛋白的免疫原性的免疫增强系统，这可被认为是与本发明最接近的原型。在上述专利中，组合物特征在于通过添加至少一个半胱氨酸残基的方式对抗原进行化学修饰，而后与脂族脂肪酸或者疏水性肽结合。之后，修饰的抗原通过透析或冻干过程与蛋白体进行复合。尤其，这些组合物不包括糖苷。

发明内容

本发明的新颖性在于提供了赋予肽、多肽、蛋白及其相应的DNA序列和疫苗兴趣的靶细胞以免疫原性的制剂，而不需要对所述抗原进行结构改变，这是通过将抗原与脑膜炎奈瑟氏球菌的极小蛋白脂质体(VSSP)结合，所述蛋白脂质体中携带了先天免疫有效配体和神经节苷脂。

本发明显示，免疫增强载体正是由革兰氏阴性细菌脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白复合体(OMPC)与神经节苷脂结合获得的极小蛋白脂质体(VSSP)组成。

本发明涉及的制剂在选择低免疫原性抗原和将它们施用于无免疫应答宿主时特别有效。

本发明的一个目的是提供包含肽、多肽、蛋白、其相应的DNA序列、靶细胞或其溶胞产物作为抗原，以及极小蛋白脂质体(VSSP)的免疫原性组合物，所述极小蛋白脂质体是将脑膜炎奈瑟氏球菌(革兰氏阴性细菌)的外膜蛋白复合体(OMPC)与神经节苷脂通过疏水连接而形成的。此外，本发明指出，这些组合物可单独配制或作为与不完全弗氏佐剂(IFA)一起的乳剂，并也可以被冻干。

本发明的另一目的是提供能够产生抗原特异性免疫应答的免疫刺激组合物，甚至在无免疫应答宿主中，例如癌症或慢性病毒感染患者。对于所述患者，施用本发明描述的疫苗组合物可重建免疫系统功能。

此外，本发明描述的疫苗组合物构成了对生长因子受体的免疫原性问题及其在肿瘤治疗中的影响的解决方案，因为所述受体显示酪氨酸激酶活性，而在膜分子簇中特异性与其结合的神经节苷脂在VSSP造成的红旗信号环境下同时被呈递给宿主免疫系统，并对于有效地激活树突细胞(DC)以及产生交叉呈递是需要的。这些疫苗组合物避免运用产生新的假优势免疫表位的蛋白偶联化学技术，此外它们将其组分呈递给免疫系统，模拟其在肿瘤细胞中天然存在的分子关联。

另一方面，此技术方案允许运用受体整体结构，因此解决了免疫优势遗传限制的问题，这与其它运用衍生肽并在此方面可能呈现更多限制的方案相反。

更具体地说，本发明提供了治疗癌症的疫苗组合物。所述的疫苗组合物包含作为活性成份的一种或多种生长因子受体、或其包含或不包含跨膜结构域的胞外域，和作为疫苗载体的极小蛋白脂质体(VSSP)，其来自脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白复合体，和特别与之关联的神经节苷脂，从而形成膜分子簇。所述疫苗组合物还可包含合适的佐剂。

本发明的疫苗组合物可用于主动免疫治疗中，特别是在肿瘤例如前列腺、结肠、肺、乳腺、卵巢、头颈部、外阴和膀胱癌、神经胶质瘤以及在非传染性慢性疾病的治疗中。

发明内容

本发明涉及能增强低免疫原性抗原之免疫原性的药物组合物，包括：

(A)一种或多种低免疫原性抗原；

(B)一种疫苗载体，为来源于革兰氏阴性细菌菌株的外膜蛋白复合体的蛋白脂质体，并在其中携带神经节苷脂；以及

(C)一种或多种佐剂。

本发明的组合物增强低免疫原性抗原之免疫原性，所述抗原可以是肽、多肽、蛋白质及其相应的核酸序列，以及疫苗兴趣的靶细胞或其溶胞产物及其组合。

在所述低免疫原性抗原之中，可以使用生长因子受体或其胞外域。所述生长因子受体的胞外域可以含有或可以不含有其跨膜区。

可以用于增加免疫原性的生长因子受体为HER-1、HER-2、PDGF-R或其含有胞外域的任何变异体，缺乏或存在其跨膜区。

用作本发明中疫苗载体的蛋白脂质体是从革兰氏阴性细菌菌株的外膜蛋白复合体(OMPC)获得的，优选脑膜炎奈瑟氏球菌，其可以是野生型或基因修饰的菌株。

在本发明的组合物中，在其中携带神经节苷脂的蛋白脂质体是通过将所述神经节苷脂疏水性掺入脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白复合体(OMPC)中而获得的。GM1和GM3神经节苷脂或其N-糖基化(N-glycolylated)的变异体可用于此目的。

本发明的组合物另外含有佐剂，其可以是油性佐剂或者天然或重组多肽。

优选的油性佐剂是不完全弗氏佐剂或Montanide ISA 51。同样，当使用多肽佐剂时，其可以为细胞因子，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，或凝乳酶。

本发明的组合物可用于预防和治疗癌症，特别是前列腺、结肠、肺、乳腺、卵巢、头颈部、外阴和膀胱癌及神经胶质瘤，以及非传染性慢性疾病。

同样地，它们可用于预防和治疗病毒和细菌感染性疾病，除此之外还可用于治疗获得性免疫缺陷综合征，以及治疗自身免疫病。

本发明提供了赋予低免疫原性肽、重组或天然蛋白、溶胞产物、完整细胞和核酸以免疫原性的制剂。免疫刺激制剂可定义为能刺激针对特定抗原的体液和细胞应答的制剂。此外，这些制剂具有在无免疫应答的个体中重建免疫的特征，如患有癌症和慢性病毒感染或特定类型自身免疫病的个体。

本发明描述了免疫增强载体是由极小蛋白脂质体(VSSP)组成的，它是由革兰氏阴性细菌菌株脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白复合体(OMPC)与其中掺入的神经节苷脂相结合而获得的。将OMPC组分进行持续2到15天的透析，由此掺入糖基化和/或乙酰基化的神经节苷脂。将神经节苷脂掺入外膜复合体的结果是获得一种非囊性制剂；所得的非囊性制剂分子尺寸非常小，在电镜下看不到，可溶并显示出高浮动性。

本发明的VSSP显示出惊人的免疫学特性，如引起树突细胞成熟和对免疫抑制患者进行免疫重建的惊人能力。根据古巴专利131/93和130/97、美国专利5,788,985和6,149,921以及Estevez等人发表的文章(Vaccine，Vol.18，PP 190-197，1999)获得VSSP。

用于本发明中的抗原肽可以是合成的或从几种来源中提取。优选肽的大小可以在7-25个氨基酸之间，取决于有待刺激的T细胞类型。然而，长度可以在3-50个氨基酸之间变化。肽可以是中性的或者可以带正电或负电。肽的疏水性也可以有所不同。

同样，本发明揭示了在此所使用的重组蛋白可以在不同的表达体系中表达，如细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞。本发明一个优选的实施方案要求保护将脑膜炎奈瑟氏球菌用作表达体系，其中感兴趣的蛋白在细菌自身外膜进行表达。这可使感兴趣的蛋白直接构成OMPC的组成部分。在此情况下，整个蛋白的表达同样有效，或者将其多肽或肽的一部分插入脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白的一个或多个连接处，如TBP、Opa、Opc以及P1、P2和P3孔蛋白。

本发明的具体实施方案显示，来自这些疫苗组合物的抗原可以是具有酪氨酸激酶活性的生长因子受体，其在肿瘤组织中过量表达；或者它们的胞外域，含或不含跨膜区；并且它们与在肿瘤细胞膜中表达的神经节苷脂有特定关系。这特别是HER-1、HER-2和PDGF受体的情况。

本发明涉及的生长因子受体是通过重组技术以及聚合酶链式反应(PCR)在哺乳动物细胞表达质粒中获得的，遵循在分子生物学出版物中描述的典型操作程序(Sambrook J，Fritsch E.F，Maniatis T，M0lecular Cl0ning A Laboratory Manual，second edition，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)。将含有这些基因和编码受体或其变异体的质粒稳定转染入哺乳动物细胞中，如HEK 293(ATCC CRL1573)，NIH-3T3(ATCC CRL 1658)和CHO。受体或其变异体在转染细胞系的膜上表达，或分泌入上清，无论何种情况均可以。

将这些抗原从表达它们的哺乳动物细胞膜中或从细胞培养上清中提取出来，并通过层析纯化。然后，将它们在无菌条件下过滤，并冻干。将它们置于4℃保存。这些抗原在疫苗制剂中的最佳量为每剂1-1000μg。

对于此特定类型的抗原，在疫苗制剂中使用的VSSP包含神经节苷脂，其选自特别与生长因子受体相结合形成膜分子簇的那些，如GM3和GM1。VSSP在该疫苗组合物中的量为1-1000μg，基于每剂疫苗中神经节苷脂的量。

含有有待增加免疫原性的生长因子受体作为抗原的本发明优选的疫苗组合物可以通过不同的途径制备：(a)将给定量的VSSP溶液加入冻干的生长因子受体或其胞外域(含有或不含跨膜区)(1-100mg蛋白)，使受体/神经节苷脂质量比在0.1/1至1/1范围内。将混合物于4-20℃搅拌5分钟-24小时。将该制剂保存于4℃，直至施用于宿主。

就在施用于宿主之前即刻，在室温下，将上述制剂以40/60至60/40之间的体积/体积比加入IFA，并搅拌10-30分钟。该体积比覆盖了根据有待采用的接种途径所需类型乳剂的足够适当范围。

(b)另一种同样便利的操作途径为，将冻干的生长因子受体或其胞外域(含有或不含跨膜区)和VSSP溶液分别置于单独的容器中于4℃保存。就在施用于宿主之前即刻将给定量的VSSP溶液加入生长因子受体中；然后以与a)中所述相同的方式制备疫苗组合物。

C)第三种操作途径为，在疫苗组合物中将一种以上生长因子受体或其胞外域(含有或不含跨膜区)与相应的VSSP溶液合并。每种抗原在疫苗组合物中的量以及它们之间的比例，将在每剂疫苗1-1000μg的范围之内。同样地，在疫苗组合物中VSSP中每种神经节苷脂的量将在每剂疫苗1-1000μg的范围之内。

为了制备联合疫苗，将成为其组成部分的生长因子受体或其胞外域(含有或不含跨膜区)以由以上相应项所述的量冻干。随后，加入给定量的VSSP溶液，使受体/神经节苷脂质量比在0.1/1至1/1范围内。然后将混合物于4-20℃搅拌5分钟-24小时。将该制剂保存于4℃，直至施用于宿主。

就在施用于宿主之前即刻，在室温下，将上述制剂通过振荡与IFA以40/60至60/40之间的体积/体积比相混合10-30分钟。这些体积比覆盖了根据有待采用的接种途径所需类型乳剂的适宜范围。

D)另一种制备c)中所述的联合疫苗的途径是通过b)中所述的方法。

另一方面，作为取自建立的肿瘤细胞系或直接获自癌症患者的细胞的多抗原系统，也可用于本发明的制剂之中。通过γ辐射治疗或用丝裂霉素C处理的方式完成细胞灭活。另一种同等便利的备选方法是使用通过机械裂解或通过病毒感染肿瘤细胞而获得的肿瘤细胞溶解产物。

本发明的免疫增强制剂可有利地用于DNA疫苗和RNA疫苗中。当与本发明所述制剂相结合时，用作疫苗载体的逆转录病毒和腺病毒载体的免疫原性也得到增加。这些载体含有编码主题抗原蛋白的基因。通常，当将不同的抗原系统与先前获得的VSSP相结合时，获得不同的免疫原性制剂。通过重组技术直接引入脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜中的抗原和在透析过程中掺入蛋白脂质体的那些抗原，已在VSSP制备过程末掺入。尽管如此，所述经修饰的蛋白脂质体也可以用于其它未掺入的抗原。这可以产生多价疫苗。

所述蛋白抗原制剂是这样获得的：将10-1000μg抗原肽或蛋白与给定量的VSSP相混合，使蛋白/神经节苷脂的总质量比在1-3的范围之内。将制剂保存于4℃，直至施用于宿主。另一种同等便利的操作途径为，于4℃分别保存抗原溶液和VSSP溶液，并在施用之前即刻进行混合。

含核酸的制剂是这样获得的：将VSSP与DNA或RNA溶液直接混合。混合过程在4℃进行，每0.1mg在VSSP中的神经节苷脂使用2-100μg核酸。由于在VSSP制剂中缺乏核酸酶，该方法切实可行。

在本发明所显示特别有利的方法中，将包含感兴趣蛋白的DNA序列的活病毒载体(牛痘、禽痘或其它病毒)IV(静脉内)施用于宿主，施用量从10⁶-5×10⁷pfu。在施用病毒载体之前12小时和之后12小时内，经肌内、皮下、皮内、口服或鼻内途径施用VSSP。

含有感兴趣的靶细胞或其溶胞产物的制剂是这样获得的：首先通过离心沉淀各自的培养物，然后将细胞沉淀重悬于给定量的VSSP中，使每0.1mg神经节苷脂有10³-5×10⁶个细胞。将所述量通过于4-20℃振荡5-24小时而直接混合。将制剂保存于4℃，直至施用于宿主。

另一种同等便利的操作途径为，于4℃分别保存细胞悬液或其相应的溶胞产物和VSSP溶液，并在施用之前即刻将它们混合在一起。

在本发明中描述的制剂，其中抗原与VSSP相混合或掺入VSSP中，可以单独施用，或作为与不完全弗氏佐剂(IFA)形成的乳剂而施用。就在施用于宿主之前即刻制备乳剂。将每种制剂与佐剂于室温下以40/60至60/40的体积比振荡10-30分钟而混合。所述体积比范围覆盖了根据有待采用的接种途径所需类型乳剂的足够适当范围。

在本发明另一个优选的实施方案中，其中抗原与VSSP相混合或掺入VSSP的所述制剂在单独或作为与不完全弗氏佐剂(IFA)形成的乳剂而施用之前冻干。

本发明的疫苗组合物可通过胃肠外途径(肌内、皮内、皮下)或通过直接应用于粘膜而施用于患者。

实施例

实施例1.获得疫苗组合物的抗原：小鼠EGF-R的胞外域(ECD)(ECD-mEGF-R)

使用PCR技术，从来自小鼠肝脏的互补DNA(cDNA)扩增编码ECD-mEGF-R的基因。PCR是如下进行的：混合1μg的cDNA与10pmole的各特异性引物。之后，加入0.2mM的各种dNTP和1U的Taq聚合酶。总共进行30个PCR循环：9℃，1分钟(除了第一个循环，其持续3分钟)；56℃，1分钟；72℃，1分钟，和30秒(除了最后一个循环，其持续5分钟)。将扩增的基因克隆入哺乳动物细胞表达载体pcDNA3中(Ampr，f’ori，ColE ori，CMV启动子，SV40 ori，SV40pa，新霉素，Invitrogen)，之后用该质粒稳定转染HEK-293细胞系。通过常规方法进行转染，细胞生长于选择性培养基中。从稳定表达ECD-mEGF-R的HEK-293/ECD-mEGF-R细胞系的上清中获得ECD-mEGF-R。

通过将配体偶联至基质采用亲和层析技术纯化在培养物上清中获得的ECD-mEGF-R(Affinity Chromatography Principles andMethods 3：12，Pharmacia fine Chemicals)；然后将其过滤除菌并冻干。

实施例2.获得包含ECD-mEGF-R、VSSP-GM3和不完全弗氏佐剂(IFA)的疫苗组合物，在施用之前即刻合并所有组分。

如美国专利No 6,149,921中所述，获得来自脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白复合体(OMPC)含有掺入的GM3神经节苷脂的蛋白脂质体。

用于此目的的来自脑膜炎奈瑟氏球菌的OMPC复合体由“CarlosJ.Finlay”研究所提供(C.Campa等人，EP 301992)。通过于4℃轻轻混合过夜，将10mg该OMPC复合体分散于0.5％去氧胆酸钠和0.1％十二烷基硫酸钠溶液中，所述溶液还含有10mg的NGcGM3。通过使用3.5KDa膜透析14天而将可溶性OMPC-NGcGM3与去污剂分离开来。

将透析物于100,000g离心1小时，并将存在于上清中的免疫原性复合物过滤除菌。

神经节苷脂掺入蛋白中的程度使用针对蛋白质的Bio-Rad试剂和针对唾液酸的间苯二酚来测定。通过这种方法，每mg的OMPC掺入了1mg的NGcGM3。

先前制备的疫苗载体的量为每剂疫苗120μg，基于掺入蛋白脂质体中的神经节苷脂的量。

为了制备免疫原性物质，将1mg的ECD-mEGF-R冻干，并保存于4℃直至免疫接种。就在施用于小鼠之前即刻，向抗原中加入2.4mg的VSSP-GM3(基于神经节苷脂的量)成1ml体积，并将两种组分于室温混合15分钟。然后加入1ml的IFA，通过于室温振荡20分钟而混合。

实施例3.获得包含ECD-mEGF-R、VSSP-GM3和IFA的疫苗组合物，通过合并部分组分，并保存混合物直至施用。

如美国专利No 6,149,921中所述，获得来自脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白复合体(OMPC)含有掺入的GM3神经节苷脂的蛋白脂质体。所用的疫苗载体的量为每剂疫苗120μg，基于掺入的神经节苷脂的量。

为了制备免疫原性物质，将1mg的ECD-mEGF-R冻干，然后以1ml体积加入2.4mg VSSP-GM3(基于掺入的神经节苷脂的量)。将两种组分于室温混合15分钟，并将混合物置于4℃保存直至免疫接种。就在施用于小鼠之前即刻，加入1ml的IFA，通过于室温振荡20分钟而混合。

实施例4.获得包含ECD-HER-1、ECD-HER-2、VSSP-GM3和IFA的联合疫苗

如美国专利No 6,149,921中所述，获得来自脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白复合体(OMPC)含有掺入的GM3神经节苷脂的蛋白脂质体。所用的疫苗载体的量为每剂疫苗120μg，基于掺入蛋白脂质体中的神经节苷脂的量。

为了制备免疫原性物质，将1mg ECD-HER-1和1mgECD-HER-2一起冻干，并保存于4℃直至免疫接种。就在施用于小鼠之前即刻，以1ml体积加入2.4mg VSSP-GM3(基于神经节苷脂的量)。将所有组分于室温混合15分钟。然后加入1ml的IFA，通过于室温振荡20分钟而混合。

实施例5.用免疫组合物诱导针对自身EGF-R的特异性免疫应答。

用如实施例2中所述制备的包含ECD-mEGF-R/VSSP-GM3和IFA的疫苗组合物免疫C57BL/6品系小鼠。免疫原性物质剂量为每只小鼠50μg，基于组合物中抗原的量。免疫方案为：每15天肌内(i.m.)施用3剂，在初次免疫之后0、21、35和56天取血(II组)。作为参照组，用50μg与KLH化学结合的ECD-mEGF-R及完全弗氏佐剂(CFA)和IFA免疫来自相同品系的小鼠，遵循相同的免疫方案(I组)。通过ELISA技术分析获得的血清，检测ECD-mEGF-R。ELISA是这样进行的：用10μg/ml的ECD-mEGF-R包板，用PBS/5％小牛血清封闭板后，将来自对照和免疫动物的血清以不同的系列稀释度进行温育。接下来，加入结合碱性磷酸酶的小鼠抗-IgG抗体(特异性针对Fc)(Sigma)。所有上述温育为置于37℃1小时，并且每一所述步骤之后用PBS/0.05％Tween 20洗3次。加入在二乙醇胺缓冲液(pH9.8)中的1mg/ml底物(对硝基苯磷酸)，而使反应显色。30分钟后在ELISA读板机中测量在405nm的吸光度。

100％用本发明的疫苗组合物免疫的小鼠诱发产生了特异性针对ECD-mEGF-R的抗体应答；该应答在免疫过程期间更强，并达到抗体滴度高达1/160000，而免疫前血清不识别ECD-mEGF-R。抗体应答的同种型基本上为IgG型。

所诱发的抗体应答的亚群分布由ELISA确定。20.21％的抗体为IgG2a，36.03％为IgG1，而38.93％为IgG2b，与对照组相比，估计向Th1应答模式迁移(图1)。

尽管该疫苗组合物与其中ECD-mEGF-R化学结合KLH并且CFA用作佐剂的组合物相比较，对于所述制剂诱导的抗体滴度更高，而且亚群分布趋势为Th1模式，对所述疫苗效力有利。

用ECD-mEGF-R/VSSP-GM3/IFA免疫的小鼠未显示出临床毒性征象，并且对取自所述动物的血清进行的生化测试未显示出与未免疫动物有所不同(表1)。

表1

  组  反应动物    IgG滴度  第21天    1/100  1/500  1/1000  1/2500  1/5000  1/10000  1/20000  I  8/10    1  3  1  1  1  1  II  10/10  1  1  2  5  1  第35天    1/100  1/1000  1/2500  1/5000  1/10000  1/20000  1/40000  I  10/10  2  2  1  5  II  10/10  1  2  1  6  第56天    1/1000  1/5000  1/10000  1/20000  1/40000  1/80000  1/160000  I  10/10    1  1  1  2  1  4  II  10/10  1  1  2  4  2

I组--用ECD-mEGF-R/KLH/CFA和IFA免疫的动物

II组--用ECD-mEGF-R/VSSP-GM3/Montanide-ISA 51免疫的动物

实施例6.来自用ECD-HER-1/VSSP-GM3/IFA免疫的小鼠的血清对表达人EGF-R的细胞的识别

将表达人表皮生长因子受体的A431细胞系(10000细胞/孔)与以下物质于室温下温育30分钟：稀释至1/5的C57BL/6小鼠免疫前血清(A)；浓度为10μg/ml的针对EGF-R的单克隆抗体ior egf-r3作为阳性对照(B)；以及稀释至1/5的经免疫的C57BL/6小鼠血清(C)。

用磷酸缓冲液/0.5％小牛血清溶液冲洗除去未与受体结合或以非特异性方式与受体结合的过量抗体。对细胞的免疫检测是这样进行的：将细胞与稀释至1/50结合异硫氰酸荧光素的抗小鼠二抗于室温下温育30分钟。在流式细胞仪(FC)中测量荧光强度。来自用所述疫苗制剂免疫的小鼠的血清识别表达EGF-R的细胞，其强度可与实验阳性对照相比，而与来自相同动物的免疫前血清形成对比(图2)。

实施例7.来自ECD-HER-1/VSSP-GM3/IFA免疫小鼠的血清的细胞溶解活性

将A431细胞系(3×10⁶细胞)与放射性铬酸钠⁵¹Cr一起温育1小时，并用培养基洗3次，消除过量的放射性盐。将负载⁵¹Cr的细胞与以下物质一起温育：

i)50μg/ml单克隆抗体ior-t3(针对CD3的MAb，作为阴性对照)；

ii)50μg/ml单克隆抗体ior egf-r3(针对EGF-R的MAb，作为阳性对照)；

iii)稀释至1/20的C57BL/6小鼠免疫前血清；

iv)稀释至1/20的用ECD-HER-1/VSSP-GM3/IFA免疫的C57BL/6小鼠的血清。

37℃温育1小时后，加入40μl兔补体，于37℃温育。之后，将试管离心，并用100μl上清在γ计数器中测量⁵¹Cr释放，以衡量由抗体和补体介导的细胞溶解。通过用去污剂总体溶解的方式测量总掺入。

用所述疫苗组合物免疫的小鼠的血清引起表达EGF-R的A431细胞80％溶解，另一方面，来自所述小鼠的免疫前血清仅引起35％溶解(图3)。

实施例8.来自ECD-HER-1/VSSP-GM3/IFA免疫小鼠的血清的中和能力

对来自用本发明的疫苗组合物免疫的小鼠的血清进行测定，以确定其抑制EGF与其在A431细胞膜上的受体结合的能力。为了实现该效应，使A431细胞生长于培养板中至汇合。一旦达到汇合，加入不同稀释度(1/5，1/10，1/20，1/40)的免疫血清库，然后以100000cpm/孔的比例加入EGF-125I。用PBS/1％BSA将每孔的体积填充至500μl。将培养板于室温下温育1小时，之后加入2mL冷PBS/1％BSA终止反应。然后除去每孔中的液体，并轻轻地用PBS/1％BSA洗孔；向每孔中加入300μl NaOH 2M。置于室温下30分钟后，从每孔中取出200μl，记录在γ射线计数器中的读数。

所述免疫血清库显示出抑制EGF-¹²⁵I与其在A431细胞膜中的受体结合。抑制程度取决于血清稀释度(图4)。

实施例9.ECD-HER-1/VSSP-GM3/IFA免疫小鼠的寿命

将用ECD-mEGF-R/VSSP-GM3/IFA免疫(每15天3个50μg剂量，i.m.)的C57/BL6品系小鼠i.m.接种100000个Lewis细胞，观察小鼠以确定其寿命。Lewis细胞来源于表达EGF-R的鼠肺腺癌。将这些小鼠的寿命与用ECD-mEGF-R/CFA(每15天3个50μg剂量，皮下)免疫的组作比较。用ECD-mEGF-R/VSSP-GM3/IFA疫苗组合物免疫的小鼠显示出寿命显著高于对照组(p＜0.05)(图5)。

实施例10.获得含有P3嵌合单克隆抗体(P3 cMAb)、VSSP(GM3)和IFA的疫苗组合物

如古巴专利130/97和美国专利No.6,149,921中所述，获得含有GM3[VSSP(GM3)]神经节苷脂的来自脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白复合体的蛋白脂质体。将VSSP(GM3)以4.8mg/ml的浓度保存于4℃pH 8.9 Tris/HCl溶液中，直至使用。为了制备免疫原性物质，将含有2mg/ml P3嵌合单克隆抗体(P3 cMAb)(美国专利No.5,817,513)的溶液在磷酸盐缓冲液中与制备的VSSP(GM3)以1/1(v/v)的比例进行混合。混合过程包括在室温下磁力搅拌15分钟。之后，以1/1(v/v)的比例加入IFA。将混合物于室温下振荡15分钟，直至获得乳剂。

另一种同等便利的操作为，将含有2mg/ml P3 cMAb在磷酸盐缓冲液中的溶液与制备的VSSP(GM3)以1/1(v/v)的比例进行混合。混合过程为于室温下磁力搅拌15分钟，并将所得的溶液通过0.2μm醋酸纤维素膜过滤除菌。计量后，注入容器，并密封处理，制剂保存于4℃可长达1年。就在施用于宿主之前即刻，以1/1(v/v)的比例加入IFA制剂，于室温下振荡15分钟实现乳化。

实施例11.获得含有来自P3 cMAb重链可变区的肽(CDR3/VH-P3)和VSSP(GM3)的疫苗组合物

如古巴专利130/97和美国专利No.6,149,921中所述，获得含有GM3[VSSP(GM3)]神经节苷脂的来自脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白复合体的蛋白脂质体。将VSSP(GM3)以4.8mg/ml的浓度保存于4℃pH 8.9 Tris/HCl溶液中，直至使用。

就在施用于宿主之前即刻，制备免疫原性物质：首先将冻干的CDR3/VH-P3肽溶于磷酸盐缓冲液中至浓度为4mg/ml。然后将该溶液与VSSP(GM3)制剂以1/1(v/v)的比例相混合。混合过程为于室温下磁力搅拌15分钟。

另一种同等便利的操作为，首先将冻干的CDR3/VH-P3肽溶于磷酸盐缓冲液中至浓度为4mg/ml。然后将该溶液与VSSP(GM3)制剂以1/1(v/v)的比例相混合。混合过程为于室温下磁力搅拌15分钟，并将所得的溶液通过0.2μm醋酸纤维素膜过滤除菌。计量后，注入容器，并密封处理，制剂保存于4℃可长达1年。

实施例12.获得含有B16黑素瘤肿瘤细胞溶解产物、VSSP(GM3)和IFA的疫苗组合物

如古巴专利130/97和美国专利No.6,149,921中所述，获得含有GM3[VSSP(GM3)]神经节苷脂的来自脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白复合体的蛋白脂质体。将VSSP(GM3)以2.4mg/ml的浓度保存于4℃pH 8.9 Tris/HCl溶液中，直至使用。

为了制备免疫原性物质，将鼠黑素瘤B16细胞系的悬液(50×10⁶细胞/ml)进行5次冻/融循环，交替在液氮浴中和37℃蒸馏水浴中温育。将所得的溶胞产物于500×g离心10分钟。将所得的沉淀重悬于VSSP(GM3)中，比例为相当于10×10⁶细胞的细胞沉淀/2.4mg在VSSP中的GM3。将混合物于室温下振荡10分钟。然后，将该制剂以1/1(v/v)的比例加入IFA。将混合物于室温下振荡约15分钟，直至获得乳剂。

实施例13.获得含有黑素瘤B16细胞、VSSP(GM3)和IFA的疫苗组合物

如古巴专利130/97和美国专利No.6,149,921中所述，获得含有GM3[VSSP(GM3)]神经节苷脂的来自脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白复合体的蛋白脂质体。将VSSP(GM3)以2.4mg/ml的浓度保存于4℃pH 8.9 Tris/HCl溶液中，直至使用。

为了制备免疫原性物质，将鼠黑素瘤B16细胞系的悬液(50×10⁶细胞/ml)于300×g离心10分钟。将所得的沉淀重悬于VSSP(GM3)中，至浓度为10×10⁶细胞/2.4mg在VSSP中的GM3。将混合物于室温下振荡10分钟。然后，将该制剂以1/1(v/v)的比例加入IFA。将混合物于室温下振荡约15分钟，直至获得乳剂。

实施例14.获得包含带有编码人EGF受体胞外域(ECD-HER-1)的基因的质粒、VSSP(GM3)和IFA的疫苗组合物

如古巴专利130/97和美国专利No.6,149,921中所述，获得含有GM3[VSSP(GM3)]神经节苷脂的来自脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白复合体的蛋白脂质体。将VSSP(GM3)以4.8mg/ml的浓度保存于4℃pH 8.9 Tris/HCl溶液中，直至使用。

用于插入所感兴趣DNA的载体为pcDNA3哺乳动物表达质粒，其含有SV40复制起点，和人立即早期巨细胞病毒启动子(IECP)。将编码人EGF受体胞外域(ECD-HER-1)的基因插入该质粒中。所得的质粒(ECD-HER-1/pcDNA3)用于免疫原性制剂。

为了制备免疫原性物质，将ECD-HER-1/pcDNA3质粒溶液在磷酸盐缓冲液中调节至浓度为2mg/ml。然后，将其与VSSP(GM3)制剂以1/1(v/v)的比例相混合。混合为于室温下振荡5分钟。随后，将该制剂以1/1(v/v)的比例加入IFA。将混合物于室温下振荡约15分钟，直至获得乳剂。

实施例15.由VSSP(GM3)制剂在体外诱导树突细胞成熟

人树突细胞获自从外周血分离的单核细胞，并在重组人GM-CSF(hr)(50ng/ml)和hr-IL4(1000U/ml)的存在下生长7天。在第7天，使所获得的树突细胞与或不与VSSP(GM3)(1μg/ml)接触18小时。作为对照，将树突细胞与0.1μg/ml从脑膜炎奈瑟氏球菌菌株44/76纯化的LPS或与MPLA(Sigma)一起温育。各制剂的表型通过流式细胞仪测定。

如表2所示，用VSSP(GM3)处理引起CD11c表达增加，以及DC CD83成熟标记的可观变化。观察到HLA-DR分子表达水平的增加。VSSP(GM3)诱导表达CD86分子的细胞数目增加。VSSP(GM3)和LPS显示出相同的诱导受处理DC成熟的能力。另一方面，LPS的去毒变异体MPLA等级较低。

表2不同的制剂在体外诱导树突细胞成熟

    CD11c    CD86    CD83  HLA-DR    CD40    培养基    37,5    12,5    5,5  401,5    9    LPS    57,1    35,4    14,6  672,7    15,8    VSSP    60    29,6    13,3  656,4    14,1    MPLA    40,1    15,4    5,6  415,5    9,7

平均荧光强度值，由FACS测量

实施例16.与施用疫苗组合物相关的诱导对P3嵌合MAb(P3cMab)的特异性体液免疫应答

将C57BL/6品系的小鼠用实施例10中所述的疫苗组合物进行免疫。通过i.m.注射接种50μg嵌合单克隆抗体，施用2剂(每14天一剂)。在首次免疫之后21天取血清样本。作为对照组，用以IFA或明矾为佐剂的P3 cMab同样地免疫相同品系的小鼠。将获得的血清通过ELISA技术分析，以确定抗-P3 cMAb抗体的存在。

与对照组相比，100％用本发明所述疫苗组合物免疫的小鼠产生更高滴度的针对P3 cMAb的特异性IgG抗体(表3)。

表3在用不同制剂免疫的C57BL/6小鼠中诱导的针对P3c MAb的抗体应答

    制剂    反应动物  特异性IgG滴度  (均值)    P3c MAb/VSSP/IFA    5/5  8000    P3c MAb/IFA    4/5  4000    P3c MAb/明矾    2/5  1000

实施例17.诱导特异性针对CDR3/VH-P3肽的增殖性细胞应答，与施用疫苗组合物相关联

将C57BL/6品系的小鼠用实施例11中所述的疫苗组合物进行免疫。通过i.m.注射接种100μg肽，施用4剂(每14天一剂)。作为对照组，用以IFA或明矾为佐剂的CDR3/VH-P3肽同样地免疫相同品系的小鼠。在施用最后一剂之后7天从动物中取出腹股沟淋巴结，并通过器官灌注的方式分离淋巴细胞。淋巴细胞与CDR3/VH-P3肽(50μg/ml)一起生长96小时。在培养的最后18小时期间，使细胞接触1μCi的含氚胸苷(Amersham，United Kingdom)，然后收获细胞，并在闪烁计数器(LKB wallac，Finland)中检测β发射(cpm)。细胞增殖水平测定为刺激指数(SI)。该测定所得结果如表4所示。

表4在用不同制剂免疫的C57BL/6小鼠中，诱导特异性针对CDR3/VH-P3肽的增殖性细胞应答

    CDR3/VH-P3/VSSP(GM3)    CDR3/VH-P3/IFA    CDR3/VH-P3/明矾50μg/ml    4±0,2    1，8±0,1    1，6±0,2

刺激指数值。可以看出，仅在与VSSP(GM3)形成的制剂中所包含的肽能诱导特异性抗原增殖。

实施例18.诱导特异性针对ECD-mEGF-R的细胞毒性细胞应答，与施用含重组APV--ECD-mEGF-R/APV、VSSP(GM3)和IFA的疫苗组合物相关联

如古巴专利130/97和美国专利No.6,149,921中所述，获得含有GM3[VSSP(GM3)]神经节苷脂的来自脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白复合体的蛋白脂质体。将VSSP(GM3)以2.4mg/ml的浓度保存于4℃pH8.9 Tris/HCl溶液中，直至使用。

用于插入所感兴趣DNA的病毒载体为禽痘病毒(APV)。通过同源重组的方式将编码鼠EGF受体胞外域(ECD-mEGF-R)的基因插入APV。将ECD-mEGF-R/APV重组载体的溶液调节至10⁸pfu/ml浓度。

同时制备VSSP(GM3)乳剂，将载体溶液以1/1(v/v)的比例加入IFA。将混合物于室温下振荡约15分钟。随后，用200μl的ECD-mEGF-R/APV溶液IP免疫Balb/c小鼠，然后i.m.接种100μl的VSSP(GM3)/IFA。对照组小鼠接受ECD-mEGF-R/APV和磷酸盐缓冲液(STFS)。每2周各施用2剂，在试验开始后21天，处死小鼠，以获得相应的脾细胞。使用磁珠技术从脾细胞中分离CD8T细胞。用预先用ECD-mEGF-R免疫显性肽‘NYGTNRTGL’脉冲的来源于骨髓的树突细胞(bmDC)以10∶1(T：bmDC)的比例在IL-2(50u/ml)存在下刺激所述T细胞5天。在刺激结束时，进行细胞毒性试验，其中当将不同量的所述细胞接触用‘NYGTNRTGL’肽脉冲的P815细胞系时评价Cr⁵¹释放(表5)。

表5特异性针对ECD-mEGF-R的细胞毒性细胞应答

  用ECD-mEGFR/APV+VSSP(GM3)免疫    用ECD-mEGFR/APV+STFS免疫  P815+肽    P815    P815+肽    P815                                Cr⁵¹释放(％)100∶1  78    8    43    950∶1  51    6    25    725∶1  29    5    14    5

与APV相比，对动物施用VSSP(GM3)使对细胞毒性T细胞的诱导能力增强2倍。

实施例19.VSSP疫苗载体的免疫重建特性

在I期临床试验中，通过i.m.注射将本发明所述的VSSP疫苗载体施用于患有转移黑素瘤的患者。患者在6个月内接受9剂(200μg在VSSP中的NGcGM3)。在最初2个月内施用前5剂，剩余的4剂每月施用。

在第0天对患者取血(在施用第1剂之前)，并在第56天再次取血(第5剂)。同时从8名健康志愿者中取血。通过Ficoll梯度法从所述样本中获得相应的外周单核的细胞(PMC)，通过流式细胞仪测定CD3+、CD4+和CD8+细胞的％。如表6所示，在第0天，3名患者的PMC中CD3、CD4和CD8T细胞标记的相对表达低于健康供体的平均表达。

可以看出，在第56天，在相同患者的PMC中CD3、CD4和CD8T细胞标记的相对表达水平恢复至常规水平，即在接受4次VSSP(NGcGM3)注射之后。

表6.黑素瘤患者和健康对照的PMC中T细胞标记的相对表达。VSSP(NGcGM3)对标记正常化的作用。

  占总PMC的％  第0天    占总PMC的％    第56天  CD3+  CD4+  CD8+  CD3+  CD4+  CD8+    健康对照  70  45  25  -  -  -    EM  30  25  5  70  48  22    SJ  26  40  4  70  40  18    VD  15  28  4  70  56  20

附图简要说明

图1.用ECD-mEGF-R/VSSP-GM3/IFA免疫所诱导产生的抗体的亚群分布。

通过ELISA测定用ECD-mEGF-R/KLH/CFA(I)或ECD-mEGF-R/VSSP-GM3/IFA(II)免疫的C57BL/6小鼠的血清，以测定由免疫所诱导产生的IgG的亚群分布。

图2.用ECD-HER-1/VSSP-GM3/IFA免疫的小鼠血清对表达EGF-R的细胞的识别。

将A431系细胞与以下物质一起温育：小鼠C57BL/6免疫前血清(A)；单克隆抗体ior egf-r3作为阳性对照(B)；和经免疫的小鼠C57BL/6血清。为进行免疫检测，使用结合荧光团的抗小鼠二抗。在流式细胞仪中测量荧光强度。

图3.用ECD-HER-1/VSSP-GM3/IFA免疫的小鼠血清的细胞溶解活性。

将负载⁵¹Cr的A431细胞与补体和以下物质一起温育：I)单克隆抗体ior-t3(针对CD3，作为阴性对照)；II)单克隆抗体iorEGF-R-r3(针对EGF-R，作为阳性对照)；III)来自C57BL/6小鼠的免疫前血清；IV)来自用ECD-HER-1/VSSP-GM3/IFA免疫的C57BL/6小鼠的血清；V)相等数目的相同细胞用去污剂进行溶解，以测定总⁵¹Cr掺入量。结果以特异性溶胞％来表示。

图4.从用ECD-HER-1/VSSP-GM3/IFA免疫的小鼠获得的血清的中和能力。

将A431细胞与1/5、1/10、1/20和1/40稀释的来自用ECD-HER-1/VSSP-GM3/IFA免疫的小鼠的血清库或与相同稀释度的免疫前血清库一起温育。向每孔中加入EGF-¹²⁵I(100000com)，通过将细胞与EGF¹²⁵I一起温育来测定总结合。在γ计数器中测量CPM。

图5.用ECD-mEGF-R/VSSP-GM3/IFA免疫的植入Lewis肿瘤的小鼠的寿命。

对如实施例9中所述免疫的C57BL/6小鼠植入100000个Lewis肿瘤细胞，并进行观察，以确定其寿命。对照组的相同品系小鼠用ECD-mEGF-R/CFA免疫，并以相同方式植入肿瘤。