大肠杆菌DH5α的耐乙酸突变株及其选育方法和应用

摘要

本发明公开了一种大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α的耐乙酸突变株CGMCC No.0941及其选育方法和应用。本发明对DH5α进行诱变，在存在乙酸抑制压力的条件下选育其耐乙酸突变株，以提高外源基因的表达水平。本发明的菌种可用于外源基因的表达。本发明的DH5α的耐乙酸突变菌的优点在于生长优势明显，在耐乙酸能力增强的同时乙酸的产生也减少，容易实现高密度培养，外源基因表达效率提高。

说明书

技术领域

本发明涉及一种大肠杆菌，特别涉及一种大肠杆菌DH5α的突变株及其选育方法和应用。

背景技术

大肠杆菌(Esherichia coli)具有生长快、培养成本低廉、遗传背景清楚、易实现高密度培养等优点，是应用最广泛的外源基因表达系统之一。然而该表达系统存在一个较大的问题就是在培养过程中会积累一些代谢副产物，主要是乙酸，不仅造成碳源的浪费，而且会抑制菌体的生长和降低外源基因的表达效率，严重地影响了大肠杆菌在高密度培养时的生产能力(见文献：Trends in Biotechnology，1996，14：98～105)。

为了解决乙酸对大肠杆菌的抑制问题，过去的一些研究主要集中在以下几个方面：(1)培养基优化；(2)发酵过程控制；(3)选育乙酸生成途径－磷酸转乙酰酶(PTA)或乙酸激酶(ACK)缺失突变株；(4)代谢工程方法。这几种解决乙酸的抑制的方法主要集中在减少培养过程中乙酸的生成上，对改善菌体的生长和提高外源基因的表达效率都取得了一定的效果，但也存在一些不足之处。进行优化培养基时，在选用其它碳源如甘油替代葡萄糖时，往往会增加培养的成本，其效果也随所用菌株不同而有较大差异。发酵过程中限制性流加葡萄糖以控制比生长速率低于临界值能有效控制乙酸的生成，但会使菌体处于半饥饿态，是以牺牲比生长速率，延长培养时间来实现的，特别不利于与生长相关的外源基因的表达。发酵－分离耦合操作，可以在副产物产生的同时被除去，但对设备要求较高，投资加大，并难于在大规模生产上应用。PTA和ACK缺失突变株，虽然能够减少乙酸的生成，但是往往会造成细胞生长减缓，并积累其它的有机酸如丙酮酸、琥珀酸，这同样会抑制外源基因的表达。代谢工程方法改造大肠杆菌菌株是解决乙酸问题的根本方法，需要全面考虑大肠杆菌的整体代谢网络的结构和调控特点，有待进一步进行研究，现有的工作多为将代谢流引向抑制作用较弱的代谢物或多糖，以及缺失PTA和ACK等。

选育耐乙酸大肠杆菌突变菌也可作为一种有效的手段以增强菌株对乙酸的耐受性和提高外源基因的表达效率，发明人曾筛选了大肠杆菌JM101的耐乙酸突变株JL3，不但改善了乙酸抑制条件下菌体的生长，而且减少了乙酸的积累并提高了外源β-半乳糖苷酶基因的表达效率(微生物学报，2001，41：223～228)。文献报道的大肠杆菌DH5α(HanahanD，J.Mol.Biol.，1983，166：557～580)由于其转化效率高，是基因工程中最常用的宿主菌之一，然而与其它一些大肠杆菌菌株相比，DH5α在基本培养基中消耗葡萄糖慢、生长能力差，且对乙酸十分敏感，不易实现高密度培养，所以DH5α的高密度培养存在较多问题。

发明内容

本发明需要解决的技术问题之一是公开一种大肠杆菌DH5α的耐乙酸突变株，以克服现有技术存在的上述缺陷；

本发明需要解决的技术问题之二是提供所述突变株的选育方法。

本发明的构思是这样的：

对DH5α进行诱变，在存在乙酸抑制压力的条件下选育其耐乙酸突变株，以提高外源基因的表达水平。

大肠杆菌DH5α为一种属于大肠埃希氏菌属的菌种，对DH5α进行诱变或利用其自然突变，在存在乙酸抑制压力的条件下进行选育，即可获得本发明所说的耐乙酸突变株(Escherichia coli)DA19。该菌种已在2003年6月6日在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCC No.0941。

该菌种有如下特性：

该菌种与出发菌DH5α菌落形状和大小相同；与出发菌一样能够利用葡萄糖、甘油、乙酸钠为碳源，不能利用乳糖、蔗糖、淀粉作为碳源，与出发菌DH5α的营养需求相同，为维生素B₁营养需求型；将含lacZ启动子及其调控的β-半乳糖苷酶基因的质粒pUC18或pUC19转入细胞内，在含有IPTG与X-gal的LB培养基琼脂平板菌落显兰色，与出发菌一样仍然存在α-互补现象。

1.形态特征：

  (1)细胞的形态和大小：杆状，0.5～3μm。

  (2)胞子的形成：不会形成孢子。

  (3)革兰氏染色性：阴性。

2.在各种培养基上的生长状态：

  (1)LB琼脂平板培养(30℃，48小时)

  菌落形状：圆形(Circular)，平滑(Smooth)，扩展(Spread)

  大小：1～3mm；

  色调：浅黄白色。

  (2)LB琼脂斜面培养(30℃，24小时)

  生长良好，菌苔光滑(Smooth)。

  (3)LB液体培养(30℃，10小时)

  生长良好，培养液混浊，放置一段时间会沉降(Sediment)。

  (4)由蛋白胨生成氨：阳性；

  (5)对氧的需求：兼性厌氧；

  (6)由糖生成酸

  阳性：葡萄糖、甘油、果糖；

  阴性：蔗糖、乳糖；

  (7)生长pH范围：6.0～8.0；

  (8)生长最适宜温度：28～37℃；

  (9)营养需求型试验：维生素B₁营养缺陷。

上述的特性可采用伯杰细菌鉴定手册(Bergey’s Manual ofDeterminative Bacteriology)介绍的方法进行鉴别，本发明的突变株DA19与出发菌DH5α最大的区别在于其耐乙酸能力强，在含乙酸的基本培养基中生长的菌体浓度大大高于其出发菌DH5α，以消耗的葡萄糖为基准的菌体得率Y_X/G是出发菌DH5α的2倍以上。

本发明的大肠杆菌DH5α的耐乙酸突变株DA19的选育方法依次包括如下步骤：

(1)对DH5α菌种进行培养，获得DH5α菌液；

(2)用⁶⁰Co对DH5α菌液进行辐射，剂量为200-900Gy；

(3)对辐射后的DH5α菌液为种子进行分批培养，培养时间16-40h；

(4)连续培养，培养过程中逐步提高稀释率，以初始稀释率低于0.10h^-1、最终稀释率高于0.3h^-1流加培养基A，最终OD₆₀₀不低于0.3；

(5)继续连续培养，培养过程中逐步提高稀释率，以初始稀释率0.05-0.12h^-1、最终稀释率不低于0.25h^-1流加培养基B；

(6)连续培养结束后用含葡萄糖和乙酸盐的基本培养基平板进行单菌落分离，即可选育到本发明的菌种；

所说的培养基A或B以葡萄糖为碳源，A含有50-70mmol/L的乙酸盐和5g/L的蛋白胨，B含有100-150mmol/L的乙酸盐和2.5g/L的蛋白胨。优选的乙酸盐为乙酸的钠盐、钾盐或铵盐中的一种，以避免直接加入乙酸引起的pH变化。

按照本发明优选的技术方案，对流加培养基B结束后的培养液，再次进行用⁶⁰Co进行进行辐射，并采用步骤(3)、(4)、(5)和(6)的方法进行培养，以进一步提供所获得的菌种的耐乙酸能力。

本发明的菌种可用于表达外源基因。

本发明的DH5α的耐乙酸突变菌的优点在于生长优势明显，在耐乙酸能力增强的同时乙酸的产生也减少，容易实现高密度培养，外源基因表达效率提高。

为了更好地理解本发明的内容，通过以下实施例作进一步说明。

具体实施方式

                       实施例1

挑取斜面保存的DH5α菌种一环，接入250mL锥形瓶里的30mL YPS培养基[1L含：Tryptone(英国Oxiod公司)10g，酵母抽提物(英国Oxiod公司)5g，NaCl 10g，pH7.2]，30℃，250r/min摇床培养过夜得一级种子，转接一级种子1mL于250mL锥形瓶里30mL YPS培养基中，相同条件培养10h作为二级种子。取二级种子10ml于5000rpm离心15min，弃上清夜，加入10ml无菌生理盐水，混匀，用剂量700Gy的⁶⁰Co辐射40min后，接入500mL微型玻璃反应器中250ml MY培养基[1L含：酵母抽提物(英国Oxiod公司)4g，葡萄糖2g，Na₂HPO₄·12H₂O15.12g，KH₂PO₄ 3g，NaCl 0.5g，NH₄Cl 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，CaCl₂0.011g，1％维生素B₁ 0.2mL，葡萄糖1.8g，Polypepton(日本大五营养)5g，乙酸钠5g，pH7.0]，同时抽出培养液。连续培养中逐步提高稀释率，180h时达到0.351h^-1，OD₆₀₀nm达0.393。此时将流加的培养基切换为培养基B[1L含：葡萄糖1.6g，Polypepton2.5g，乙酸钠10g，pH7.0，无机盐及维生素B₁与培养基A相同]，稀释率降到0.1h^-1，继续进行连续培养。培养过程中逐步提高稀释率，310h达到0.263h^-1。取反应器中的最终培养液，适当稀释涂MAA平板[1L中含葡萄糖2g，乙酸钠5g，琼脂20g，无机盐和维生素B₁与培养基A相同]，对菌落出现较早且大的单菌落进行进一步的耐乙酸能力鉴定，在含有5g/L乙酸钠，葡萄糖浓度为2.2g/L MA培养基中[1L中含无机盐和维生素B₁与培养基A相同]摇瓶培养16h，选育到的突变株DA系列与DH5α培养结果见表1，由表1可知，突变株DA系列由于耐乙酸能力增加，在MA培养基中生长的菌体浓度大大高于其出发菌DH5α，以消耗的葡萄糖为基准的菌体得率Y_X/G提高了2倍多。

                         表1

菌株名称         DH5α    DA19    DA42    DA50    DA52    DA53

细胞浓度/(g/L)   0.178    0.517   0.499   0.492   0.466   0.481

Y_X/G^a/(g/g)     0.063    0.216   0.207   0.204   0.191   0.199

实施例1中流加培养基B的连续培养结束时，取培养液10ml，用剂量700Gy ⁶⁰Co再次辐照，再一次进行连续培养，方法同实施例1，但流加培养基C[1L含：葡萄糖1.6g，乙酸钠10g，pH7.0，无机盐和维生素B₁与培养基A相同]，初始稀释率为0.082h^-1，逐步提高稀释率，176h达到0.158h^-1，此时OD₆₀₀nm为0.030，结束连续培养。取反应器中的最终培养液，适当稀释涂MAB平板[1L中乙酸钠10g，其它成分含量与MAA平板相同]，挑选菌落出现较早且大的单菌落。在含有10g/L乙酸钠，葡萄糖浓度为5g/L MA培养基中[1L中含无机盐和维生素B₁与培养基A相同]摇瓶培养20h，选育到的突变株DB系列与实施例1中得到的DA19的培养结果见表2，由于突变株DB系列的耐乙酸能力进一步增强，在MA培养基中生长的菌体浓度比DA19高，以消耗的葡萄糖为基准的菌体得率Y_X/G也增加。

                         表2

菌株名称         DA19    DB1    DB7    DB8    DB15    DB18

细胞浓度/(g/L)   0.330   0.449  0.440  0.494  0.503   0.465

Y_X/G^a/(g/g)     0.124   0.131  0.136  0.142  0.152   0.151

                       实施例3

将如实施例1所述方法培养的DH5α和DA19一级种子分别转接1mL于两个500mL锥形瓶里100mL YPS培养基中，相同条件培养10h作为发酵罐培养的二级种子。将二级种子分别接种于5L发酵罐的M培养基[1L中含葡萄糖的量见表3，无机盐及维生素B₁的含量与实施例1中的培养基A相同]，接种后体积3.2L，30℃，搅拌转速和通气量根据溶解氧的变化进行调整，以保证培养的过程中溶解氧在20％以上，控制pH6.9～7.0，以考察在基本培养基中的生长和乙酸生成情况，培养结果见表3，其中Y_X/G是以消耗的葡萄糖为基准的菌体得率，Y_A/X是单位菌体的产乙酸得率。由表3可知，在基本培养基中，DA19的生长大大改善，Y_X/G大大高于出发菌DH5α，可以达到较高的菌体浓度。

                         表3

初始葡                  DH5α                                                                      DA19

萄糖浓    菌浓¹  乙酸¹    Y_A/X^1，2   Y_X/G¹   菌浓¹  乙酸¹     Y_A/X^1，2   Y_X/G¹

度/       (g/L)   /(mmol/)  /(mmol     /(g/g)   /(g/L)  /(mmol/L)   /(mmol/L   (g/g)

g/L)              L)        /g)                                     g)

2³       0.454    3.65     8.04       0.203    0.890    1.89       2.63       0.404

10³      0.468    3.74     8.52       0.050    1.97     19.5       9.89       0.192

10^4，5    -        -        -          -        4.14     4.84       1.17       0.404

102^4，5   -        -        -          -        26.2     93.2       3.56       0.2571.为峰值；2.为乙酸浓度最大时单位菌体产乙酸得率；3.用2mol/LNaOH调节pH；4.用1mol/L NH₃·H₂O调节pH；5.1L培养基中加入0.5mL微量元素混合溶液[1L微量元素混合溶液含FeSO₄·7H₂O 40g，MnSO₄·nH₂O 10g，AlCl₃·6H₂O 10g，CoCl₂ 4g，ZnSO₄·7H₂O 2g，Na₂MoO₄·2H₂O 2g，CuCl₂·2H₂O 1g，H₃BO₄ 0.5g]。

                       实施例4

将带有phoA启动子调控表皮生长因子(EGF)基因表达的质粒转入出发菌DH5α和突变菌DA19、DB15中，如实施例1所述的条件培养的二级种子1ml分别接入250ml摇瓶里30ml YPS10G培养基[1L YPS培养基含葡萄糖10g]中，30℃，250r/min摇床培养，12000rpm离心10min，用电泳方法检测上清液中EGF的含量，考马斯亮兰染色，结果见表4，由表4可知，耐乙酸突变株DA19和DB15表达的EFG水平和单位菌体表达的EGF(Y_EGF/X)均高于DH5α，表明耐乙酸突变株表达EGF效率提高。

                       表4

Strains        DH5α    DA19     DB15

EGF/(mg/L)     3.98     7.54     5.72

Y_EGF/X/(mg/g)  4.04     6.22     5.68DH5α的耐乙酸突变株系列生长改善、耐乙酸能力增强、菌体得率提高，同时在培养过程中乙酸产生减少，易实现高密度培养，用于表达外源基因效率提高。根据本发明公开的突变菌及实施例，有关技术人员可以方便地选育DH5α的耐乙酸突变菌株，应用于高密发酵和外源基因产物的生产中。