用于重组生产雪花莲外源凝集素的大肠杆菌菌株及方法

摘要

本发明涉及转化了表达质粒p22bMG3或者其衍生物的大肠杆菌菌株以及利用所述菌株重组生产雪花莲外源凝集素(GNA)蛋白的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及用于重组生产雪花莲外源凝集素的大肠杆菌菌株及方法。更具体地说，本发明涉及转化了表达质粒p22bMG3的大肠杆菌菌株以及利用该菌株重组生产雪花莲外源凝集素(Snowdrop lectin，Galanthus nivalis agglutinin，GNA)的方法。

背景技术

植物外源凝集素是植物的防御蛋白，对植物有很重要的生理作用，已成为生物科学和医学研究中非常有价值的新工具，如分离和鉴定糖蛋白和糖脂，研究细胞和组织的组织化学新试剂，细胞分型，分离淋巴细胞和骨髓细胞，评估疾病患者的免疫状态，染色体分析等。雪花莲(Galanthus nivalis)外源凝集素(GNA)具有甘露糖特异结合活性。除了上述用途之外，对人类和动物的巨细胞病毒及逆转录病毒，具有强烈及选择性的抑制作用，正成为艾滋病研究的一个重要工具。另外，GNA对刺吸式和某些咀嚼式害虫、以及线虫均有毒性，在害虫和线虫病防治方面具有广阔的应用前景。

目前GNA的制备方法主要是从雪花莲球茎中提取，因含量少、原料缺、分离方法繁琐，导致天然GNA的成本高、价格昂贵，仅美国Sigma公司有商品GNA出售，常常出现缺货。这严重制约了GNA的开发利用。

雪花莲外源凝集素的基因已被克隆，其核苷酸序列及相应的氨基酸序列已被公开(参见van Damme，E.J.M.，Kaku，H.，Perini，F.，Goldstein，I.J.，Peeters，B.，Yagi，F.，Decock，B.and Peumans，W.1993.Biosynthesis，primary structure and molecular cloning ofsnowdrop(Galanthus nivalis L.)lectin.GenBank，1993，(Protein)，ACCESSION AAA33346.(Nucleotide)Locus GAAL2A accessionM55556.1)。然而，目前尚没有快速，简便，高效且经济地重组生产GNA的方法。本发明为满足现有技术中的这一需要提供了一种途径。

发明内容

本发明的一个目的是提供可用于重组生产雪花莲外源凝集素(GNA)的大肠杆菌菌株。

本发明的另一目的是提供重组生产雪花莲外源凝集素(GNA)的方法。

附图说明

图1是pC1300UG质粒的结构示意图。

图2是重组质粒pMGT42的结构示意图。

图3是大肠杆菌表达载体pET22b(+)的结构示意图。

图4是重组表达质粒p22bMG3的结构示意图。

图5是重组GNA多肽的完整氨基酸序列(SEQ ID NO：1)及相应的编码核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。

具体实施方式

本发明涉及转化了p22bMG3或者其衍生物的多种大肠杆菌菌株或者其衍生菌株，它们可以用来生产雪花莲外源凝集素。

在本发明的上下文中，重组质粒的“衍生物”是指在质粒中外源基因的位置之外可以存在一些不影响该外源基因表达的额外序列，或者可以在雪花莲外源凝集素的编码序列中存在一些不改变所编码氨基酸的突变。普通技术人员知晓，不同的宿主生物存在比较偏爱的密码子用法。优选地，GNA编码基因针对待选用的宿主细胞而进行了密码子优化，以适于在其中表达。在一个实施方案中，所述额外序列可以是其他外源基因。在另一个实施方案中，所述额外序列可以是有助于本发明雪花莲外源凝集素纯化的标记序列，例如六组氨酸标记序列。在又一个实施方中，所述额外序列还可以是插入其中的接头序列，以便于例如其他基因的克隆。

在本发明的上下文中，大肠杆菌宿主菌株的“衍生菌株”是指在宿主菌株的培养过程中形成的菌株，包括例如由其单克隆形成的菌株，或者在长期的传代培养过程中可能形成的因形态、外观或某些物理化学性质发生了改变、但与亲本菌株相比生产外源蛋白质例如雪花莲外源凝集素的能力未受到削弱的菌株，包括例如缺失了某些内源性蛋白酶基因的突变菌株。

可用本发明中宿主菌株可以是本领域已知用于异源蛋白生产的任何大肠杆菌宿主菌株，包括市售的那些。

在一个实施方案中，所述大肠杆菌宿主菌株是BL21(美国Novagen公司产品)。在另一个实施方案中，所述大肠杆菌宿主菌株是BL21的衍生菌株BL21(DE3)或B834(DE3)(美国Novagen公司产品)等。

本发明包含了表达质粒p22bMG3或者其衍生物的重组大肠杆菌菌株可以用于基因工程化生产雪花莲外源凝集素。该生产方法包括如下步骤：

(1)在合适的营养培养基中在适于雪花莲外源凝集素表达的条件下培养本发明的上述重组大肠杆菌菌株；

(2)从所得细胞培养物中回收所表达的重组雪花莲外源凝集素。

在本发明方法中，利用本领域已知方法，在适于生产重组雪花莲外源凝集素的营养培养基中培养细胞。例如，可在实验室或工业用发酵罐内，在合适的培养基中、允许表达和/或分离该多肽的条件下经摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续、分批、分批补料或固相发酵)培养该细胞。培养是利用本领域已知方法(参见如Bennett J.W.和LaSure L.编，More Gene Manipulations in Fungi，学术出版社，CA，1991)，在含碳、氮源和无机盐的适宜营养培养基中进行的。适当的培养基可商购，或按照公开的组合物(如美国典型培养物保藏中心的目录中)配制而成，包括本领域中众所周知的那些，例如LB培养基，TB培养基，SOB培养基，NZCYM培养基，等等。

本发明的重组菌株可以在任何合适的温度，例如18-37℃下培养，以表达雪花莲外源凝集素。优选地，可以在常温下，例如18-30℃，更优选地20-28℃，尤其是22-25℃温度下进行培养和发酵。

在发酵过程中，可以向培养物中添加任何合适浓度的IPTG来进行诱导，例如IPTG终浓度为0.1-1.0mmol/L，优选地0.2-0.8mmol/L，更优选地0.2-0.5mmol/L。普通技术人员根据现有技术中的常规程序，即可很容易确定各种发酵工艺中的相应条件。

发酵时间依具体情况而定，可以是几小时至数十小时。优选地2-10小时，更优选地5-8小时。

发酵后，以常规蛋白质分离和纯化方法从培养物中回收所表达的蛋白质。已知的纯化方法包括从培养基中过滤分离细胞、采用超声波破碎法、冻融裂解法、溶菌酶法和高速珠磨法破碎重组大肠杆菌细胞、采用尿素或十二烷基肌氨酸钠等溶解包涵体，以及层析方法(如离子交换层析，亲和层析，疏水层析，层析聚焦，和大小排阻层析)，电泳方法(如制备性等电聚焦(IEF))，差异溶解性(如硫酸铵沉淀)，或者提取(参看，如《蛋白质纯化》，J.-C.Janson和Lars Ryden编著，VCHPublishers，纽约，1989)。

下面参考实施例对本发明作进一步说明。

实施例

1  重组表达质粒的创建

参照“罗素兰等，GNA成熟蛋白基因的亚克隆及其大肠杆菌表达载体的构建。生物技术，2002(6)：1-2”描述的操作构建重组表达质粒。具体地说，包括以下流程：

(1)GNA基因的克隆

以pC1300UG(附图1，由复旦大学唐克轩教授赠送)为模板，用P4(5′GCCCATGGACAATATTTTGTACTCC 3′，SEQ ID NO：3，下划线为添加的NcoI限制性酶切位点)和P2(5′TGGTCGACTCATCCAGTAGCCCAACGATC 3′，SEQ ID NO：4下划线为添加的SalI限制性酶切位点)进行PCR扩增。PCR条件如下：在PE公司2400型PCR仪上进行，循环程序为94℃，5min；94℃30s，60℃30s，72℃40s(30cycles )；72℃5min。电泳检测显示得到了一条330bp的DNA条带。用Promega公司的DNA Clean-up试剂盒回收PCR产物，克隆在T-vector(Promega公司)上，转化经CaCl2处理过的感受态大肠杆菌XL1菌株，并对涂布了IPTG(8mg/mL)和X-gal(20mg/mL)的LB琼脂平板进行铺板。37℃下培养过夜后，利用兰白菌落挑选重组子。经碱法小量制备质粒DNA，进行测序。经核对序列，证实重组质粒中插入了MGNA基因，并且附加的酶切位点和终止密码序列完全正确。将重组质粒命名为pMGT42。

(2)构建GNA重组表达质粒

用NcoI/SalI双酶切pMGT42，回收约300bp的插入片段，并插入到同样经NcoI/SalI双酶切的pET22b(+)(Novagen，附图3)内，得到与pelB信号肽融合的GNA原核表达载体p22bMG3(附图4)。通过酶切和测序证实了连接的正确性(附图5)。

2  转化大肠杆菌宿主菌株

将上述构建的GNA原核表达载体p22bMG3导入宿主菌株E.coli菌株BL21(Novagen公司)中，获得了重组大肠杆菌菌株E22bMG3。该菌株已于2003年6月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国北京市海淀区中关村北一条13号，100080)，保藏号为CGMCC0935。

3  重组GNA的发酵生产和纯化方法

(1)挑取E22bMG3单菌落接种在5mL(含Amp 100mg/L)的LB培养基中，于37℃过夜培养。

(2)取过夜培养物1mL接种到500mL LB培养基中培养2-3h，至OD₆₀₀约0.3～0.6时，加入250μL 1mol/L IPTG贮液。于22℃继续培养5h以诱导GNA的表达。

(3)经3000rpm离心收获菌体沉淀，用超声破碎法破碎细胞，并将细胞裂解物于8000rpm速度离心。所得上清即为可溶性蛋白样品，沉淀为不溶性蛋白聚集体(包涵体)。

(4)用去污剂0.2％SKL((十二烷基肌氨酸钠水溶液))室温溶解包涵体20min。

(5)用透析液Buf A(含50mmol/L Tris-HCl(pH7.9)，0.5mmol/LEDTA，50mmol/L NaCl)室温透析6-8h，去除SKL，使变性的重组GNA蛋白重折叠。用Buf A+50％甘油室温再透析6h，浓缩重组GNA溶液至10倍。经SDS-PAGE及UVI凝胶分析系统测知纯度达98％以上。

(6)将E22bMG3的可溶性蛋白样品和重折叠GNA蛋白经甘露糖琼脂糖柱(美国SIGMA Co.产品)层析。先用6倍体积NaCl/Pi(1.5mmol/L KH₂PO₄，8mmol/L Na₂HPO₄，2.7mmol/L KCl，137mmol/L NaCl，pH7.4)洗柱去除未结合蛋白，再用20mmol 1，3-二氨基丙烷洗脱获得GNA蛋白。由此得到高纯度的活性GNA。冷冻干燥得纯品GNA。其产率约为15mg重组GNA。

4  重组GNA的活性测试

(1)用SDS-PAGE和Western Blot分析证明所获得的重组蛋白确为GNA。重组GNA用SDS-PAGE电泳分析，分离胶为15-20％的聚丙烯酰胺凝胶、5％积层胶，结果得到一条约12.5KD大小的条带，与天然GNA(SIGMA Co.)一样。用兔抗天然GNA的抗血清为一抗，偶联辣根过氧化物酶的羊抗兔IgG(Bio-Rad)为二抗进行Western Blot分析。结果表明重组GNA可与天然GNA的抗体特异结合，并显示杂交信号。

(2)重组GNA的凝血活性测定按照毛雪等(毛雪，高丽峰，李彩霞，李润植。植物凝集素对蚜虫的抗生效应。山西农业大学学报1999，19(2)；122-124，144。)的方法测定不同浓度梯度重组GNA与天然GNA对2％兔血红细胞悬浮液的凝集活性。结果表明0.1-0.2mg/L重组蛋白即有凝血活性，与天然GNA的0.2mg/L凝集最低浓度一致。说明重组GNA与天然GNA具有相同的凝血活性。

(3)重组GNA抗虫活性测定  按李彩霞等[李彩霞，高丽峰，李润植，全纯人工营养液饲养蚜虫研究，山西农业大学学报，1997，17(3)：217～221]方法人工饲养棉蚜(Aphis gossypii Glover)和萝卜蚜(Rhopalosiphum pseudobrassicae Davis)，将不同浓度梯度重组GNA与天然GNA加入蚜虫人工食料中，观测对蚜虫的抗生效应。结果显示，0.1g/L重组GNA即对棉蚜和萝卜蚜具有毒性，与天然GNA无显著差异。用不同浓度梯度重组GNA直接喷杀饲养在盆栽小白菜[B.campestvis ssp.chinensis(L.)Makino]上的蚜虫，和接种蚜虫在事先喷布重组GNA的叶片上的方法测试抗虫活性。结果表明浓度在0.2-0.5g/L范围内对蚜虫有明显的毒性，毒性强度随浓度的升高而增强。

因此可得出，本发明所得重组GNA与天然GNA完全一样，且具有天然GNA的所有生物活性。

上述实施例只是为了阐明、而不是限制本发明。相关领域的技术人员清楚地知道，可对本文所述的内容作其它适当的修饰和变化，并可在本发明或其任何实施方案的范围内进行这种修饰和变化。这样的修饰和变化都落入本发明的保护范围。

                         序列表<110> 海南大学<120> 用于重组生产雪花莲外源凝集素的大肠杆菌菌株及方法<130><160> 4<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 333<212> DNA<213> 人工序列<400>  1gcccatggac aatattttgt actccggtga gactctctct acaggggaat ttctcaacta     60cggaagtttc gtttttatca tgcaagagga ctgcaatctg gtcttgtacg acgtggacaa    120gccaatctgg gcaacaaaca caggtggtct ctcccgtagc tgcttcctca gcatgcagac    180tgatgggaac ctcgtggtgt acaacccatc gaacaaaccg atttgggcaa gcaacactgg    240aggccaaaat gggaattacg tgtgcatcct acagaaggat aggaatgttg tgatctacgg    300aactgatcgt tgggctactg gatgagtcga cca                                 333<210> 2<211> 105<212> PRT<213> 人工序列<400> 2Asp Asn Ile Leu Tyr Ser Gly Glu Thr Leu Ser Thr Gly Glu Phe Leu1               5                   10                  15Asn Tyr Gly Ser Phe Val Phe Ile Met Gln Glu Asp Cys Asn Leu Val

        20                  25                  30Leu Tyr Asp Val Asp Lys Pro Ile Trp Ala Thr Asn Thr Gly Gly Leu

    35                  40                  45Ser Arg Ser Cys Phe Leu Ser Met Gln Thr Asp Gly Asn Leu Val Val

50                  55                  60Tyr Asn Pro Ser Asn Lys Pro Ile Trp Ala Ser Asn Thr Gly Gly Gln65                  70                  75                  80Asn Gly Asn Tyr Val Cys Ile Leu Gln Lys Asp Arg Asn Val Val Ile

            85                  90                  95Tyr Gly Thr Asp Arg Trp Ala Thr Gly

        100                 105<210> 3<211> 25<212> DNA<213> 人工序列<400> 3gcccatggac aatattttgt actcc                                           25<210> 4<211> 29<212> DNA<213> 人工序列<400> 4tggtcgactc atccagtagc ccaacgatc                                       29