从含有高水平叶绿素的金盏花提取物中纯化叶黄素

摘要

本发明提供了一种从可能含有高水平叶绿素的皂化金盏花提取物中获得高纯度黄体素和玉米黄素浓缩物的工业规模方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种从可能含有高水平叶绿素色素的粗金盏花提取物中纯化黄体素和玉米黄素的方法。

技术背景

类胡萝卜素包括一组在植物、一些鱼类、甲壳类、鸟类、藻类和细菌中大量存在的天然色素。在这一组色素中有黄色类胡萝卜素，包括胡罗卜素(如β-胡罗卜素)和叶黄素(如黄体素和玉米黄素(玉米黄质))，以及红色类胡萝卜素，包括辣椒红、斑螯黄素和虾青素。这些黄色和红色类胡萝卜素通常和其它种类的色素，主要包括绿色叶绿素色素，一起存在于植物尤其是有花植物中。

来自金盏花提取物的类胡萝卜素，尤其是叶黄素，在家禽产业用于给肉鸡皮肤和蛋黄着色已经有数十年。金盏花提取物中存在的黄体素的浓度远远高于玉米黄素的浓度。用于家禽产业的含有相对高浓度玉米黄素的着色配方最近已经出现在市场上，其中黄体素已经被异构化以便产生玉米黄素(Torres的美国专利5,523,494，和Rodriguez的美国专利5,973,211)。

除了类胡萝卜素在家禽产业中的商业重要性，最近关于它们在促进人类健康中的潜在角色使类胡萝卜素已经受到了科学家们相当大的关注。像α和β-胡罗卜素、黄体素和玉米黄素这样的化合物已经表现出具有很强的抗氧化活性，该活性可以阻碍或阻止像癌症、动脉硬化、白内障、黄斑退化和其它疾病(Bowen，WO98/45241)。黄体素和玉米黄素是存在于人类视网膜的黄斑部位的仅有的类胡萝卜素，而且与负责视觉敏锐度的黄斑的正常功能有关。也已经报导，类胡萝卜素增强了免疫反应。作为代谢过程的副产物而产生，和发源于环境污染物(例如二氧化氮、污染空气构成的臭氧层、重金属、卤化烃、电离辐射和香烟烟雾)的自由基被暗示为影响上述提到的许多疾病的致病因素。类胡萝卜素是能够促使一连串有害化学反应的高活性氧自由基的有力猝灭剂。类胡萝卜素也作为链断裂抗氧化剂，尤其是在低氧分压下。因此，类胡萝卜素可以猝灭诱导自由基的反应，也能阻止自由基的产生，从而限制了自由基/氧化的破坏。

从万寿菊手摘的金盏花花瓣含有一种在自然界发现的最高浓度的类胡萝卜素。工业规模栽培金盏花以及机械化收割过程已经增加了通常与花瓣一起获得的叶、茎、杂草和其它植物部分的收获量。当从这样的原材料提取粗粉时，就可以获得含有高水平叶绿素和有关化合物的油树脂。因此，黄体素和玉米黄素在这样的油树脂中的浓度比从手摘花中获得的浓度相对低一些。

具有高含量叶绿素的金盏花提取物通常是在碱性条件下皂化来完成类胡萝卜素以及叶绿素的水解。可变水平的其它脂类、叶绿酸和不可皂化物也通常存在于反应混合物中。因此，来自机械化收割的金盏花粗粉的油树脂中相对低浓度的叶黄素，以及杂质色素水平的可变性已经阻止了用于人类消费的叶黄素产物的商业发展。因此，存在对于从可能含有高水平叶绿素的大规模、机械化收割的金盏花栽培物所得粗粉中获得高纯度的黄体素和玉米黄素浓缩物的工业方法的需求。

发明概述

本发明提供了一种用可能含有高水平叶绿素的皂化金盏花提取物中获得高纯度的黄体素和玉米黄素浓缩物的工业规模方法。本发明的一个目的是生产可能用于人类使用的叶黄素浓缩物，其中黄体素和玉米黄素的水平超过了产物中总类胡萝卜素的97％。

更明确地说，本发明涉及一种从皂化提取物中纯化叶黄素的方法。该方法包括如下步骤：将皂化提取物分散在水中以形成分散体；在一定条件下混合分散体，使任何水溶性化合物的一部分溶解在水中，以形成含水相和不能溶解于水的残余物；从残余物中分离含水相；在一定条件下用非极性溶剂接触残余物，使任何脂溶性化合物的一部分溶解在非极性溶剂以及一部分叶黄素从非极性溶剂中沉淀出来，以形成沉淀物；从沉淀物中分离非极性溶剂；用极性溶剂洗涤沉淀物，使任何残余叶绿素中至少一部分溶解在极性溶剂中；从沉淀物中分离极性溶剂，以生产一种包括具有期望纯度水平的叶黄素的产物。

在本发明的一个方面，皂化提取物是从含有类胡萝卜素和叶绿素混合物的机械化收割的金盏花中获得的。

作为其变化，该方法进一步可以包括如下步骤：从非极性和极性溶剂中回收任何类胡萝卜素的绝大部分；在惰气环境下将产物去溶剂化且干燥；在混合之前，将分散体的pH值调整到大约5.0～7.0之间。可以通过加入一种选自磷酸、硫酸、盐酸、乙酸或任何具有类似特性的无机酸或有机酸的酸来调整pH值。

进一步变化中，该方法可以包括如下额外的步骤：在混合之前，将分散体的温度调整到大约45℃～80℃之间；在用非极性溶剂接触残余物之前，用水洗涤残余物，其中用于洗涤的水的pH值被调整到大约5.0～7.0之间，温度被调整到大约45℃～80℃之间。

一方面，非极性溶剂选自己烷、庚烷、环己烷、辛烷、芳族烃、醚和卤代烃，极性溶剂选自酮、醇、胺及其混合物。

另一方面，该产物中的叶黄素包括水解黄体素和玉米黄素的混合物。在皂化提取物中黄体素和玉米黄素可以超过类胡萝卜素的95％。该产物在每一千克皂化提取物也可以包括400～900克总类胡萝卜素。皂化提取物可以包括0～20％的叶绿素。类胡萝卜素在分散体中的浓度可以是每一千克皂化提取物中含大约0.1～15克类胡萝卜素，或更优选的是每一千克皂化提取物中含大约5～10克类胡萝卜素。

本方法的另一个变化中，每份残余物中非极性溶剂的使用比例为大约1～25份，更优选的为大约5～12份溶剂。每份沉淀物中所使用的极性溶剂的比例为大约1～15份，更优选的为大约4～10份。非极性溶剂和极性溶剂可以在周围环境温度下使用。

在本发明的一个方面，该产物适合于人类使用。

本方法的另一个变化中，公开了一种获得具有期望纯度水平的叶黄素的方法。该方法包括获得一种机械化收割的植物组合物的皂化提取物。植物组合物包括第一种包括叶黄素的植物部分和第二种包括叶绿素的植物部分。用水洗涤皂化提取物，以留下含油残余物。用非极性溶剂在一定条件下接触残余物，使任何脂溶性化合物的至少一部分溶解在非极性溶剂中以及至少一部分叶黄素从非极性溶剂中沉淀出来以形成沉淀物。从沉淀物中分离非极性溶剂。然后用极性溶剂洗涤沉淀物，使任何残余叶绿素的至少一部分溶解在极性溶剂中。从沉淀物中分离极性溶剂，以生产一种包括具有期望纯度水平的叶黄素的产物。

优选实施方案详述

许多方法适合于从天然资源中提取和分离类胡萝卜素。例如，Philip(美国专利4,048,203)公开了一种在乙醇介质中纯化黄体素的方法；Tyczhowski(Poult.Sci.70(3)：651-54)教导了通过用不同溶剂结晶从皂化金盏花提取物分离游离黄体素；Ausich(美国专利5,648,564)公开了先在碱性丙二醇溶液中皂化，然后结晶，从金盏花提取物中分离和纯化黄体素；Khachik(美国专利5,382,714)教导了通过用醇/水混合物在低温下洗涤，然后也在低温下在几种二元溶剂混合物中结晶从皂化金盏花提取物中分离和纯化黄体素；最近，Khachik(WO 99/20587)公开了用KOH和NaOH的醇溶液皂化，并用THF和水来提取并结晶类胡萝卜素，从几种植物提取物中分离和纯化黄体素。用该方法，从类胡萝卜素中分离存在于原材料中的叶绿素是可能的。Hills(美国专利4,851,339)描述了一种同时分离胡萝卜素、四吡咯和卟啉的方法，尤其在藻类中。

Kitaoka(EP 732 378 A2)描述了一种适用于使用非极性溶剂和水溶液的液-液萃取的极稀着色提取物。为了分析及阐明结构的目的，但不是设计为了商业规模应用，Repeta(Monofr.Oceanogr.Methodol.，1997，10：239-60)对多种纯化类胡萝卜素的方法做了详尽的回顾。

本发明公开了从天然资源中，尤其包括含有相对高水平叶绿素的金盏花提取物中，分离和纯化黄体素和玉米黄素的方法。更明确地说，用于该方法的原材料包括含有20g/kg或更多的绿色物质的皂化金盏花提取物。然而，所公开的方法也适用于从其它含有较低水平的杂质叶绿素色素的原材料资源中分离和纯化叶黄素。各种原材料资源包括藻类、蚕排泄物、菠菜和苜蓿叶子。

在本发明的一个优选实施方案中，每一千克含有大约40～150克类胡萝卜素和大约5～20克叶绿素的金盏花提取物被用作起始材料。这样的提取物是Productos Deshidratados de Mexico(PRODEMEX)，LosMochis，Sinaloa，Mexico生产的。用于制备这些提取物的金盏花的花可以是机械化收割的，含有大量叶子、茎干、花梗和其它含有丰富的叶绿素及其衍生物的植物部分。

金盏花粗粉是用机械收割的花脱水制备的。脱水的方式有好几种，包括带式、盘式、架式和转鼓式干燥器或太阳干燥。将干材料磨细，随后用非极性溶剂如己烷来进行溶剂萃取。然后通过蒸发去除溶剂，这样就获得了金盏花油树脂。然后将油树脂皂化以完成所存在的叶黄素和叶绿素的水解。可以通过用氢氧化钠或氢氧化钾或一些其它碱处理油树脂来实现皂化。本领域普通技术人员都熟知皂化条件。

在皂化反应中可以获得游离黄体素、玉米黄素和其它游离叶黄素，以及脂肪酸像肉豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸的钠盐和钾盐。另外，依赖于用作皂化剂的碱(如分别为NaOH或KOH)，可以用钠或钾取代色素分子上的植基和甲基基团。在皂化过程中，也可以生产水溶性叶绿素。

然后用水洗涤皂化提取物。将提取物分散在水中，并且稀释到最终浓度为每一千克含水分散体含有的全部叶黄素为大约0.1～30克。优选是每一千克含水分散体含有大约5～10克。优选地，将含水的分散体彻底地混合，以形成均匀混合物。

然后用选自乙酸、磷酸、硫酸、盐酸或任何具有类似特性的无机酸或有机酸的水溶液将混合物的pH值调整到大约1.0～7.0之间，优选地在大约5.0～6.5之间。可以将酸溶液的浓度固定在大约5～25％(w/w)之间。混合物的温度应该保持在20℃～80℃之间，优选地在45℃～70℃之间。当含有水溶性叶绿素和其它水溶性杂质的水相可以容易地从上层含油残余物中分离时，混合物的pH值被充分地降低(中和)。可以用传统的分液仪将下层水相分离。含油残余物含有一些残余的水溶性叶绿素和叶黄素。

可以用维持固定pH值的额外的水洗涤降低来自含油的上层相的残余水溶性绿色物质的浓度。对于每次洗涤，每体积份残余物使用4～20体积份的水是可能的，优选是8～15体积份。可以将水洗汇合，用于后续的绿色色素的分离。水洗可以持续到含油残余物基本上不含叶绿素和相应化合物，并且主要含有脂类、水和叶黄素。

然后用非极性溶剂提取湿润的含油残余物。溶剂可以选自短链脂肪族(如己烷)或芳族烃、烷基取代溶剂或其混合物。优选地，烃含有6～8个碳原子。对于每一份含油残余物，每次提取可以使用大约1～20份非极性溶剂(w/w)，优选地为大约5～10份(w/w)。优选地，使用至少两次提取。提取是在大约-20℃～70℃的温度下进行的，优选地为15℃～45℃，更优选为大约35℃～45℃。脂类和胡萝卜素，以及其它脂溶性物质可以在被分离和混合的非极性溶剂中提取。

在提取过程中从非极性溶剂中沉淀出来的固体富含黄体素和玉米黄素。叶绿素的残余量可能仍然存在。使用极性溶剂的一次或两次额外洗涤应该足以使叶绿素污染物的水平最小化。极性溶剂可以是酮、醇、胺或任何其它具有类似特性的极性溶剂。应该使用与叶绿素分离相同的酸来酸化溶剂。相对于残余固体的重量，可以使用3～20份溶剂，但优选为6～10份。优选地，洗涤在环境温度下进行。可以收集溶剂洗涤物，并将溶剂回收。用通常方法将溶剂去除，并将最终的固体干燥，优选在惰气气氛下进行。

下面的实施例将使得对本发明的理解更全面：

实施例1

在环境温度下，将大约660克皂化金盏花提取物(该物质在每一千克皂化提取物中含有大约72.5克叶黄素和大约12克叶绿素)分散在水中，以使得每一千克混合物中总类胡萝卜素的最终浓度为10克。用25％的磷酸水溶液将混合物的pH值调整到6。然后将温度升高到70℃。在剧烈混合20分钟后，使混合物静止。产生了易于分离的含有叶绿酸钾和叶绿酸镁的含水底相。用6倍体积的酸性水溶液将剩余的含油物质洗涤3次以上，这去除了大部分绿色色素。将所有的叶绿酸溶液收集起来，以用于后边的处理。

在环境温度下，用每份油中含有6份己烷的溶液洗涤含油残余组分。叶黄素开始从溶剂相中沉淀出来，其中溶剂相富含脂肪酸、胡罗卜素和其它可溶于己烷的脂类。然后通过过滤分离溶剂，用与第一次相同的方式将用己烷重复洗涤两次以上。在惰性气体下，将残余固体干燥到大约4％的湿度。

获得了一种重量为49克的含有80％的初始色素的产物。这相当于每一千克产物中含有660克类胡萝卜素的浓度，其中黄体素92.2％和玉米黄素6.1％，这使得它非常适合于人类使用。

实施例2

在环境温度下，将1000克皂化金盏花提取物(每一千克含有110克叶黄素和大约18克叶绿素)分散在水中，直到每一千克分散体中的类胡萝卜素为10克。用15％的乙酸水溶液将混合物的pH值调整到6.8。然后持续搅拌将温度升高到60℃，并且搅动30分钟。使混合物静止，直到分离(大约15分钟)，这样水层就被分离出来。在pH为6.8的条件下，将水洗涤重复3次以上，在第四次洗涤之后获得一种非常淡的绿颜色。

用己烷∶庚烷(2∶1)混合物洗涤残余糊状物，每份糊状物使用8份溶剂。在一个箱式离心转桶中离心该混合物，将固相提取两次以上，以去除大部分脂类。通过蒸发从脂类组分中回收溶剂，以留下含有起始物质大约14％的全部类胡萝卜素的含油残余物。这些类胡萝卜素主要代表胡萝卜素、β-玉米黄质、顺式和反式黄体素的环氧化物以及微量反式黄体素。通过在氮气下干燥，从离心机获得的固体颗粒(pellet)中的溶剂被除去，从而产生一种含有原材料中大约80％的色素的产物。黄体素和玉米黄素的总和为全部类胡萝卜素的97.5％。干燥产物的重量是150克。

实施例3

根据美国专利5,973,211(Rodriguez)中描述的方法，将大约600克金盏花粗粉皂化且异构(全部叶黄素中，61％是玉米黄素，34％是黄体素)；此处将其完整引用于此作为参考。如实施例1中所描述的处理所获得的提取物。最初提取物的浓度为每一千克含总类胡萝卜素50克，每一千克含有5克叶绿素。在处理之后，所获得的产物的浓度为，每一千克含有总类胡萝卜素510克，其中66％是玉米黄素，33％是黄体素。最终的浓度和色素类型表现出非常适合于人类使用的特性，含有非常少或不含残余化学药品，并且没有有害化合物。实施例4

用水将一批10,000克皂化金盏花提取物(每一千克含有总类胡萝卜素90克，含有20克叶绿素)混合，直到浓度达到每一千克混合物含有10克叶黄素。通过加入10％的盐酸溶液将混合物的pH值调整到6。将温度调整到50℃，同时搅拌20分钟。停止搅拌，使混合物静止1小时。分离含有叶绿酸钾和叶绿酸镁的底部水层。将含油残余物洗涤两次，每份提取物使用6份水，所分离的水层用于后边的绿色色素的回收。用一份油使用8份己烷的混合物来混合半固体残余部分，以产生一种分散体，将该分散体离心以形成紧密淤泥。用己烷将该淤泥洗涤两次。将离心出来的液体部分混合，并且在真空下通过蒸发去除溶剂。产生了与实施例2中获得的相类似的残余物，并将其保存，用于掺入着色产物中应用于家禽工业。离心出来的固体部分仍然含有微量类似于叶绿素的物质。为了除去类似于叶绿素的物质，用丙酮将颗粒(pellet)洗涤20分钟，其中用pH值为3的磷酸将丙酮酸化(每份固体使用6份溶剂)。过滤所获得的分散体，从过滤器中移去过滤物，并用4份酸化到pH为3的丙酮将其洗涤一次以上。收集滤出液，并回收溶剂。在溶剂回收之后，获得了一种绿色残余物；用来自己烷提取物的残余物将该绿色残余物混合，以用于家禽着色产品。在氮气气流下，通过干燥去除纯化固体中的任何残余溶剂。这样产生的纯化物质含有起始物质中85％的类胡萝卜素，其中含有黄体素和玉米黄素为97％。最终的干燥粉末的重量是1,100克。

虽然我们已经描述了许多本发明的实施方案，但显而易见，可以对我们所做的描述进行一些修改，以提供使用本发明的基本方法的其它实施方案。因此，本领域普通技术人员将理解，本发明的范围受所附权利要求的限定，而不受上述通过实施例的方式所详细描述的特定

实施方案的限定。