家蚕丝素固定化细胞生产L－天门冬氨酸的工艺

摘要

本发明属于生物工程制药技术领域的生产工艺，特指家蚕丝素固定化细胞生产L－天门冬氨酸的工艺。其使用丝素凝胶固定化大肠杆菌生产氨基酸，克服了上述丝素凝胶固定化酶存在的固定化以后酶的总活力回收率低，工业化成本很高；固定化细胞的载体生物包容性差，工业化的成本偏高的不足，大大延长固定化细胞的使用寿命。而本发明采用的原料为废蚕丝，是丝绸工业的废料，属废物利用，故原料成本低，而且综合效益高。

说明书

所属技术领域

本发明属于生物工程制药技术领域的生产工艺，特指家蚕丝素固定化细胞生产L-天门冬氨酸的工艺。

背景技术

现有关丝素凝胶固定化酶的研究方面，主要有朱祥瑞等人用家蚕丝素来固定化酶取得了很好的效果，分别用丝素固定了葡萄糖异构酶(朱祥瑞等 家蚕丝素固定化葡萄糖异构酶的研究 蚕业科学2002，28(3)238-241)和过氧化氢酶(朱祥瑞等 家蚕丝素固定化过氧化氢酶的制备及其理化特性的研究 农业生物技术学报  1999  7(3))，但是由于使用的某些交联剂(如戊二醛等)，对酶产生一定变性作用，使得固定化以后酶的总活力回收率仅为8.75-41.4％，造成大量的高纯度酶浪费，而且由于分离和纯化酶的成本高，使得固定酶的工业生产成本偏高，而且由于酶在人工生理环镜中比在细胞中容易失活，因而固定化酶的使用寿命一般不超过10天，造成了工业化成本很高。

现有关固定化细胞的研究方面，主要有牛红星等用固定化细胞作为催化剂生产了胞嘧啶核苷二磷酸胆碱(牛红星等 用固定化啤酒酵母细胞合成胞嘧啶核苷二磷酸胆碱 华东理工大学学报 2002，28(4)，372-375)，沈立新等固定化细胞催化合成谷胱甘肽(沈立新等固定化E.coli BL21(PTrc-gsh)细胞催化合成谷胱甘肽 华东理工大学学报 2002，28(1)，24-27)，由于都采用的载体是卡拉胶、明胶等凝胶物质，来源和成本都受到一定的限制，而且由于卡拉胶、明胶等的生物相容性稍差一些，使得固定化细胞的使用寿命一般不超过72小时，因而工业化的成本也偏高。

发明内容

为克服上述丝素凝胶固定化酶存在的固定化以后酶的总活力回收率低，工业化成本很高；固定化细胞的载体生物包容性差，工业化的成本偏高的不足，本发明采用废蚕丝为原料，使用丝素凝胶固定化大肠杆菌生产氨基酸，提出一种家蚕丝素固定化细胞生产L-天门冬氨酸的工艺。

实现上述目的的技术方案为：

①废蚕丝的净化与脱胶处理：称取一定量蚕丝下脚料，Na₂CO₃溶液煮沸脱胶，洗净，得到丝素纤维。

②丝素的溶解、脱盐：将丝素纤维用CaCl₂溶解丝素纤维，于流水中透析，得到无色透明丝素溶液，浓缩至浓度为20-30％备用。

③用低浓度环氧化合物(分子量1000-8000)在催化剂作用下处理丝素溶液。环氧化合物与丝素的交联反应，主要是和丝素蛋白上的-OH，-COOH，-NH₂等活性基团反应。环氧化合物起交联剂和增加强度的作用。

④大肠杆菌的培养，采用的斜面培养基为固体肉汤培养基，按常规方法培养。离心收集菌体(含多量的天门冬氨酶)，备用。

⑤丝素凝胶固定化细胞的制备：将收集好的菌体悬浮于生理盐水中，于40-50℃水浴中保温，备用。将制备好的交联丝素溶液，然后冷却至40-50℃。在40-50℃水浴中，将两者混匀后放入灭过菌的容器中形成液层，于0-4℃冰箱中冷却固化成凝胶，取出后置于磷酸缓冲液中，于0-4℃冰箱中搅拌后用KCl溶液洗涤后切成立方小块备用。

⑥固定化大肠杆菌生物反应器的制备：将填充柱式生物反应器安装于37℃的恒温生化培养箱中，将准备好的固定化大肠杆菌细胞凝胶块装填于反应器内，即成为固定化活细胞生物反应器，可用于把延胡索酸转化成L-天门冬氨酸。

⑦转化反应：先将延胡索酸铵与MgCl₂的混和液，过滤后加热，配制底物溶液放置于恒温生化培养箱中。调节流速使底物以一定的流速连续流过固定化大肠杆菌生物反应器，可控制转化率达到最大90％以上。

⑧采用常规方法进行L-天门冬氨酸的分离与纯化。

本发明的有益效果：

1.原料为废蚕丝(丝稠工业的下脚料)，纯属是废物利用，和用其它材料做成的固定化细胞的载体相比，丝素的生产成本更低，而且有利于环境保护。

2.蚕丝为天然的蛋白纤维，生物相容性好，对保持生物细胞的活性十分有利，丝素固定化细胞的使用寿命一般在7天以上。

3.由于节省了酶的提取分离和纯化过程，和固定化酶相比，从而节省了由于酶的提取分离和纯化的而产生的大量成本。

具体实施方式

①称取一定量蚕丝下脚料，Na₂CO₃溶液煮沸脱胶两次，脱胶后用蒸馏水洗净，得到丝素纤维。剪成小段备用。

②将丝素纤维用CaCl₂溶解丝素纤维，煮沸10分钟使丝素纤维全部溶解，冷却后于流水中透析，得到无色透明丝素溶液，浓缩至浓度为20-30％备用。

③用1％的环氧化合物(分子量5000)在催化剂作用下处理丝素溶液，处理8小时以上(可过夜)，即可反应完全。培养大肠杆菌的斜面培养基为固体肉汤培养基，将其接种到摇瓶培养基培养，37℃振荡培养24小时，培养完毕后用盐酸调PH至5.0，于40℃水浴中保温1小时。冷却至室温后用高速离心机离心收集菌体(含多量的天门冬氨酶)，备用。    

④将收集好的菌体悬浮于1L生理盐水中，于40℃水浴中保温，备用。将制备好的交联丝素溶液，然后冷却至40℃。同样置于40℃水浴中，将两者混匀后放入灭过菌的铝饭盒中使成2cM厚的液层，于4℃冰箱中冷却固化成凝胶，取出后置于10L磷酸缓冲液中，置于4℃冰箱中搅拌，取出后用KCl溶液充分洗涤后切成2-3mm的立方小块备用。

⑤将规格为Φ20cm×60cm的填充柱式生物反应器安装于37℃的恒温生化培养箱中，将准备好的固定化大肠杆菌细胞凝胶块装填于反应器内，即成为固定化活细胞生物反应器，可用于把延胡索酸转化成L-天门冬氨酸。

⑥先将延胡索酸铵与MgCl₂的混和液，过滤后加热至37℃，配制底物溶液，放置于恒温生化培养箱中。调节流速使底物以一定的流速连续流过固定化大肠杆菌生物反应器，进行转化反应。

⑦L-天门冬氨酸的粗分离

a.L-天门冬氨酸的粗分离

转化液过滤后用盐酸调PH至2.8，放置4℃冰箱结晶过夜，用少量冷水洗涤结晶，抽干后于105℃烘干3小时，得到L-天门冬氨酸的粗品。

b.L-天门冬氨酸的精制

L-天门冬氨酸的粗品用PH5.0的稀氨水溶解成20％的溶液，加1％的活性炭，70℃搅拌脱色2小时，滤除活性炭，滤液用盐酸调PH至2.8，放置4℃冰箱结晶过夜，滤取结晶。少量冷水洗涤，滤干后，70℃真空干燥得精品L-天门冬氨酸。

将实施例产物进行L-天门冬氨酸的含量测定如下：

精确称取干燥样品130mg，移至125mL的小三角瓶中，以甲酸6ml，冰醋酸50ml的混合液溶解，采用电位滴定法，以0.1mol/L的高氯酸滴定至终点，滴定结果以空白试验校正即可。1mL 0.1mol/L溶液相当于13.3mg的L-天门冬氨酸。

其中转化率及转化效率的计算方法如下：转化率＝(产品L-天冬氨酸的摩尔数/消耗底物延胡索酸铵的摩尔数)×100％转化效率的计算：单位时间内产品L-天冬氨酸的质量(g)/时间(hour)

得到结果为：转化率：92.7％，  转化效率：8.68g/小时。