恶性疟原虫抗原多肽SE36、其纯化方法、以及使用通过纯化得到的抗原的疫苗和诊断试剂

摘要

本发明提供来自恶性疟原虫处于红细胞内时期的呈酸性的SERA(serine－repeat antigen)的N末端结构域(47kd)的多肽SE36、其纯化方法、以及以该纯化方法得到的纯化抗原作为有效成分的疟疾疫苗和诊断剂。SE36是通过缺失47kd中的丝氨酸重复区域的聚合丝氨酸的全部或一部分，可在大肠杆菌中生产、高度纯化的多肽，与SE36特异结合的人IgG3抗体可非常有效地防止红细胞中疟原虫的增殖，其结果可以抑制发热、抑制脑性疟疾、和防止致死。

说明书

                         技术领域

本发明涉及到恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的SERA(丝氨酸重复抗原，serine-repeat antigen)的抗原多肽、以及其纯化方法和使用通过纯化得到的纯化抗原的疟疾疫苗和诊断试剂。

                         背景技术

疟疾是由一种或一种以上疟原虫(Plasmodium)感染引起的，已知疟原虫分为四种：恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、三日疟原虫(P.malariae)和卵形疟原虫(P.ovale)。上述的疟原虫通过按蚊属(Anopheles)雌蚊的叮咬，从蚊子的唾液腺以子孢子的状态侵入人体，进行感染。疟原虫的生活周期概述如下：[蚊]通过疟原虫的有性增殖形成子孢子→<叮咬>→[人]子孢子<进入血液>→<侵入肝细胞内>→[红细胞外阶段]在肝细胞中的子孢子→裂殖体→裂殖子的形成和由于

            肝细胞的破裂释放到血液中→<裂殖子侵入红细胞内>→[红细胞内阶段]裂殖子→继代(ring)→滋养体→裂殖体的无性增殖

            →裂殖子形成和由于红细胞破裂释放到血液中的反复

            循环→<疟疾发作>；或

            裂殖子→分化为雌雄的配子母细胞→<吸血>→[蚊]雌雄的配子母细胞→有性生殖→分化为动合子→分化为卵母细胞并增殖→子孢子的形成，并向唾液腺移动。

另外有关本发明涉及到的上述疟原虫(Pf)的抗原已经报道了以下给出的总计约40多种的各种各样的抗原：例如在上述生活环境的红细胞内期(intra-erythrocytic stage)存在着SERA(丝氨酸重复抗原，serine-repeat antigen；别名，SERP：富丝氨酸蛋白serine-richprotein)/HRP-2(富组氨酸蛋白-2，histidine-rich protein-2)等；在裂殖子期存在MSP-1(裂殖子表面抗原-1，merozoit surfaceantigen-1)、MSP-2(裂殖子表面抗原-2，merozoit surface antigen-2)、AMA-1(顶膜抗原-1，apical membrane antigen-1)等，在子孢子期(sporozoite)-红细胞外阶段(exo-erythrocytic stage)存在SSP-2(子孢子表面抗原-1，sporozoite surface antigen-1)、LSA-3(肝特异性抗原-3，livet-specific antigen-3)等；另外在有性增殖期(sexual stage)存在Pfs230，Pfs45/48等(《Topley和Wilson微生物学和微生物感染》，第9版，第5卷，寄生虫学，p.383，L.Collier等人著，Arnold公司1998年发行)。另外虽然投入精力对将这些抗原单独、混合、或以基因DNA形式使用的疫苗进行了开发，但可实用化的疫苗还没有出现(《Jordan报告2000》，pp.141-142，美国国立卫生研究院2000年发行)。

另外，作为使用本发明涉及到的上述SERA(或SERP)和其基因制造疟疾疫苗的以往技术已知有欧洲专利第283,882号(SERP的140kd抗原基因的第1882-1917号碱基，第2403-2602号碱基，以及第2602-2631号碱基编码的亲水性抗原表位)、美国专利第5,395,614号(SERP抗原表位和HRP-2的融合蛋白)、美国专利第6,024,966号(用A和B二种探针鉴定的基因编码的SERA抗原多肽)、以及来自于SERA的47kd的SE47’的表达系统和在该系统中进行SE47’抗原生产的报道(Vaccine，14，pp.1069-1076，1996)等，但这些疫苗抗原的免疫原性和纯度还不理想，而且纯化工程还不能产业化。另外有关其安全性、有效性或均一性的保证也不清楚，为了解决这些问题需要不断地进行创新和进步。为此疫苗等的实用化还不能很快实现。

SERA(serine-repeat antigen)是分子量为115kd的蛋白质抗原，它是由红细胞内阶段的Pf基因表达的总计989个氨基酸构成的，其结构按照从N端到C端方向的顺序依次由47kd-50kd-18kd三个结构域组成。作为这些结构域的前体的SERA是通过分散在由总计5868个碱基构成的SERA基因DNA上的4个外显子表达后，在红细胞内阶段的裂殖子释放时被加工，分裂成上述3个结构域(Molecular and BiochemicalParasitology，86，pp.249-254，1997；和Experimental Parasitology，85，pp.121-134，1997)。而SERA基因DNA和基因编码的氨基酸序列的全长资料已在GenBank公开，可以获得(Accession Number：J04000；http：//www.ncbl.nlm.nih.gov/)。另外SERA的N末端区域(以下表示为「47kd结构域」)由总计382个氨基酸组成，根据与该序列相关的Pf株之间的同源性检索，在氨基酸的缺失或附加区域的约20个地方可看到氨基酸变异(非同义置换)等分布，呈现多样性(Molecular andBiochemical Parasitology，同前；以及Experimental Parasitology，同前)。

疟疾在世界上是仅次于急性下呼吸道感染症、爱滋病、以及痢疾的多发感染疾病，根据WHO(世界卫生组织World Health Organization)的推算，1999年患病者约4,500万例，其中约110万人死亡(世界卫生组织2000，p.164，以及170，WHO2000年发行)。这样高的死亡率主要是严重的恶性疟疾、所谓的脑性疟疾导致的，其主要原因在于随着Pf增殖导致的红细胞破裂的碎片在脑血管中滞留引起的脑血栓，经历感觉迟钝麻木、说胡话、行动异常、痉挛等过程直至死亡，避免这样的脑性疟疾即使称之为最重要的课题也不过分。

作为疟疾多发的理由人们会提到对奎宁(quinine)，氯喹(chloroquine)，磺胺多辛乙胺嘧啶(pyrimethamine-sulfadoxine)，甲氟喹(mefloquine)，卤泛群(halofantrine)等的抗疟疾药的耐药性或耐多种药性的疟原虫的出现和蔓延。1950年代末自报道在南美和东南亚地区出现氯喹抗性Pf以来，有关的抗性疟原虫现在广泛分布于除了中美洲、加勒比海以及中近东的一部分地区以外的热带～亚热带的疟疾发生诸国的几乎所有区域，作为非常手段不得已建议散布DDT，控制疟疾传染已经成了国际交往日益频繁的目前行政保健上的全球性课题(WHO疟疾专家委员会：技术报告系列，No.892，pp.1-71，WHO2000年发行)。

另外，随着地球变暖导致疟疾发生地域扩大作为将来的课题已经令人担心(Science，289，1763-1766，2000)，现在对于疟疾的对策已经成了全人类急迫的课题了。

特别是有关疟疾疫苗的开发，到目前为止尽管世界各国投入了很大的努力和精力，但还没有达到作成有效疫苗的程度，作为其主要原因提出了以下(a)～(c)的课题：(a)疟疾抗原由于就像上面所说的那样是多种多样的，所以对来自这些抗原的防御感染抗原的特定是困难而且不明确的；(b)疟疾抗原是基因多型的，从Pf原虫株开始彼此抗原性都不相同。因此来自Pf的单一抗原，例如MSP-1和AMA-1等众所周知的疫苗候选抗原抗原性谱窄，无论预防什么样的Pf株的感染都未必有效；以及(c)对于上述MSP-1和AMA-1等疫苗候选抗原就像已知的那样，在纯化过程中变性、空间结构或抗原表位被破坏，其抗原性有时降低甚至消失。

                        发明的公开

本发明通过提供来自恶性疟原虫Pf的SERA(丝氨酸重复抗原，serine-repeat antigen)的蛋白质抗原(多肽SE36)和编码该抗原的合成多核苷酸、多肽SE36的纯化方法以及使用通过纯化得到的纯化抗原作为有效成分的疟疾疫苗和诊断试剂，解决上述课题。

另外应当特别指出，本发明是根据对应于上述(a)～(c)的课题的如下发现和认识提出的：(a)针对本发明SE36抗原的IgG3抗体效价几乎与疟疾流行地域的居民的疟疾获得性免疫几乎完全相关的令人惊发现，以及这些居民血清中上述IgG3抗体阻止红细胞内Pf增殖的认识(通过阻止Pf增殖抑制由疟疾引起的发热和红细胞破坏，进而可以防止由脑性疟疾引起的死亡)；(b)该SE36抗原性谱宽、起着SERA 47kd结构域中所看到的基因多型的代表性类型的FCR3、Honduras-1以及Kl三株(Molecular and Biochemical Parasitology，同前)共同抗原的作用，上述IgG3抗体通过中和反应抑制这些所有类型Pf原虫的增殖的发现；以及(c)可批量生产的SE36抗原的抗原性和抗原表位没有破坏或损伤的纯化方法的发现。

本发明根据上述那样的发现和见解提供以下(1)～(15)发明。(1)由序列4的氨基酸序列的全长构成的多肽SE36。(2)在序列4的氨基酸序列中至少含有以下一个氨基酸置换的上述(1)的多肽SE36：第19位的Gly置换为Val；第128位的Glu置换为Lys；第157位的Gly置换为Ser；第160位的Gly置换为Ser；第172位的Pro置换为Ser；第178位的Glu置换为Val；第179位的Ser置换为Asn；第180位的Leu置换为Pro；第185位的Pro置换为Ala；第186位的Asp置换为Gly；第188位的Pro置换为Thr；第189位的Thr置换为Pro；第190位的Val置换为Asp；第191位的Lys置换为Ala；第192位的Pro置换为Lys；第193位的Pro置换为Lys；第194位的Arg置换为Lys；第219位的Ile置换为Leu；第252位的Ser置换为Asn；第273位的Ala置换为Ser；第274位的Leu置换为Ile；第327位的Asn置换为Lys。(3)在序列4的氨基酸序列中第18位Gly和第19位Gly之间插入了由序列5或序列6氨基酸序列构成的寡肽的上述(1)或(2)的多肽SE36。(4)在序列4的氨基酸序列中第42位Ala和第43位Ser之间插入了由序列7或序列8氨基酸序列构成的寡肽的上述(1)或(2)的多肽SE36。(5)在序列4的氨基酸序列中第18位Gly和第19位Gly之间插入了由序列5或序列6氨基酸序列构成的寡肽，而且在序列4的氨基酸序列中第42位Ala和第43位的Ser之间插入了由序列7或序列8氨基酸序列构成的寡肽的上述(1)或(2)的多肽SE36。(6)缺失了序列4氨基酸序列中第19位Gly到第26位Gly之间氨基酸序列构成的寡肽的上述(1)至(5)中任一个多肽SE36。(7)缺失了序列4的氨基酸序列中第163位Thr到第175位Asp之间氨基酸序列构成的寡肽的上述(1)至(5)中任一个多肽SE36。(8)缺失了序列4氨基酸序列中第19位Gly到第26位Gly之间氨基酸序列构成的寡肽的，而且缺失了序列4氨基酸序列中第163位Thr到第175位Asp之间氨基酸构成的寡肽的上述(1)至(5)中任一个多肽SE36。(9)在序列4的氨基酸序列中第175位Asp到第178位Glu之间通过肽键聚合的丝氨酸残基数处于0到10范围内的上述(1)至(8)中任一个多肽SE36。(10)具有与上述(1)多肽SE36之间的交叉抗原性，而且通过氨基酸同源性检索可检测到的丝氨酸重复区的聚合丝氨酸残基数处于0到10范围内的多肽。(11)疟疾疫苗，其特征是作为有效成分含有从上述(1)至(9)的多肽SE36，以及上述(10)的多肽构成的多肽组中选出的至少一种多肽。(12)疟疾诊断剂，其特征是作为有效成分含有从上述(1)至(9)的多肽SE36，以及上述(10)的多肽构成的多肽组中选出的至少一种多肽。(13)编码上述(1)至(9)中任一种多肽SE36的合成DNA片段。(14)多肽SE36的纯化方法，其特征是从用上述(13)的合成DNA片段转化的大肠杆菌的培养液中收集菌体后，包括按照破碎菌体、利用盐析的级分、膜过滤、柱层析、疏水柱层析、利用盐析的沉淀、膜过滤、柱层析、以及透析的顺序进行纯化的各个步骤。(15)上述(14)的纯化方法，其中透析是在将多肽SE36的浓度调到10～100μg/ml后进行的。

                附图的简单说明

图1给出了Plasmodium falciparum Honduras-1株的SERA结构域47kd的第16～382位氨基酸(N～E)序列和多肽SERA全长氨基酸序列、第1～334位氨基酸(M～E)序列之间的差别。N端到C端方向是从左到右，用氨基酸的单字母表示。Hond-1代表Honduras-1株，……表示同一序列，而一一表示缺失序列，而[数字]表示SE36的氨基酸编号。

图2表示多肽SE36分子基本结构的全长氨基酸序列。N端到C端方向是从左到右，用氨基酸的单字母表示。

图3表示以图1记载的Honduras-1株47kd氨基酸序列作为基准，与其它P.falciparum株的该氨基酸序列之间的差别。[数字]表示SE36的氨基酸编号。

图4为电泳图，第1泳道为分子量标记物，第2泳道为没有表达SE36的大肠杆菌的总蛋白质，第3泳道为通过添加IPTG使SE36表达的大肠杆菌总蛋白质的电泳图。

图5为实施例2制备的SE36无菌标准样品(疫苗原液)的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。除了SE36之外没有看到杂质存在。

图6将通过用SE36免疫的黑猩猩的抗体效价按照每个IgG亚类表示的图。

图7是表示用SE36免疫的黑猩猩以及获得疟疾免疫的人IgG对疟原虫增殖的抑制图。

图8显示在疟疾高发区居民的血清对Pf原虫增殖的抑制和抗SE36IgG抗体效价之间存在正相关性。

图9表示在疟疾高发区居民的血清对Pf原虫增殖的抑制与比较对照相比，有SE36无菌标准品(疫苗原液)共存可显著抑制(中和)。图中，○表示具有天然空间结构的全长SE36蛋白质，●表示SE36蛋白质，■表示没有疫苗效果的SE50A蛋白质。

                  实施发明的最佳方案多肽SE36分子的基本结构：

本发明涉及到的多肽SE36(以下简写为「SE36」)来自于以上述的恶性疟原虫Pfd的Honduras-1株的SERA结构域47kd(以下简写为「47kd」)作为基础的SE47’抗原(Vaccine，14，pp.1069-1076，1996；以下简写为「SE47」)，由SE47’kd的丝氨酸重复区的全长或切去一部分后的基本结构组成的。SE36的基本结构和上述(来自Honduras-1株的)的47’kd之间的氨基酸序列的区别如图1所示，而SE36分子基本结构的全长氨基酸序列如图2所示。而在这些图中，氨基酸序列N端到C端方向是从左到右，氨基酸用单字母表示。在图1中，上述Honduras-1株简写为Hond-1，通过该株与其它Pf株之间同源性检索检测出的缺失区用——表示，而相同序列用……表示。在图1中，SE36的基本结构是以由构成Hond-1的47kd的总计382个氨基酸的N末端的蛋氨酸作为起点(第一个氨基酸)依次向着C端方向，将带有序号第16的氨基酸(精氨酸)的密码子置换为起始密码子(蛋氨酸)，而且紧接在第382位氨基酸(谷氨酸)后插入翻译终止密码子，然后切除占据该丝氨酸重复区的总计33个聚合丝氨酸残基(从第13到25位的丝氨酸)后的总计334个氨基酸构成的多肽。

另外，在与上述图1-2对比的「序列表」中，「序列1」表示Honduras-1的SERA结构域47kd基因DNA的全长碱基序列和该基因编码的47kd全长氨基酸序列。

「序列2」表示序列1记载的47kd全长氨基酸序列。该序列由总计382个氨基酸组成，其中第16～382位氨基酸图1与后面说的图3记载的各个Hond-1的氨基酸序列相同。

「序列3」SE36基因变换为大肠杆菌密码子后的合成DNA的全长碱基序列和它编码的全长氨基酸序列。其中第1位的氨基酸Met是上述47kd的第16位氨基酸Asn置换为起始密码子Met的形式。而碱基序列几乎都由Pf的密码子变换成了大肠杆菌的密码子。有关向大肠杆菌密码子的转换下面叙述。

「序列4」表示作为序列3记载的SE36分子基本结构的全长氨基酸序列。该序列与图1记载的SE36，以及图2记载的各个氨基酸序列相同。SE36的衍生物和变异体：

关于SE36的变异如图3所示。该图用图1记载的Honduras-1株(Hond-1)的氨基酸序列作为基准，按照与图1相同的规定附上氨基酸序号，缺失用——表示，而同一序列用……表示，与其它的Pf株(HB3、T9/96、3D7、K1、T9/102、PA/7以及Camp)的各个氨基酸序列比对，表示出这些株之间的氨基酸序列的差别。另外在图3中，上述基准(Hond-1)和其它株之间的氨基酸序列的变异或差异的地方用氨基酸的单字母符号表示。

以下根据上述图3记载的氨基酸变异的位置和区域、这些氨基酸的编号，以及序列表序列4记载的SE36基本结构的氨基酸序列，使图3和图4记载的序列对应，就SE36的衍生物或变异体的构成模式进行说明。

SE36分子的基本结构如图2(序列4)所示，是由总计334个氨基酸构成的多肽，通过对该结构进行加工、变形、修饰等，可以获得它的衍生物或派生物、修饰物、变异物等。这些物质可以通过单独利用或适当组合使用根据图3记载的氨基酸的非同义置换、寡肽的添加或缺失、以及占据丝氨酸重复(serine-repeat)区域的聚合丝氨酸残基数的限制、或47kd抗原表位(Experimental Parasitology，同前)的选择等进行制备。即根据本发明实施以下(1)-(4)是可能的。(1)可以在序列4的多肽SE36的氨基酸序列中进行从以下氨基酸置换(a)～(v)选择出的至少一种氨基酸置换。(a)第19位的Gly置换为Val；(b)第128位的Glu置换为Lys；(c)第157位的Gly置换为Ser；(d)第160位的Gly置换为Ser；(e)第172位的Pro置换为Ser；(f)第178位的Glu置换为Val；(g)第179位的Ser置换为Asn；(h)第180位的Leu置换为Pro；(i)第185位的Pro置换为Ala；(j)第186位的Asp置换为Gly；(k)第188位的Pro置换为Thr；(l)第189位的Thr置换为Pro；(m)第190位的Val置换为Asp；(n)第191位的Lys置换为Ala；(o)第192位的Pro置换为Lys；(p)第193位的Pro置换为Lys；(q)第194位的Arg置换为Lys；(r)第219位的Ile置换为Leu；(s)第252位的Ser置换为Asn；(t)第273位的Ala置换为Ser；(u)第274位的Leu置换为Ile；(v)第327位的Asn置换为Lys。(2)考虑图3记载的Pf株间相互之间氨基酸的附加或缺失，在序列4记载的SE36的氨基酸序列中可以实施下列添加或缺失联合加工(i)～(vi)：(i)在第18位Gly和第19位Gly之间插入由序列5氨基酸序列构成的寡肽。    (ii)第18位Gly和第19位Gly之间插入由序列6氨基酸序列构成的寡肽。(iii)在第42位Ala和第43位Ser之间插入由序列7氨基酸序列构成的寡肽。(iv)在第42位Ala和第43位的Ser之间插入由序列8氨基酸序列构成的寡肽。(v)缺失第19位Gly到第26位Gly之间氨基酸构成的寡肽。(vi)缺失第163位Thr到第175位Asp之间氨基酸构成的寡肽。(3)在序列4的氨基酸序列中第175位Asp到第178位Glu之间通过肽键聚合的丝氨酸残基数为0～30，优选的是0～20，最好是不要超过10的范围，即希望处于0到10范围内。有关丝氨酸残基数的限制是根据含有35个聚合丝氨酸残基数的上述SE47’纯化困难，没有达到实用化的本发明人的经验(Vaccine，前面提到)、以及丝氨酸重复区域的聚合丝氨酸残基数和SE36的物质特性之间的关系「随着聚合丝氨酸的残基数的减少，无论是SE36的水溶性或可溶性，以及抗原性或免疫原性都提高」这一惊人的发现。该现象表明聚合丝氨酸的切除会引起SE36分子的空间结构上的变化，把含有该抗原表位的亲水性区域露出来。因此根据本发明，在使SE36可溶化，对其纯化容易进行的同时，为了提供其作为抗原的功能和品质，丝氨酸重复区域的聚合丝氨酸残基数的限制是必需条件。(4)通过对上述丝氨酸残基数的限制和47kd抗原表位的有选择利用的组合可以制备具有在与SE36之间交叉的抗原性，而且通过氨基酸同源性检索检测的丝氨酸重复区域的聚合丝氨酸残基数例如处于0到10范围内的多肽。另外利用本发明，上述抗原性的交叉可以通过抗原抗体反应进行检测，丝氨酸重复区域是通过以SE36(序列4)的第157位Gly到第183位Asn的氨基酸序列作为比较基准的氨基酸同源性检索进行检测的。

换言之，序列4记载的SE36氨基酸序列只要无损于SE36原有的抗原性和免疫原性、以及它们的抗原性和免疫原性谱不被破坏，可以对其分子结构进行各种修饰、变形或加工。就是说，本发明的多肽SE36不仅包括序列4记载的SE36的基本结构，而且也包括通过(1)-(4)记载的氨基酸或寡肽的附加、切除或置换等生成的上述结构的衍生物或派生物、变异物、修饰物等所有的总称。而这样的SE36作为疫苗和诊断试剂的有效成分不仅可以个别单独使用，而且为使抗原性和免疫原性谱扩大，可以通过使上述至少两种物质混合使用。

另外应当特别提到的是，在SE36的生产中，完全不能使用编码SE36的自然界的47kd基因DNA片段本身。根据本发明SE36的产量可以通过以将编码该氨基酸序列的自然界的Pf密码子全都转变成大肠杆菌的密码子的形式合成编码全长SE36的DNA片段(以下，有时记载为SE36基因DNA)，而且克隆之后，构建其合成基因克隆的表达载体，然后导入宿主大肠杆菌，培养制成的转化体来实现。另外由于原来的Pf密码子的SE36基因DNA在大肠杆菌中的表达效率低，所以从以生产SE36为目的的可在产业上利用的观点出发通过上述合成DNA向大肠杆菌密码子变换可以提高产量。以下关于这方面内容进一步详细地进行说明。SE36基因DNA的合成和克隆：

Pf的机上的SE36基因DNA碱基序列和该序列编码的氨基酸序列可以从众所周知的基因数据库公开结构、例如DDBJ，GenBank，EMBL等通过Internet获得。

Pf密码子向大肠杆菌密码子的机上变换例如可以通过用GenBank的Coden Usage(密码子应用)数据库和发明者已报道的文献(上述的Vaccine；以及Molecular Biochemistry of Parasitology，63，265-273，1994)作为参考实施。在向大肠杆菌密码子的转变中，在将N末端的氨基酸置换为起始密码子的Met以外，应充分重视自然界中Pf原来的氨基酸序列，注意其抗原性不要由于氨基酸的非同义置换而受到破坏。

DNA的合成可以使用市售的DNA合成仪，例如DNA/RNA合成仪[AppliedBiosystem Medel 392：PE公司(美国)生产]、ASM-102U DNA合成仪[BIOSSET公司(美国)生产]等。通过这样的合成仪分别合成约100至约200核苷酸聚合的有意义链(+)和反意义链(-)的双链DNA后，各合成DNA片段可以通过例如聚丙烯酰胺凝胶纯化。然后通过纯化的单链DNA片段的互补链(对)的退火制备合成的双链DNA片段。

在合成双链DNA的克隆中可以使用已知的或市售的宿主为大肠杆菌的克隆用载体(“Cloning Vectors：A Laboratory Manual”、1-1～1-D-i-8、P.H.Pouwels等著，Elsevier 1988发行，有各种各样的介绍)，例如质粒pBluescriptII SK+和大肠杆菌XLl-Blue的组合[Stratagene公司(美国)生产]。在相关的克隆中，例如通过将上述DNA的限制酶切片段插入到用同样酶切的载体的限制酶位点，进行连接构建载体，然后将该载体导入宿主，得到作为转化体的克隆。然后双链DNA片段的各个克隆通过培养上述转化体扩增后，通过链终止法(双脱氧法dideoxy法)或Maxam-Gilbert法确定扩增的各个碱基序列。另外也可以使用市售的DNA测序仪，例如ABI PRISM 3700[PE公司(美国)生产]。根据测序结果可以选择覆盖SE36基因DNA全长的双链DNA片段的约5～10克隆。

全长SE36基因DNA的克隆通过连结上述双链DNA片段克隆进行。例如在选择上述8个克隆(对)时，通过依次将这些双链DNA片段连接可以得到全长SE36基因DNA。然后象上述那样对该全长DNA进行克隆。而在上述连接时希望在双链DNA各个片段的两端导入连接用的限制酶粘性位点。但是在导入时需要在不要使Pf本来氨基酸序列变化的情况下使作为密码子的碱基序列整合。SE36基因表达系统的构建：

在SE36基因的表达载体的制作中，可以使用已知的或市售的宿主为大肠杆菌的表达用载体(“ Cloning Vectors：A Laboratory Manual”、同前，有各种各样的介绍)，例如质粒pEt-3a和大肠杆菌BL21(DL3)pLysS、或大肠杆菌BL21(DL3)pLysE的组合[Stratagene公司(美国)生产]。该载体的制作，例如通过将从上述克隆载体切出含有全长SE36基因DNA的限制酶切片段后插入到用同样酶切的载体的限制酶位点进行连接来实施。而由pET-SE47’(Vaccine，同前)也可以制作这样的载体。此时，可以通过从pET-SE47’或它们含有的SE47’合成基因利用限制酶切除编码丝氨酸重复区域的全部区域或一部分区域象上述那样制作。然后将作成的表达载体导入宿主，得到转化体。以多肽SE36的产量作为指标从作为SE36基因表达体系产业上可利用的观点出发从该转化体选择合适的转化体。多肽SE36的生产：

SE36的生产通过培养上述大肠杆菌转化体来实施。而相关的培养系统从提高SE36的产率的观点出发可以使用例如诱导剂、IPTG(异丙基-1-硫代-β-D-半乳吡喃糖苷Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)，避免分解代谢物阻遏，改进或改善培养基组成、培养温度和时间以及除去宿主细胞内蛋白酶等，这些方面可以通过改造表达载体、变更启动子和宿主菌株来实施。多肽SE36的纯化

当SE36向细胞外分泌时，将上述转化体的除菌培养液用作提取上述SE36的起始材料。当SE36蓄积在细胞内时，例如通过离心、过滤等从培养物中收集菌体，从菌体提取上述SE36。首先作为提取的第一阶段的菌体破碎可以使用通过酶消化、利用渗透压破坏、骤然加压、减压、超声波、各种匀浆机等。然后作为使菌体破碎物分级分离的手段可以使用物理上的低速离心、超速离心、过滤、分子筛、膜浓缩等、化学上的沉淀剂、增溶剂、吸附解吸剂、分散剂等，物理化学中的电泳、柱层析、载体、透析、盐析等，这些手段可以组合使用。另外在选择上述合适手段中，可以设定合适的温度、压力、pH、离子强度等物理化学条件。

在本发明上述各种各样的手段和条件中，可以组合使用超声波处理、硫铵盐析、离心、柱层析、过滤、膜浓缩等，可以按照以下纯化过程(1)-(10)的顺序纯化SE36多肽：(1)培养菌体糊经超声波破碎和通过离心除去细胞碎片；(2)通过添加硫铵的盐析进行分级，相对于4℃水的硫酸铵(以下简写为「硫铵」)的饱和度的下限为20％和上限为50％，优选下限30％和上限35％；(3)通过使用含有如下溶剂的缓冲液使SE36多肽变成可溶，这些试剂有6M到完全饱和的尿素、最好是9M尿素、从0.2％(W/W)到5％(W/W)TWEEN80、最好是1％(W/W)TWEEN80，以及为使二硫键还原所需要的浓度充分高的2-巯基乙醇、或二硫苏糖醇、或其它还原剂；(4)使用含有6M到完全饱和的尿素、最好是9M尿素，以及为使二硫键还原所需要的浓度充分高的2-巯基乙醇、或二硫苏糖醇、或其它还原剂的缓冲液，通过Sephacryl S-300或S-200或与此相对应的分子筛柱层析按照分子量进行分级；(5)通过Octyl Sepharose疏水性柱层析进行分级和透析；(6)通过35-65％饱和硫铵，最好是45-55％饱和硫铵进行盐析；(7)通过使用含有6M到完全饱和的尿素、最好是9M尿素，以及为使二硫键还原所需要的浓度充分高的2-巯基乙醇、或二硫苏糖醇、或其它还原剂的缓冲液使SE36多肽变成可溶；(8)使用含有6M到完全饱和的尿素、最好是9M尿素，以及为使二硫键还原所需要的浓度充分高的2-巯基乙醇、或二硫苏糖醇、或其它还原剂的缓冲液，通过利用Sephacryl S-300或S-200或与此相对应的分子筛柱层析按照分子量进行分级；(9)通过Sephacryl S-300或S-200或与此相对应的分子筛柱层析按照分子量进行分级；(10)将SE36蛋白质的浓度调整到10～100μg/ml、最好是20～30μg/ml后进行透析；(11)  膜浓缩。另外疫苗制作的无菌化，例如通过0.22μM-膜过滤灭菌来实现。SE36分子和其抗原性的确认：

SE36分子的检测和大小的确认例如可以通过沉降系数的测定、分子筛、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行。而SE36分子的抗原性可以通过使用抗SERA的47kd的多克隆抗体或单克隆抗体的Western印迹分析、ELISA、凝聚反应、荧光抗体法、放射免疫分析等抗原抗体反应确认。另外SE36多肽的免疫原性以及抗SE36抗体的Pf原虫增殖抑制能力可以通过恶性疟疾患者的血清和用该多肽免疫的实验小动物、例如大鼠或小鼠等的血清等的上述抗原抗体反应、Pf裂殖子的红细胞内的增殖抑制实验(所谓中和反应)、SE36抗体携带者血中Pf数测定等确认。疫苗的制作：

首先以上述纯化的多肽SE36作为抗原，将它悬浮于溶剂，例如等渗的PBS(磷酸盐缓冲液，phosphate buffer saline)，制备疫苗原液。

另外上述疫苗抗原可以通过常用的钝化剂进行固定使空间结构稳定。作为钝化剂例如可以使用甲醛、苯酚、戊二醛、β-丙醇酸内酯等在疫苗原液制备前或制备后添加。使用甲醛时，其添加量约为0.005-0.1％(V/V)、钝化温度约为4-38℃，钝化时间约为5-180天。而为了在钝化时不损伤抗原性，需要在使钝化条件温和上下工夫。温和操作例如可以通过减少钝化剂的量、添加中性氨基酸或碱性氨基酸等、使钝化温度降低等实现。而在钝化过程中残留的游离的甲醛如有必要可以通过添加等量的亚硫酸氢钠进行中和，或通过透析除去。

另外也通过疫苗的经口或经鼻接种进行的粘膜免疫或局部免疫的诱导为目的，可以对上述SE36抗原进行加工或修饰。其中可以使用涉及到使用脂质体、乳剂、微胶囊、微球体、聚乳酸、聚乙醇酸等的DDS(药物释放系统，drug delivery system)的技术。将上述得到的制备物作为疫苗原液供以下过程使用。

将上述疫苗原液例如用上述PBS稀释，疫苗中的抗原量调整到诱导抗体产生，起到免疫的必需的量。此时可以添加作为增强疫苗耐热性的稳定剂和提高免疫原性的辅助剂的佐剂，混合后使用。例如作为稳定剂可以使用糖类或氨基酸类，而作为佐剂可以使用矿物油、植物油、明矾、铝化合物、皂土、二氧化硅、胞壁酰二肽衍生物、胸腺素、白介素等。

然后将适当量分装到例如约1-20ml容量的小药瓶，盖好并密封之后，作为疫苗供以后使用。所述的疫苗不仅可以是液体状，也可以分装后进行冷冻干燥。可以作成干燥制剂供以后使用。疫苗的检定：

有关疫苗的工程管理以及品质管理的检验根据药事法(昭和35年法律第145号)第42条第1项的规定的日本国的章程「生物学制剂标准」、WHO的建议“Requirements for Biological Substances”[WHOTechnical Report Series(TRS)，No.889，pp.105-111，1999]等进行。疟疾疫苗尚未实用化，其制剂标准还不存在，故这样的检定可以根据与此类似的疫苗有关的基准、例如上述WHO的建议“Requirements forHepatitis B Vaccines Made by Recombinant DNA Techniques”(上述TRS，No.786，1898以及No.889，1999)，“Requirements for JapaneseEncephalitis Vaccine(Inactivated)for Human Use”上述TRS，No.771，1988)等记载的安全性和有效性涉及到的各种规定进行。例如，可以根据无菌、无异常毒性、蛋白质含量、纯度、氢离子浓度、抗原确认、抗原多肽等要求或建议的各种实验规定进行检定，所有检定实验合格的生产批号作为符合规定的疟疾疫苗制剂可以供临床使用。疫苗的用法：

疫苗接种，例如将1剂约0.25～0.5ml进行皮下接种。而接种间隔约2-4周接种1-3次。但疫苗的用法并不受上述例子的限定。诊断剂的制备：

SE36多肽作为疟疾诊断用抗原，可以用作例如沉淀反应、凝集反应、中和反应、荧光抗体法、酶免疫测定法、放射免疫分析等的抗原。另外将上述多肽接种到动物例如兔子、豚鼠、小鼠的腹腔内、皮下或肌肉内，从产生抗体的这些动物的血清制备抗体。这样的抗体可以用作上述各种诊断方法中的抗原检测。另外本发明涉及到的诊断用抗原或抗体用溶剂、例如上述的PBS稀释调整到诊断剂中的含量为呈现抗原抗体反应所必需的量后，供以后使用。

                        实施例

以下通过实施例和参考例对本发明的方案和构成以及效果进行具体说明。但本发明并不受这些实施例的限定。

                        实施例1

                   SE36表达系统的构建

将通过机上由Pf密码子变换到大肠杆菌密码子的全长SE36基因DNA碱基序列分成8个片段，与合成各个片段的有义(+)链和反义(-)链的单链DNA共计16条(8对)一起退火，制备出共计8对双链DNA后，再使它们相互连接，作成全长SE36基因，构建其表达载体。另外合成DNA片段的克隆和连接的基本操作根据Sambrook等人的方法(分子克隆实验手册，第2版，冷泉实验室出版社港1989)进行。

上述单链DNA可以分别用DNA/RNA合成仪“Applied Biosystem model392”[PE公司(美国)生产]合成。这些合成的片段可以通过10％(W/V)聚丙烯酰胺(含有50mM Tris-硼酸盐、pH8.3、1mM EDTA以及8M尿素)凝胶电泳纯化。然后将20p mol的纯化片段DNA的各个+和-的互补链混合后，于缓冲液(20μl的20mM Tris-HCl、pH7.0、50mM NaCl以及2mM MgCl₂)中85℃下保温5分钟。为了对上述双链的互补区进行退火，使用ZymoreactorII[ATTO公司(日本)生产]，以5℃/5分钟比例升温至55℃，然后再以5℃/10分钟比例降温至25℃。退火结束后，添加等量的缓冲液[20mM Tris-HCl、pH7.8、10mM MgCl₂、5mMm的二硫苏糖醇(DTT)、4种核苷-5’-三磷酸(NTP)各1mM NTP以及3 units的T4 DNA聚合酶]、并混合，依次于4℃保温5分钟、25℃保温5分、再于37℃保温120分钟。这样得到的各个双链DNA片段为了用于SE36基因的构建，用限制酶KpnI和BamHI消化，用pBluescriptII SK+和大肠杆菌XLl-Blue克隆并扩增，用双脱氧法对各个克隆的上述DNA片段的碱基序列进行确定的同时，选定覆盖全长SE36基因的8个克隆。通过对这8个克隆(8对)的合成双链DNA片段进行连接制备全长SE36基因的双链DNA。另外利用考虑到不使Pf本来的氨基酸序列变化的碱基序列，将连接用的限制酶位点插入到各对DNA的两个末端。然后全长SE36基因用pBluescriptIISK+克隆后，导入大肠杆菌XLl-Blue进行扩增的同时，用双脱氧法确定其碱基序列。序列表的序列3给出了其结果。

然后将上述克隆的限制酶Ndel-BamHI片段插入到质粒pET-3aNdelBamHI的两个酶切位点，进行连接，构建SE36表达载体-pET-SE36。通过将该表达载体导入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，制作转化体大肠杆菌BL21(DE)pLysS/pET-SE37，命名为大肠杆菌BL/SE36。

                     实施例2

                 SE36的表达和纯化

将实施例1得到的大肠杆菌BL/SE36于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基[细菌胰蛋白胨1％(W/V)、细菌酵母提取物0.5％(W/V)、NaCl1％(W/V)]培养18小时，制备种子菌。然后将上述的种子菌50ml接种到5L上述新鲜的LB培养基中，于37℃下进行培养。当菌数达到1×10⁸/ml时，添加IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)，并混合，使最终浓度达到50μg/ml；然后于37℃继续培养3小时。培养结束后，通过离心(5,000rpm、10分钟)收集菌体，得到细胞糊3.2g。将该细胞糊悬浮于9.6ml冰冷的溶菌(lysis)缓冲液(50mM Tris-HCl、pH8.0和1mM EDTA)后，按照以下记载的顺序于4℃下进行以下(1)～(6)操作。(1)超声波处理

用超声波(19.5kHz、50W)进行6次每次20秒的处理，使上述细胞糊破碎后，取离心(15,000rpm，30分钟)上清，转移到20ml容量的烧杯中。(2)硫铵盐析1

在搅拌下向上述烧杯溶液内添加2.37g结晶(NH₄)₂SO₄使硫铵饱和度达到35％(W/W)，继续搅拌30分钟，进行盐析。然后离心(12,000rpm、10分钟)，弃掉上清，向沉淀中加入硫铵饱和度为30％的9ml冰冷的硫铵溶液[含有1.1M(NH₄)₂SO₄的上述裂解缓冲液]，进行悬浮。对该悬浮液进行离心(12,000rpm，10分钟)，弃掉上清后，添加8.8ml的溶解缓冲液[50mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、50mM 2-巯基乙醇、9M尿素和1％(W/V)Tween 80]，再使沉淀悬浮，回收沉淀。将该悬浮液的一半(4.4ml)于60℃下保温10分钟，再冰冷后，用0.45μm滤器[Millipore公司(美国)生产]过滤。(3)柱层析纯化I

对上述滤液通过用GF缓冲液[50mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、50mM 2-巯基乙醇和9M尿素]平衡的Sephacryl S-300(26/60)柱层析(流速0.3ml/分，4℃)分级(3.5ml/级分)后，将22-43各个级分进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，收集经电泳图像检测SE36蛋白质含量多的32-37级分。上述剩下的另一半再悬浮液(4.4ml)也进行与上述同样的操作，与上述收集的级分合并用于(4)中的操作。(4)柱层析纯化II

将上述收集级分置于室温下，于搅拌下添加每ml 0.093g(NH₄)₂SO₄、混合，使硫铵的最终浓度调整到0.7M。另外用10倍量的HIC缓冲液含有0.7M(NH₄)₂SO₄的上述GF缓冲液对13ml的亲水柱Octyl Sepharose(Pharmacia Biotech)进行平衡。将上述硫铵浓度经调整的收集级分加到平衡的柱子上，流速为0.5ml/分。然后用HIC缓冲液洗至吸光度下降后，为确认，用不含(NH₄)₂SO₄的GF缓冲液洗脱吸附成分。将该柱子未吸附级分装入透析袋中，用1L的20mM Tris-HCl(pH8.0)(含有1mM EDTA)作为外液于4℃下透析10小时。在透析期间换2次外液。(5)硫铵盐析II

透析后的透析袋再用50％饱和的0.3L(NH₄)₂SO₄(W/W)溶液[含有20mM Tris-HCl(pH8.0)和1mM EDTA]于4℃下透析10小时使蛋白质沉淀。该沉淀经离心(12,000rpm，10分钟)，以沉淀回收后悬浮于2ml的GF缓冲液中。(6)柱层析纯化III

将上述悬浮液于60℃保温10分钟后，再恢复到4℃条件下。然后用上述0.45μm滤器过滤，将滤液以0.3ml/分的流速上样到经GF缓冲液2[10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、20mM 2-巯基乙醇和8M尿素]平衡的上述S-300柱(26/60)，进行分级。象上述(3)那样对各个级分进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，选择SE36蛋白质级分，进行收集，得到该级分12ml。将该收集级分边搅拌边添加到稀释用缓冲液[10mMTris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、以及2M尿素]中，将SE36蛋白质浓度稀释到25μg/ml。用2L PBS[9mM NaHPO₄、3mM NaH₂PO₄、137mM NaCl(pH7.4)]作为外液于4℃下透析10小时。在透析期间换2次外液。然后用Centprep30对透析后内液进行浓缩，用Durapore 0.22μm滤器[Millipore公司(美国)生产]过滤灭菌，得到含有1mg/ml的SE36蛋白质的无菌标准样品10ml，作为SE36疫苗原液保存在4℃下，供以后的测定用。

通过上述标准样品的SDS聚丙烯凝胶电泳可看到除了40kd的SE36蛋白质的主带以外还有数条带(图5)。经确认这些带在Western印迹中都可与抗SE36单克隆抗体反应，据估算上述标准样品的纯度超过99％(W/W)。

另外，蛋白质浓度是以1mg＝0.491(OD₂₇₈)算出的。该值是根据在SE36分子中分别存在1个Trp、10个Tyr和9个Phe，将它们合并计算的分子消光系数ε₂₇₈＝19160/mol得出的。

                        实施例3

                   氨基酸序列的确定

实施例2得到的SE36蛋白质的N末端氨基酸序列是通过使用蛋白质测序仪Applied Biosystems 473A[PE公司(美国)生产]的Edeman降解确定的。图2和序列表中序列4给出了其结果。

                        实施例4

                抗原性和免疫原性的检定

实施例2得到的SE36疫苗原液中的SE36抗原性和免疫原性的检定按照如下(1)～(3)那样进行。(1)疫苗的制备

上述疫苗原液用PBS进行5倍倍比稀释，制备抗原量(μg/ml)分别为200、40和8的各个溶液，与Freund完全佐剂以及Freund不完全佐剂混合，进行乳化，前者用于第一次免疫，后者用于第2次和第3次免疫。(2)小鼠免疫血清的制备

使用共计20只(5只/组，共4组)7周令的雌性BALB/c小鼠[CLEA公司(日本)生产]，用上述疫苗进行免疫(0.1ml/每只鼠)，共进行3次皮下接种：初次免疫、初次免疫后第7天和第21天。

第1组小鼠用200μg抗原量、第2组40μg、第3组8μg，而第4组作为比较对照用的是PBS，它们分别与佐剂混合后对小鼠进行皮下接种(0.1ml/每只鼠)。从初次免疫开始后第30天对各个小鼠进行采血，各个小鼠的血清分别通过56℃加热30分钟进行钝化处理后，都保存在-20℃下，作为小鼠抗血清、以及对照小鼠血清分别供尔后使用。另外上述第1-3组免疫小鼠在接种疫苗后的饲养期间与比较对照第4组小鼠同样都很健康，没有看到一例异常体重减少、行为、排泄物和外观变化以及死亡，确认该疫苗是安全的。(3)Pf增殖抑制实验

使用恶性疟原虫的Honduras-1株，其培养和维持按照下列文献报道进行：Trager和Jensen的方法(Science 193 673-675，1976)，以及Banyal和Inserberg(American Journal of Tropical and MedicalHygiene，34，1055-1064，1985)。首先，当培养下的Pf寄生红细胞的80％为滋养体和裂殖体寄生的红细胞时，用新鲜的红细胞稀释该维持培养基，将该寄生红细胞数调整到总血细胞数的0.5％。然后通过用完全培养基进一步稀释，将红细胞浓度调整到2％(V/V)，制备Pf寄生红细胞培养液。将该培养液加到96孔微滴板中(100μl/孔)，与1/20量(5μl)的上述(2)的小鼠抗血清混合，于37℃下培养72小时。对于比较对照组使用上述的PBS接种的小鼠血清。培养结束后，将培养液涂到载玻片上进行Giemsa染色，对载玻片上的5000个红细胞进行镜检，对Pf寄生红细胞进行计数。Pf增殖抑制率(％)通过使用来自该计数的同一稀释血清存在下的Pf寄生红细胞的下式算出。

100×(1-小鼠抗血清下的Pf寄生红细胞数/比较对照下的Pf寄生红细胞数)其结果上述的第1组和第2组(各5只)的各个小鼠抗血清无论哪一个的上述抑制率都是90％，而第3组的5只小鼠的平均值是70％。另外小鼠抗血清和比较对照鼠抗血清在进行上述抑制实验之前分别进行如下处理：上述抗血清各0.5ml添加2ml红细胞进行混合后，于37℃下保温2小时，然后于室温进行离心(1,500rpm，5分钟)，取上清。向该上清中再加入0.5ml红细胞进行混合，象上述那样进行保温和离心，取上清，供上述抑制实验用。(4)抗原解析

在ELISA和Western印迹分析中使用Vectastain ABC试剂盒[VectorLaboratories公司(美国)生产]。在进行ELISA时作为抗原使用SE36蛋白质，而作为底物使用2，2’-偶氮-双(3-乙基苯并噻唑啉(thiaziline)-6-磺酸)。ELISA值用微板读取器“Titertek Multiskan MCC/340KMII”[Titerteck Scienfic公司(美国)生产]，用吸光度0.3进行判定。在Western印迹分析中作为底物使用二氨基联苯胺四盐酸盐。

Pf寄生红细胞是由至少有80％有成熟的滋养体和裂殖体寄生的红细胞的培养物提供的。将该寄生红细胞于75％(W/V)皂甙溶液中37℃下静置10分钟溶解后进行离心(5,000g、5分钟)，取其沉淀。然后将沉淀悬浮于PBS后，使该悬浮液与十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的样品缓冲液混合，作为疟疾细胞破碎液供Western印迹分析使用。

上述第1组～第3组(每组5只鼠)的ELISA值的平均值：第1组90,000、第2组88,000、第3组42,000，以及第4组的比较对照不足100。而上述疟疾细胞破碎液的Western印迹分析结果在120kd位置检测出与第1组～第3组的各个鼠抗血清反应的蛋白质，而与第4组各个鼠血清反应的蛋白质完全没有检测到。另外上述分析是通过对上述细胞破碎液进行12.5％(W/V)聚丙烯酰胺的SDS-PAGE电泳图转移到PVDF(聚偏氟乙烯)后，与上述第1组～第3组的鼠抗血清以及比较对照鼠血清反应进行的。

                      实施例5

              使用黑猩猩的免疫实验

将SE36蛋白质吸附于氢氧化铝凝胶制备的实验用疫苗接种到黑猩猩，就各个时间段采集的血液进行血液学方面和血液生物化学方面的检查的同时，进行该血清的免疫应答实验。(1)方法

向3只黑猩猩的背部中部接种作为实验疫苗的SE36蛋白质，1次分别为450μg(雄性，11岁)、50μg(雌性，10岁)、10μg(雄性，6岁)。实验计划是初次接种作为0周，第4周进行追加接种。在接种前、追加接种时和以后一定时间间隔进行采血。

而上述实验在获得三共化学研究所熊本灵长类公园的伦理委员会认可后在该公园进行的。(2)结果

从接种了实验疫苗的黑猩猩采集的血的血液学和血液生物化学的检查结果表明即使作为SE36蛋白质一次接种450μg非常多的蛋白质也没有看到异常现象。从该结果可以确认使SE36蛋白质吸附于氢氧化铝做成的疫苗的安全性。

另外按照每个IgG亚类测定得到血清的SE36蛋白质特异的抗体效价，结果表明如果一次接种450μg在全部亚类抗体效价都升高，特别是在第2次接种后可以提高到约10000倍。这样高的抗体效价能维持10周(图6A)。而一次接种50μg也与一次接种450μg获得同样程度的免疫应答(图6B)。如果一次接种10μg，虽然要获得免疫应答需要一定时间，但在第4周所有亚类抗体效价都上升，第2次接种后大约上升到1000倍(图6C)。从该结果可以确认本发明的疫苗作为人用疫苗使用现实的接种量有可能做到免疫应答。

另外使用一次接种得到的免疫血清对依赖于IgG的ADCI(抗体依赖性的寄生虫生长的细胞抑制，Antibody-Dependent Cellular Inhibitionof Parasite Growth)引起的疟原虫的增殖抑制进行实验。即向100μl的疟原虫培养液加入免疫血清和2×10⁴cell/ml的单核细胞，继续培养，测定48小时后的疟原虫数。对在黑猩猩的免疫血清的实验系统中，添加0.38mg/ml免疫前的总IgG级分时的疟原虫数、获得对疟疾免疫的人血清的测定系统中，添加10μg/ml的非特异IgG3级分时的疟原虫数作为对照(100％)，以比例(％)表示各个测定系统的疟原虫数。

结果如图7所示。在分别添加黑猩猩免疫前和免疫后的总IgG级分各1.5mg/ml时的增殖，添加免疫前总IgG级分时可增殖至对照的大约70％，但添加免疫后的总IgG级分只增殖到约40％。

在上述实验中，添加后的黑猩猩的总IgG级分浓度大约是黑猩猩血清中的IgG浓度的1/10，与添加免疫前的总IgG级分情形相比，添加免疫后的总IgG级分可以获得约30％良好的疟原虫增殖抑制，在生物体血液中获得大体上完全的抑制效果是有希望的。另外在人血液中的测定中可以考虑使用对SE36蛋白质特异的IgG3，认为其效果可以与对疟原虫获得免疫的人的疟原虫增殖抑制效果相比。从以上结果可以确认本发明的疫苗的有效性。

                         参考例

                      流行病学检查I

使用乌干达疟疾高流行区的10岁以下(平均6岁)的儿童血清，利用上述SE36检查针对SE36蛋白质的血中IgG3抗体的保有状况。检查结果：在不发热(体温在37.5℃以下)健康儿童31例中，8例IgG3抗体阳性，而9例发热(体温在37.5℃以上)儿童患者全是IgG3抗体阴性。由此看来在抗SE36 IgG3抗体的产生或保有者中，都没有看到疟疾发热，表明同一抗体与抑制疟疾发作有关。

                        参考例2

                     流行病学检查II

检查于同一地区采集的15岁以下儿童(86例)的血中疟原虫(Pf)数和通过ELISA测定的抗SE36 IgG3抗体效价之间的相关关系。结果表明存在着上述IgG3抗体效价越高，血中的Pf数越低的相关性。

                        参考例3

                     流行病学检查III

通过ELISA检查针对疟疾高流行区居民年龄段(0-40岁以上)的对SE36蛋白质的血中IgG3抗体效价的保有状况。结果抗SE36 IgG3抗体效价与全年龄段中其他的IgG1、IgG2和IgG4的各个抗体效价都为低值相比，0到8岁通常高出2倍以上，而超过8岁，随着年龄增加呈对数曲线上升。

                        参考例4

                  恶性疟原虫的增殖抑制实验

通过ELISA检查针对疟疾高流行区居民(成年人)25名的与SE36蛋白质反应的血中IgG3抗体的保有状况，使用同一血清进行试管内恶性疟原虫的增殖抑制实验。将相当于培养液量5％量的各个血清加到FCR3株、Honduras-1株和Kl株中，以没有疟疾免疫力的日本人的血清作对照调查24小时后疟原虫增殖的抑制能力。结果无论在哪一株内抗SE36 IgG3抗体效价和增殖抑制能力均表现出正相关性，表明SE36蛋白质提供了疟原虫增殖抑制作用的人抗体的抗原表位。另外也表明SERA的基因多型没有影响疫苗效果(图8)。

                        参考例5

                     SE36的中和能力

通过参考例4记载的试管内恶性疟原虫的增殖抑制实验对在实施例2得到的SE36无菌标准样品共存下参考例4使用的疟疾高流行区居民抗SE36 IgG3抗体效价高的代表血清对Pf增殖抑制能力的高低进行测定。作为与SE36的比较对照分别使用由杆状病毒载体产生的具有自然空间结构的全长SERA蛋白质以及来自全长SERA蛋白质中央部位结构域的SE50A蛋白质(没有疫苗效果)(Vaccine，同前)。

结果疟疾高流行区居民血清的Pf增殖抑制能力随着共存SE36浓度的上升抑制(中和)最强，而SE50A完全没有抑制作用。根据上述抑制程度SE36的中和能力比全长SERA蛋白质的中和能力强(图9)。

工业实用性

本发明提供诱导IgG3抗体的非常有效的预防疟疾的疫苗，该IgG3抗体抑制作为伴随发热的疟疾症状和成为死亡原因的脑性疟疾的根本原因的红细胞内的疟原虫(Pf)增殖。同时提供疟疾诊断剂。结果一扫由于上述Pf增殖引起死亡的脑性疟疾的原因和疟疾带来的恐怖。因此本发明除对作为抑制世界上有数的多发感染症的疟疾的强有力手段有贡献外，在人们担心随着地球变暖疟疾发生地域扩大的今天，不仅有望确保人类的保健，而且有望确保与观光、经济、政治等有关的全球性的而且健全的活动，由此带来极大效果和福音。

                              序列表<110>财团法人阪大微生物病研究会<120>恶性疟原虫抗原多肽SE36、其纯化方法、以及使用通过纯化得到的抗原的疫苗和诊断试剂<130>01-F-051PCT<140>PCT/JP02/00506<141>2002-01-24<150>JP2001-57458<151>2001-01-24<160>8<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1146<212>DNA<213>恶性疟原虫Plasmodium falciparum<220><221>CDS<222>(1)..(1146)<300><301>Li，W.B.等.<302>Structure and expression of Plasmodium falciparum Plasmodium falciparumSERA gene<303>Mol.Biochem.Parasitol.<304>33<305>1<306>13-25<307>1989<309>GenBank/J04000<309>1994-03-15<400>1atg aag tca tat att tcc ttg ttt ttc ata ttg tgt gtt ata ttt aac   48Met Lys Ser Tyr Ile Ser Leu Phe Phe Ile Leu Cys Val Ile Phe Asn  1               5                  10                  15aaa aat gtt ata aaa tgt aca gga gaa agt caa aca ggt aat aca gga   96Lys Asn Val Ile Lys Cys Thr Gly Glu Ser Gln Thr Gly Asn Thr Gly

         20                  25                  30gga ggt caa gca ggt aat aca gta gga gat caa gca ggt agt aca gga   144Gly Gly Gln Ala Gly Asn Thr Val Gly Asp Gln Ala Gly Ser Thr Gly

     35                  40                  45gga agt cca caa ggt agt acg gga gca agt caa ccc gga agt tcc gaa   192Gly Ser Pro Gln Gly Ser Thr Gly Ala Ser Gln Pro Gly Ser Ser Glu

 50                  55                  60cca agc aat cct gta agt tcc gga cat tct gta agt act gta tca gta   240Pro Ser Asn Pro Val Ser Ser Gly His Ser Val Ser Thr Val Ser Val 65                  70                  75                  80tca caa act tca act tct tca gaa aaa cag gat aca att caa gta aaa   288Ser Gln Thr Ser Thr Ser Ser Glu Lys Gln Asp Thr Ile Gln Val Lys

             85                  90                  95tca gct tta tta aaa gat tat atg ggt tta aaa gtt act ggt cca tgt   336Ser Ala Leu Leu Lys Asp Tyr Met Gly Leu Lys Val Thr Gly Pro Cys

        100                 105                 110aac gaa aat ttc ata atg ttc tta gtt cct cat ata tat att gat gtt   384Asn Glu Asn Phe Ile Met Phe Leu Val Pro His Ile Tyr Ile Asp Val

    115                 120                 125gat aca gaa gat act aat atc gaa tta aga aca aca ttg aaa gaa aca   432Asp Thr Glu Asp Thr Asn Ile Glu Leu Arg Thr Thr Leu Lys Glu Thr

130                 135                 140aat aat gca ata tca ttt gaa tca aac agt ggt tca tta gaa aaa aaa   480Asn Asn Ala Ile Ser Phe Glu Ser Asn Ser Gly Ser Leu Glu Lys Lys145                 150                 155                 160aaa tat gta aaa cta cca tca aat ggt aca act ggt gaa caa ggt tca   528Lys Tyr Val Lys Leu Pro Ser Asn Gly Thr Thr Gly Glu Gln Gly Ser

            165                 170                 175agt acg gga aca gtt aga gga gat aca gaa cca att tca gat tca agc   576Ser Thr Gly Thr Val Arg Gly Asp Thr Glu Pro Ile Ser Asp Ser Ser

        180                 185                 190tca agt tca agt tca agt tct agt tea agt tca agt tca agt tct agt   624Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser

    195                 200                 205tca agt tca agt tca agt tca agt tct agt tca agt tct agt tca agt   672Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser

210                 215                 220tca gaa agt ctt cct gct aat gga cct gat tcc cct act gtt aaa ccg   720Ser Glu Ser Leu Pro Ala Asn Gly Pro Asp Ser Pro Thr Val Lys Pro225                 230                 235                 240cca aga aat tta caa aat ata tgt gaa act gga aaa aac ttc aag ttg   768Pro Arg Asn Leu Gln Asn Ile Cys Glu Thr Gly Lys Asn Phe Lys Leu

            245                 250                 255gta gta tat att aag gag aat aca tta ata att aaa tgg aaa gta tac   816Val Val Tyr Ile Lys Glu Asn Thr Leu Ile Ile Lys Trp Lys Val Tyr

        260                 265                 270gga gaa aca aaa gat act act gaa aat aac aaa gtt gat gta aga aag   864Gly Glu Thr Lys Asp Thr Thr Glu Asn Asn Lys Val Asp Val Arg Lys

    275                 280                 285tat ttg ata aat gaa aag gaa acc cca ttt act agt ata cta ata cat   912Tyr Leu Ile Asn Glu Lys Glu Thr Pro Phe Thr Ser Ile Leu Ile His

290                 295                 300gcg tat aaa gaa cat aat gga aca aac tta ata gaa agt aaa aac tac   960Ala Tyr Lys Glu His Asn Gly Thr Asn Leu Ile Glu Ser Lys Asn Tyr305                 310                 315                 320gca tta gga tca gac att cca gaa aaa tgt gat acc tta gct tcc aat   1008Ala Leu Gly Ser Asp Ile Pro Glu Lys Cys Asp Thr Leu Ala Ser Asn

            325                 330                 335tgc ttt tta agt ggt aat ttt aac att gaa aaa tgc ttt caa tgt gct   1056Cys Phe Leu Ser Gly Asn Phe Asn Ile Glu Lys Cys Phe Gln Cys Ala

        340                 345                 350ctt tta gta gaa aaa gaa aat aaa aat gac gta tgt tac aaa tac cta   1104Leu Leu Val Glu Lys Glu Asn Lys Asn Asp Val Cys Tyr Lys Tyr Leu

    355                 360                 365tct gaa gat att gta agt aac ttc aaa gaa ata aaa gct gag           1146Ser Glu Asp Ile Val Ser Asn Phe Lys Glu Ile Lys Ala Glu

370                 375                 380<210>2<211>382<212>PRT<213>恶性疟原虫Plasmodium falciparum<400>2Met Lys Ser Tyr Ile Ser Leu Phe Phe Ile Leu Cys Val Ile Phe Asn  1               5                  10                  15Lys Asn Val Ile Lys Cys Thr Gly Glu Ser Gln Thr Gly Asn Thr Gly

         20                  25                  30Gly Gly Gln Ala Gly Asn Thr Val Gly Asp Gln Ala Gly Ser Thr Gly

     35                  40                  45Gly Ser Pro Gln Gly Ser Thr Gly Ala Ser Gln Pro Gly Ser Ser Glu

 50                  55                  60Pro Ser Asn Pro Val Ser Ser Gly His Ser Val Ser Thr Val Ser Val 65                  70                  75                  80Ser Gln Thr Ser Thr Ser Ser Glu Lys Gln Asp Thr Ile Gln Val Lys

             85                  90                  95Ser Ala Leu Leu Lys Asp Tyr Met Gly Leu Lys Val Thr Gly Pro Cys

        100                 105                 110Asn Glu Asn Phe Ile Met Phe Leu Val Pro His Ile Tyr Ile Asp Val

    115                 120                 125Asp Thr Glu Asp Thr Asn Ile Glu Leu Arg Thr Thr Leu Lys Glu Thr

130                 135                 140Asn Asn Ala Ile Ser Phe Glu Ser Asn Ser Gly Ser Leu Glu Lys Lys145                 150                 155                 160Lys Tyr Val Lys Leu Pro Ser Asn Gly Thr Thr Gly Glu Gln Gly Ser

            165                 170                 175Ser Thr Gly Thr Val Arg Gly Asp Thr Glu Pro Ile Ser Asp Ser Ser

        180                 185                 190Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser

    195                 200                 205Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser

210                 215                 220Ser Glu Ser Leu Pro Ala Asn Gly Pro Asp Ser Pro Thr Val Lys Pro225                 230                 235                 240Pro Arg Asn Leu Gln Asn Ile Cys Glu Thr Gly Lys Asn Phe Lys Leu

            245                 250                 255Val Val Tyr Ile Lys Glu Asn Thr Leu Ile Ile Lys Trp Lys Val Tyr

        260                 265                 270Gly Glu Thr Lys Asp Thr Thr Glu Asn Asn Lys Val Asp Val Arg Lys

    275                 280                 285Tyr Leu Ile Asn Glu Lys Glu Thr Pro Phe Thr Ser Ile Leu Ile His

290                 295                 300Ala Tyr Lys Glu His Asn Gly Thr Asn Leu Ile Glu Ser Lys Asn Tyr305                 310                 315                 320Ala Leu Gly Ser Asp Ile Pro Glu Lys Cys Asp Thr Leu Ala Ser Asn

            325                 330                 335Cys Phe Leu Ser Gly Asn Phe Asn Ile Glu Lys Cys Phe Gln Cys Ala

        340                 345                 350Leu Leu Val Glu Lys Glu Asn Lys Asn Asp Val Cys Tyr Lys Tyr Leu

    355                 360                 365Ser Glu Asp Ile Val Ser Asn Phe Lys Glu Ile Lys Ala Glu

370                 375                 380<210>3<211>1005<212>DNA<213>人工合成序列<220><221>CDS<222>(1)..(1002)<220><223>人工合成序列的描述：人工合成序列<400>3atg aaa aac gtg atc aaa tgt acc ggt gaa agc cag acc ggt aat acc   48Met Lys Asn Val Ile Lys Cys Thr Gly Glu Ser Gln Thr Gly Asn Thr  1               5                  10                  15ggc ggt ggt cag gca ggc aac acg gtt ggc gac cag gcg ggc tct acc   96Gly Gly Gly Gln Ala Gly Asn Thr Val Gly Asp Gln Ala Gly Ser Thr

         20                  25                  30ggc ggc tct ccg cag ggt agc aca ggc gcc agt caa ccc ggc tct agc   144Gly Gly Ser Pro Gln Gly Ser Thr Gly Ala Ser Gln Pro Gly Ser Ser

     35                  40                  45gaa ccg tct aac cca gtg tct tct ggc cat tct gtt agt acc gtt agc   192Glu Pro Ser Asn Pro Val Ser Ser Gly His Ser Val Ser Thr Val Ser

 50                  55                  60gtt agc cag acc agc acc tct tct gaa aaa caa gat acc att cag gtg   240Val Ser Gln Thr Ser Thr Ser Ser Glu Lys Gln Asp Thr Ile Gln Val 65                  70                  75                  80aaa tct gcg ctg ctg aaa gat tat atg ggt tta aaa gtt acg ggc ccg   288Lys Ser Ala Leu Leu Lys Asp Tyr Met Gly Leu Lys Val Thr Gly Pro

             85                  90                  95tgt aac gaa aat ttc atc atg ttc ctg gtt ccg cat att tat att gat   336Cys Asn Glu Asn Phe Ile Met Phe Leu Val Pro His Ile Tyr Ile Asp

        100                 105                 110gtg gat acc gaa gat acc aat ata gag ctc cgt acc acc ctg aaa gaa   384Val Asp Thr Glu Asp Thr Asn Ile Glu Leu Arg Thr Thr Leu Lys Glu

    115                 120                 125acc aac aac gcg atc tca ttt gaa tca aac agt ggt tca ctg gaa aaa   432Thr Asn Asn Ala Ile Ser Phe Glu Ser Asn Ser Gly Ser Leu Glu Lys

130                 135                 140aaa aaa tat gtg aag ctt ccg tca aac ggc acc acc ggt gaa cag ggt   480Lys Lys Tyr Val Lys Leu Pro Ser Asn Gly Thr Thr Gly Glu Gln Gly145                 150                 155                 160tca agt aca ggc acc gtt cgc ggc gat acc gaa ccg att tca gac tcg   528Ser Ser Thr Gly Thr Val Arg Gly Asp Thr Glu Pro Ile Ser Asp Ser

            165                 170                 175agt gaa agt ctt ccg gcg aat ggc ccg gat tcc ccg acc gtt aaa ccc   576Ser Glu Ser Leu Pro Ala Asn Gly Pro Asp Ser Pro Thr Val Lys Pro

        180                 185                 190ccg cgt aac ctg cag aac atc tgt gaa acc ggc aaa aac ttc aaa ctg   624Pro Arg Asn Leu Gln Asn Ile Cys Glu Thr Gly Lys Asn Phe Lys Leu

    195                 200                 205gtg gtg tat att aag gag aat aca tta atc att aaa tgg aaa gtg tac   672Val Val Tyr Ile Lys Glu Asn Thr Leu Ile Ile Lys Trp Lys Val Tyr

210                 215                 220ggc gaa acc aaa gat acc acc gaa aat aac aaa gtg gac gta cgc aag   720Gly Glu Thr Lys Asp Thr Thr Glu Asn Asn Lys Val Asp Val Arg Lys225                 230                 235                 240tat ctg att aac gaa aag gaa acc ccg ttt act agt att cta atc cat   768Tyr Leu Ile Asn Glu Lys Glu Thr Pro Phe Thr Ser Ile Leu Ile His

            245                 250                 255gca tat aaa gaa cat aat ggc acc aac ctg atc gaa agt aaa aac tac   816Ala Tyr Lys Glu His Asn Gly Thr Asn Leu Ile Glu Ser Lys Asn Tyr

        260                 265                 270gcg ctg ggc tca gac att ccg gaa aaa tgt gat acc ctg gcg tcc aat   864Ala Leu Gly Ser Asp Ile Pro Glu Lys Cys Asp Thr Leu Ala Ser Asn

    275                 280                 285tgc ttt ctg agt ggt aac ttt aac att gaa aaa tgc ttt cag tgc gcg   912Cys Phe Leu Ser Gly Asn Phe Asn Ile Glu Lys Cys Phe Gln Cys Ala

290                 295                 300ctg ctg gtg gaa aaa gaa aat aaa aac gac gtg tgt tac aaa tac cta   960Leu Leu Val Glu Lys Glu Asn Lys Asn Asp Val Cys Tyr Lys Tyr Leu305                 310                 315             320agc gaa gat att gtg tct aat ttc aag gag atc aaa gcg gag taa       1005Ser Glu Asp Ile Val Ser Asn Phe Lys Glu Ile Lys Ala Glu

            325                 330<210>4<211>334<212>PRT<213>人工合成序列<223>人工合成序列的描述：人工合成序列<400>4Met Lys Asn Val Ile Lys Cys Thr Gly Glu Ser Gln Thr Gly Asn Thr  1               5                  10                  15Gly Gly Gly Gln Ala Gly Asn Thr Val Gly Asp Gln Ala Gly Ser Thr

         20                  25                  30Gly Gly Ser Pro Gln Gly Ser Thr Gly Ala Ser Gln Pro Gly Ser Ser

     35                  40                  45Glu Pro Ser Asn Pro Val Ser Ser Gly His Ser Val Ser Thr Val Ser

 50                  55                  60Val Ser Gln Thr Ser Thr Ser Ser Glu Lys Gln Asp Thr Ile Gln Val 65                  70                  75                  80Lys Ser Ala Leu Leu Lys Asp Tyr Met Gly Leu Lys Val Thr Gly Pro

             85                  90                  95Cys Asn Glu Asn Phe Ile Met Phe Leu Val Pro His Ile Tyr Ile Asp

        100                 105                 110Val Asp Thr Glu Asp Thr Asn Ile Glu Leu Arg Thr Thr Leu Lys Glu

    115                 120                 125Thr Asn Asn Ala Ile Ser Phe Glu Ser Asn Ser Gly Ser Leu Glu Lys

130                 135                 140Lys Lys Tyr Val Lys Leu Pro Ser Asn Gly Thr Thr Gly Glu Gln Gly145                 150                 155                 160Ser Ser Thr Gly Thr Val Arg Gly Asp Thr Glu Pro Ile Ser Asp Ser

            165                 170                 175Ser Glu Ser Leu Pro Ala Asn Gly Pro Asp Ser Pro Thr Val Lys Pro

        180                 185                 190Pro Arg Asn Leu Gln Asn Ile Cys Glu Thr Gly Lys Asn Phe Lys Leu

    195                 200                 205Val Val Tyr Ile Lys Glu Asn Thr Leu Ile Ile Lys Trp Lys Val Tyr

210                 215                 220Gly Glu Thr Lys Asp Thr Thr Glu Asn Asn Lys Val Asp Val Arg Lys225                 230                 235                 240Tyr Leu Ile Asn Glu Lys Glu Thr Pro Phe Thr Ser Ile Leu Ile His

            245                 250                 255Ala Tyr Lys Glu His Asn Gly Thr Asn Leu Ile Glu Ser Lys Asn Tyr

        260                 265                 270Ala Leu Gly Ser Asp Ile Pro Glu Lys Cys Asp Thr Leu Ala Ser Asn

    275                 280                 285Cys Phe Leu Ser Gly Asn Phe Asn Ile Glu Lys Cys Phe Gln Cys Ala

290                 295                 300Leu Leu Val Glu Lys Glu Asn Lys Asn Asp Val Cys Tyr Lys Tyr Leu305                 310                 315                 320Ser Glu Asp Ile Val Ser Asn Phe Lys Glu Ile Lys Ala Glu

            325                 330<210>5<211>8<212>PRT<213>人工合成序列<223>人工合成序列的描述：人工合成序列<400>5Gly Gln Ala Gly Asn Thr Gly Gly  1               5<210>6<21l>8<212>PRT<213>人工合成序列<223>人工合成序列的描述：人工合成序列<400>6Gly Gln Ala Gly Asn Thr Val Gly  l               5<210>7<21l>8<212>PRT<213>人工合成序列<223>人工合成序列的描述：人工合成序列<400>7Ser Pro Gln Gly Ser Thr Gly Ala  1               5<210>8<211>16<212>PRT<213>人工合成序列<223>人工合成序列的描述：人工合成序列<400>8Ser Pro Gln Gly Ser Thr Gly Ala Ser Pro Gln Gly Ser Thr Gly Ala  1               5                  10                  15