携带超抗原SEA基因低免疫原性病毒的构建及潜在抗肿瘤作用

摘要

目的：
　　1.构建携带超抗原SEA基因的的低免疫原性慢病毒载体。
　　2.探讨携带超抗原SEA基因慢病毒载体靶向膀胱肿瘤细胞BIU-87细胞表达能力。
　　3.研究慢病毒载体表达的SEA蛋白刺激周围淋巴细胞的增殖作用及其机制抗肿瘤作用。
　　方法：
　　应用Genebank搜索hTERT-CMV启动子及SEA目的基因序列，设计寡聚核苷酸引物，以原有慢病毒载体为模板，应用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）法获得启动子及目的基因序列。将获取基因构建到慢病毒载体质粒中，基因测序正确后，转入感受态细胞中扩增、收集。利用包装系统质粒共转染293FT细胞中包装病毒，获取目标阳性空斑，试剂盒方法提取慢病毒的基因组，进行双酶切鉴定。通过293FT细胞感染扩增病毒，采用超速离心法获取浓缩的病毒上清液，病毒滴度通过荧光滴度法测定。梯度浓度病毒液转染膀胱肿瘤BIU-87细胞株后，提取细胞RNA进行RT-PCR反应，目的基因的PCR产物测序，Western blot方法检测SEA蛋白的表达。病毒转染后的BIU-87细胞与人淋巴细胞共培养，不同时间点后采用倒置显微镜观察淋巴细胞与肿瘤细胞生长情况，收集细胞培养液，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测共培养对细胞因子分泌的影响。
　　结果：
　　1.PCR产物基因测序证实慢病毒质粒中目的基因与启动子连接正确，载体质粒大小为10458bp，未发现明显碱基突变。荧光滴度法检测病毒滴度为(4.30±2)×109TU/mL。构建的慢病毒载体双酶切产物基因测序与预期结果相同。
　　2.Western blot方法结果显示BIU-87细胞中有SEA基因翻译的超抗原SEA蛋白存在。
　　3.实验组淋巴细胞与转染后的BIU-87肿瘤细胞共培养24、48、96 h后，BIU-87细胞数量明显少于空白对照组。ELISA结果显示实验组IL-2、IL-4分泌明显高于空白对照组。
　　结论：
　　1.成功构建完成表达SEA基因的重组慢病毒载体，且对重组慢病毒载体基因组及毒性进行检测，扩增、纯化一定数量病毒载体用于体外实验研究。
　　2.应用构建的重组慢病毒载体体外作用于膀胱肿瘤BIU-87细胞株，初步验证载体对膀胱肿瘤的治疗作用及其机制。

目录

声明

中英文缩略词表

第一章 绪 论

第二章 携带超抗原SEA基因低免疫原性慢病毒载体的构建

2.1 材料

2.1.1 细胞系

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要溶液配制

2.1.4 主要仪器

2.2 方法

2.2.1 基因的获取

2.2.2 目的基因质粒的的构建

2.2.3 慢病毒载体的设计

2.2.4 pLVX-IRES-Neo-SEA的构建

2.2.5 连接产物鉴定

2.2.6 细胞培养

2.2.7 病毒包装

2.2.8 收集与浓缩病毒

2.2.9 测定病毒滴度

2.2.10 慢病毒的储存与稀释

2.2.11 统计学分析

2.3 结果

2.3.1 PCR获得目的基因SEA，证实片段大小为774bp。

2.3.2 成功构建低免疫原性慢病毒载体

2.3.3 BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切验证质粒

2.3.4 荧光滴度法检测病毒滴度

2.4 讨论

第三章 低免疫原性慢病毒载体表达sea蛋白对膀胱癌细胞的治疗作用及其机制

3.1 材料

3.1.1 细胞系

3.1.2 主要试剂

3.1.3 主要溶液配制

3.1.4 主要仪器

3.2 方法

3.2.1 细胞培养

3.2.2 RT-PCR检测

3.2.3 反转录

3.2.4 Western blot

3.2.5 淋巴细胞的提取

3.2.6 病毒对肿瘤细胞生长的影响

3.2.7 EILSA方法检测细胞因子分泌情况

3.2.8 统计学分析

3.3 结果

3.3.1 病毒转染膀胱肿瘤BIU-87细胞后SEA基因的转录

3.3.2 病毒转染后BIU-87细胞可表达SEA蛋白

3.3.3 慢病毒载体对BIU-87细胞生长情况的影响

3.3.4 慢病毒载体对淋巴细胞分泌细胞因子的影响

3.4 讨论

第四章 主要结论

4.1 主要结论

参考文献

致谢

硕士期间发表的论文和参与的项目