永久性羊水细胞系,其制备和用于制备基因转移载体的用途

摘要

本发明涉及永久性羊水细胞系，含有至少一种能够表达腺病毒E1A和E1B区的基因产物的核酸。本发明还涉及永久性羊水细胞系的产物，及其制备基因转移载体和/或腺病毒突变株的用途。其它方面还包括羊水细胞和腺病毒E1A和E1B区的基因产物用于制备永久性羊水细胞系的用途。

说明书

发明领域

本发明涉及含有至少一种核酸的永久性羊水细胞系，它能够表达腺病毒E1A和E1B区的基因产物。本发明还涉及永久性羊水细胞系的制备，及其用于制备基因转移载体和/或腺病毒突变株的用途。其它方面是羊水细胞和E1A和E1B区的腺病毒基因产物用于制备永久性羊水细胞系的用途。

发明背景

腺病毒

腺病毒是一种较为统一的病毒，特征是主要由病毒编码的六邻体、五邻体和纤维蛋白构成的二十面体衣壳，和大小约36kb的线性双链DNA基因组。病毒基因组在末端含有反向末端重复序列(ITR)，它们具有病毒的复制起始点。在基因组的左侧末端还含有包装信号。它是在感染周期内将病毒基因组包装入病毒衣壳必需的。已从许多物种中分离出了腺病毒。通过测定各种血清型的参数，例如血凝反应、肿瘤原性和DNA序列同源性，有40多种不同的人血清型(Wigand等，于：腺病毒DNA，Doerfler编，Martinus Nijoff Publishing，Boston，pp.408-441，1986)。迄今腺病毒通常是衍生自血清2型(Ad2)和5(Ad5)。Ad2和Ad5的感染在人类中是地方性的。Ad2和Ad5在人体内不致癌，具有良好的安全记录，因为对美国军人已成功进行了接种，而且没有并发症(Pierce等，Am.J.Epidemiol.87，237-246，1968)。腺病毒的生物学是理解较充分的，因为腺病毒在分子生物学中作为实验工具起到了重要作用，用于阐明各种基础生物学原理，例如DNA复制、转录、RNA剪接和细胞转化。腺病毒颗粒在感染中通过受体介导的胞吞作用进入细胞，其中根据现在的观点，纤维蛋白的把手结构域与柯萨基腺病毒受体(CAR)的相互作用介导了病毒颗粒附着到细胞表面(Bergelson等，Science 275，1320-1323，1997)。在第二步中，病毒颗粒内化，其中五邻体与整合蛋白的相互作用起到了主要作用(Wickham等，Cell 73，309-391，1993)。颗粒进入细胞后，病毒基因组作为DNA-蛋白质复合物进入细胞核。以腺病毒复制的开始区分，腺病毒感染周期分为早期和晚期(Shenk于：Virology，Fields编，Lippincott-Raven Publishing，Philedelphia，pp.2111-2148，1996)。在早期，早期病毒功能E1、E2、E3和E4表达。晚期的特征是晚期基因转录，它们负责表达病毒的结构蛋白和产生新的病毒颗粒。

E1A是病毒染色体在到达细胞核后表达的第一种病毒基因。E1A基因编码12S和13S蛋白，它们是通过可变剪接E1A RNA形成的。E1A蛋白通过与转录因子相互作用激活许多细胞和病毒基因的转录。E1A的主要功能是a)激活病毒其它早期功能蛋白E1B、E2、E3和E4，和b)诱导休眠细胞进入细胞周期的S期。E1A单独表达导致细胞程序性死亡(凋亡)。

E1B是E1A激活的早期病毒基因之一。E1B基因通过可变剪接E1B RNA表达E1B55kD蛋白和E1B 19kD蛋白。55kD蛋白通过p53肿瘤抑制基因调节细胞周期的进程，与防止感染晚期中细胞mRNA的转运有关，防止E1A诱导的细胞凋亡。E1B 19kD蛋白对于防止E1A诱导的细胞凋亡也是同样重要的。

所有人腺病毒能在细胞培养物中转化啮齿类细胞。作为一条规则，E1A和E1B的共表达对于原癌转化是必需的。

编码病毒衣壳的结构成分的蛋白质IX基因嵌在E1B转录单元中。

E2A和E2B基因编码各种对于病毒基因组复制重要的蛋白质。这些包括末端蛋白(pTP)、DNA聚合酶(Pol)和单链结合蛋白(SSBP)。在复制时，pTP与病毒基因组的ITR结合，它作为DNA复制的蛋白质引物，由Pol和细胞因子引发DNA复制。Pol、SSBP和细胞因子NFII和可能的其它因子是DNA链延伸必需的。

E4编码各种蛋白质。尤其是E4 34kD蛋白与E1B 55kD蛋白一起封阻细胞mRNA在细胞质中的聚集，同时促使病毒RNA从细胞核转移到细胞质中。

病毒基因组复制开始后，表达病毒结构蛋白，它们是形成病毒衣壳和病毒DNA与病毒编码的DNA结合蛋白复合必需的。在病毒基因组将进入的空衣壳中明显有初始信息。病毒基因组上的一个顺式元件是该过程必需的，该所谓的包装信号位于病毒基因组的左侧末端，就Ad5而言，从碱基对260延伸到碱基对460(Hearing等，J.Virol.62，2555-2558，1987；Graeble和Hearing，J.Virol.64，2047-2056，1990)。包装信号与E1A增强子重叠，它是E1A启动子活性必需的。病毒基因组包装入病毒衣壳的确切机制不清楚，但是可能细胞和/或病毒蛋白与包装信号的相互作用是必需的。

腺病毒载体

腺病毒载体作为表达载体是特别重要的，尤其是为了基因治疗的目的。对于此有几条理由：腺病毒的生物学已经充分了解。病毒颗粒稳定，能相对简单并以高滴度产生。腺病毒基因组的基因操作方便。腺病毒载体能在体外和体内有效转导复制和非复制细胞。

a)第一代腺病毒载体

第一代腺病毒载体(Gilardi等，FEBS通信267，60-62，1990；Stratford-Perricaudet等，Hum.Gene.Ther.1，241-256，1990)的特征是缺失E1A和E1B基因。E1A和E1B具有转化和反式激活性能。另外，E1A是激活病毒基因必需的，E1B是病毒转录子聚集必需的。在某些载体中E3也被除去，以提高吸收外源DNA的能力。E3是在细胞培养物中产生腺病毒不可缺少的。携带外源DNA的能力约为8kb。第一代腺病毒载体迄今主要在293细胞中产生(见下文)，它补偿了载体中E1A和E1B缺陷。

b)第二代腺病毒载体

第二代腺病毒载体的特征是除了E1A和E1B外，还缺少E2和/或E4(Engelhardt等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，6196-6200，1994；Yang等，Nature Gent.，7，362-367，1994；Gorziglia等，J.Virol.70，4173-4178，1996；Krougliak和Graham，Hum.Gene Ther.6，1575-1586，1995；Zhou等，J.Virol.70，7030-7038，1996)。在某些载体中还除去了E3，以提高携带外源DNA的能力。开发第二代腺病毒载体是为了进一步减少病毒基因的转录和病毒蛋白质的表达，和为了从而进一步减少抗病毒免疫应答。与第一代腺病毒载体比较，携带外源DNA的能力的提高可忽略。第二代腺病毒载体在除了E1A和E1B还补偿具体缺陷(E2和/或E4)的细胞系中制备。

c)大DNA能力的腺病毒载体

大DNA能力的腺病毒载体特征是不含病毒编码的序列(Kochanek等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，5731-5736，1996；Fisher等，Virology 217，11-22，1996；Kumar-Singh和Chamberlain，Hum.Mol.Genet.5，913-921，1996)。这些载体仅含有包含ITR和包装信号的病毒末端。携带外源DNA的能力大约是37kB，这是因为除去了大部分腺病毒基因组。已经阐述了各种用于制备的大DNA能力的腺病毒载体的系统(Kochanek等，见上；Parks等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，13565-13570，1996；Hardy等，J.Virol.71，1842-1849，1997)。这些与第一代和第二代腺病毒载体比较具有大DNA能力的腺病毒载体的优点是更大的携带外源DNA的能力和较低的毒性和免疫原性(Schiedner等，Nature Genet.18，180-183，1998；Morral等，Hum.Gene Ther.18，180-183，1998；Morral等，Hum.Gene Ther.9，2709-2716，1998)。目前，大能力的腺病毒载体在E1A和E1B缺失的辅助病毒帮助下制备，它反式提供生产性感染周期必需的病毒功能。迄今，在293细胞或衍生自293细胞的细胞系已能制备大DNA能力的腺病毒载体。在其中一种制备方法中(Parks等，见上；Hardy等，见上)，腺病毒载体在经修饰的293细胞中产生，它除了E1A和ElB还表达噬菌体P1的Cre重组酶。在该系统中，辅助病毒的包装信号一侧与噬菌体P1的loxP识别序列相接。在辅助病毒和大DNA能力的腺病毒载体的表达Cre的293细胞感染中，切除了辅助病毒的包装信号。为此主要包装含有正常包装信号的载体，而不是辅助病毒。

d)缺失的腺病毒载体

这些载体被称为具有位于病毒基因组内的噬菌体P1的loxP识别序列的第一代载体，其方式是感染表达Cre的293细胞后，通过在loxP识别序列之间的重组除去大部分病毒编码序列或所有病毒编码序列。这些载体基因组的大小约9kb。外源DNA基因的能力大约也是9kb(Lieber等，J.Virol.70，8944-8960，1996)。

腺病毒相关病毒(AAV)

AAV属于细小病毒，依赖性病毒属，具有两种不同的生命形式，作为裂解病毒或作为前病毒存在。为了在发生裂解性感染，病毒需要共感染辅助病毒(腺病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒)。在不存在辅助病毒的情况下，AAV复制不稳定，整合入基因组中，在其中作为无活性的前病毒存在。当带有作为整合的前病毒的AAV的细胞被感染时，前病毒能在此进入裂解感染周期(Samulski，curr.Opin.Genet.Dev.3，74-80，1993)。

AAV衣壳含有具有阳性或阴性极性的单链线性DNA基因组。存在几种AAV血清型。了解得最多的血清型是AAV-2。AAV-2的基因组含有4680个核苷酸。基因组在末端含有长145bp的反向末端重复序列(ITR)。前125bp形成含有两个内部回文序列的T形发夹结构。

AAV基因组编码复制(Rep)非结构蛋白和衣壳(Cap)结构蛋白。通过使用不同启动子(p5和p19)和可变剪接产生各种复制蛋白(Rep78、Rep68、Rep52、Rep40)。用p40启动子和可变剪接产生各种衣壳蛋白(VP1、VP2、VP3)。

AAV载体

AAV载体仅含AAV的ITR和一些邻接的非编码AAV序列。为此，吸收外源DNA的能力是约4.5kb。已描述了各种产生重组AAV载体的系统(Skulimowski和Samulski，于：分子遗传学方法，Vol.7，Adoph编，Academic Press，pp.3-12)。这些系统提供了复制、表达和包装重组载体必需的成分。特别是，这些是表达盒，它们编码AAV的Rep和Cap蛋白以及腺病毒辅助功能。AAV产生必需的腺病毒辅助功能具体是E1A、E1B、E2、E4和VA。迄今用于产生的293细胞提供了E1A和E1B。在迄今所述的产生过程中，目前通常通过与腺病毒共转染或通过与表达E2、E4和VA的质粒共转染提供E2、E4和VA功能(Samulski等，J.Virol.63，3822-3828，1989；Allen等，J.Virol.71，6816-6822，1997；Tamayose等，Hum.Gene Ther.7，507-513，1996；Flotte等，Gene Ther.2，29-37，1995；Conway等，J.Virol.71，8780-8789，1997；Chiorini等，Hum.Gene Ther.6，1531-1541，1995；Ferrari等，J.Virol.70，3227-3234，1996；Salvetti等，Hum.Gene Ther.9，695-706，1998；Xiao等，J.Virol.72，2224-2232，1998，Grimm等，Hum.Gene Ther.9，2745-2760，1998；Zhang等，Hum.Gene Ther.10，2527-2537，1999)。另外，开发了策略，其中用腺病毒/AAV或单纯疱疹病毒/AAV杂交载体产生AAV载体(Conway等，见上；Johnston等，Hum.Gene Ther，8，359-370，1997，Thrasher等，Gene Ther.2，481-485，1995；Fisher等，Hum.Gene Ther.7，2079-2087，1996；Johnston等，Hum.Gene Ther.8，359-370，1997)。所有这些方法中相同的是都使用能够表达E1A和E1B的293细胞产生。

生产细胞系

出于安全原因，用于人类的腺病毒载体通常除去E1A和E1B基因。使用互补细胞系生产，其能提供了反式的E1功能。迄今大多数腺病毒载体在293细胞系中生产。近年来，能用于产生E1缺失的腺病毒载体的其它细胞系产生了。

a)HEK 293细胞

HEK 293细胞在长时间内是唯一能用于制备E1缺失的腺病毒载体的细胞。1977年，通过将经剪接的腺病毒DNA转染入人胚肾细胞(HEK细胞)产生了HEK 293细胞。在总共8次实验中平均每个实验用20个HEK培养物，仅可获得一个不死的细胞克隆(Graham等，J.gen.Virol.36，59-74，1977)。从该细胞克隆建立的细胞系(HEK 293细胞)含有完整的腺病毒左侧11％的基因组(Ad5基因组的bp1-4344)，包括E1A和E1B基因和左手ITR和腺病毒包装信号(Louis等，Virology 233，423-429，1997)。制备腺病毒载体的重大问题是E1缺失的腺病毒载体和整合入293细胞的腺病毒DNA部分的序列同源性。载体基因组和整合入293细胞中的腺病毒DNA的同源重组能够产生强复制的腺病毒(RCA)(Lochmüller等，Hum.Gene Ther.5，1485-1491，1994；Hehir等，J.Virol.70，8459-8467，1996)。HEK 293细胞对此不适于制备药用质量的腺病毒载体，因为生产单元常常被不可接受量的RCA污染。RCA在临床使用的产品中不可接受，因为强复制腺病毒比复制缺陷型腺病毒具有明显高得多的毒性，能在人组织中不受控制的复制，更能补偿复制缺陷型腺病毒(Lochmüller等，见上；Imler等，Hum.Gene Ther 6，711-721，1995；Hehir等，见上)。

b)人胚胎视网膜细胞(HER细胞)和建立的细胞系

虽然啮齿类细胞可以容易的用腺病毒E1功能转化，但是已证实原代人细胞对E1A和E1B的转化有相对抗性。如上所述，Graham和同事能从HEK细胞中分离仅一种细胞克隆，它被经剪接的Ad5 DNA转染。Gallimore和同事长期不成功的尝试用Ad12的E1功能转化原代HEK细胞(Gallimore等，Anticancer Res.，6，499-508，1986)。这些实验在三年中用1毫克以上含E1A和E1B基因的Ad12的EeoRI cDNA片段都不成功。许多尝试后，尽管进行了大量实验，仅可以分离4个Ad12-E1 HEK细胞系(Whittaker等，Mol.Cell.Biol.，4，110-116，1984)。同样，Gallimore和同事不成功的尝试用E1功能转化其它原代人细胞，包括角质化细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞和尿道细胞(Gallimore等，Anticancer Res.6，499-508，1986)。迄今唯一可以用腺病毒E1功能生产性转化的人细胞类型是人胚胎视网膜细胞(HER细胞)。HER细胞是衍生自白神经视网膜的细胞混合物。为了获得这些细胞，必须从妊娠16-20周之间的人胎儿眼眶中取下眼睛。水平切开眼睛，用钳子取下白神经视网膜，置于细胞培养物中。

基于更早的观察a)Ad12-诱导的肿瘤主要来自灵长类神经上皮(Mukai等，Prog.Neuropathol.3，89-128，1976)和b)Ad12在大鼠和狒狒中，眼内接种后诱导视网膜肿瘤(Mu-1023-1025，1980)，byrd和同事发现人胚胎成视网膜细胞(HER细胞)能被Ad12的E1基因转化(Byrd等，Nature 298，69-71，1982)。虽然HER细胞的转化效力比原代大鼠细胞小，转化的效力也比HEK细胞高100倍以上。为了产生可用于分离的Ad12 E1突变株的互补细胞系，开始调查。

在该研究组(Gallimore等，Cancer Cell 4，339-348，1986)的进一步调查中，显示HER细胞可被表达Ad5的E1A和E1B基因的质粒DNA有效转化。转化和建立表达E1A和E1B的细胞系的效力用Ad5的E1基因比用Ad12的E1基因高约20倍。

基于这些数据，Fallaux和同事(Fallaux等，Hum.Gene Ther.7，215-222，1996；Fallaux等，Hum.Gene Ther.9，1909-1917，1998)通过用表达Ad5的E1A和E1B基因的质粒转化HER细胞，建立了表达E1A和E1B的细胞系。通过用含有Ad5的E1A和E1B基因(Ad5基因组的核苷酸79-5789)，并在天然E1A启动子的控制下表达E1A的质粒转化产生了细胞系911(Fallaux等，见上；专利申请WO97/00326)。可能进一步通过转染含有Ad5基因组核苷酸459-3510的质粒建立表达E1A和E1B的HER细胞系，在质粒中E1A基因在人磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子的控制下，其中天然E1B聚腺苷酸信号被乙肝病毒(HBV)表面抗原的poly(A)序列取代(Fallaux等，见上；专利申请WO97/00326)。这些HER细胞系称为PER细胞系。这些新PER细胞系与293细胞或911细胞系相比的优点在于缺乏第一代腺病毒载体的DNA和整合的Ad5 DNA之间的序列同源性。对此RCA产生的可能性显著下降。这些E1A和E1B转化的HER细胞系(911相比和PER细胞)能补偿第一代腺病毒载体的E1缺陷，从而用于制备这些载体。

以相似方式，在Imler和同事(Imler等，见上；另见WO 94/28152)的出版物中提到了用质粒pTG6559转化HER细胞，建立的细胞系。质粒pTG6559含有蛋白质IX基因的E1A和E1B基因(Ad5基因组的核苷酸505-4034)，E1A基因在小鼠磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子的控制下，连接的E1B和蛋白质IX基因的聚腺苷酸信号被家兔β-珠蛋白基因的聚腺苷酸信号代替。

与所述用Ad5的E1A和E1B基因转化，建立原代人细胞的尝试相反，在几个例子中尝试在之前建立的细胞系中稳定表达各种血清型的E1A和E1B(Grodzicker等，Cell，21，453-463，1980；Babiss等，J.Virol.46，454-465，1983；Shiroki等，J.Virol.45，1074-1082，1983；Imler等，见上；另见WO 94/28152)。这些细胞系的缺点是需要共表达选择性标记，和E1A和E1B表达常常缺乏稳定性。由于这些细胞系从开始就是不死的细胞系，表达E1A和E1B不是细胞系存活必需的，因此在这种情况下不需要用E1A和E1B天然选择，与使用原代细胞相反。

过去制备用于腺病毒载体或制备AAV载体的细胞系特别困难。可从人胎肾获得人胎肾细胞(HEK细胞)。这是通过从胎儿取下肾脏，将肾细胞置于细胞培养物中进行的。在一个例子中用剪接的Ad5 DNA转染HEK细胞，整合Ad5 DNA左手侧的末端，表达E1A和E1B基因导致转化细胞。可能用该方法建立单一的细胞系(293细胞)(Graham等，见上；见上述“生产细胞系”，a部分)。293细胞用于产生腺病毒载体和产生AAV载体。

可从人胎儿的眼球获得人胚胎视网膜细胞(HER细胞)。这是通过取下胎儿的眼球，将来自视网膜的细胞置于培养物中进行的。可用腺病毒E1A和E1B基因转染HER细胞，来转化HER细胞(见上“生产细胞系”，b部分)。用E1A和E1B转化的细胞可用于产生腺病毒载体。

在两种情况下都需要从自发或治疗性流产，或由于社会背景中止妊娠的人胎儿取下器官，从该器官建立细胞培养物。在建立原代培养物后，可用腺病毒E1A和E1B基因转染，转化这些细胞。可以该方法建立细胞系，然后通过表达E1A和E1B产生腺病毒载体或AAV载体。

明显的是，从胎儿器官获得原代细胞是复杂的。由于仅能从新鲜组织建立原代培养物，需要特别的后勤努力来获得合适的组织。另外，使用从自发流产、治疗性流产或基于社会背景中止妊娠得到的胎儿组织对于建立原代培养物提出了特殊的伦理和关注。虽然发明人的实验室位于妇科诊所内，常常进行中止妊娠，在长达一年以上的时间内也不能获得合适的组织。在流产后取出胎儿组织需要怀孕妇女在获得合适的信息后作出同意的声明。在接受详细的计划信息，即从胎儿取下眼睛用于科学的医学调查后，常常不可能获得怀孕妇女对于取下器官的干预的同意。

之前未描述过用永久性的羊水细胞系产生基因转移载体。仅有一篇用猿病毒(SV40)和/或Kirsten肉瘤病毒转化人羊水细胞的报道(Sack，In Vitro 17，1-19，1981；Walen等，In Vitro Cell Dev.Biol.22，57-65，1986)。单独用SV40感染赋予延长的生命(称为不死化)，而单独用Kirsten肉瘤病毒感染不延长寿命。同时用两种病毒感染最终导致恶性肿瘤细胞(Walen和Arnstein，见上)。应注意在该联系中SV-40转化的羊水细胞系不能稳定产生基因转移载体，因为这些细胞自身产生SV40，它已知是原癌病毒(Graffney等，Cancer Res.30，871-879，1970)。另外，用SV40转化人细胞对于用腺病毒的E1功能转化，和其产生基因转移载体的用途未提供信息。例如，可用SV40转化角质化细胞(见Sack，见上)，但角质化细胞明显不行，就与用Ad12转化的皮肤成纤维细胞一样(Gallimore等，1980，见上)。对于在不死化细胞中产生病毒载体，特别是腺病毒载体，不仅特定的不死化功能是重要的，良好的感染力和良好的感染产生过程也是重要的。这些性能不可预期；必须重新对每一种细胞类型确定哪种具体的细胞类型可用于产生基因转移载体。

                              发明简述

因此，本发明的一个目的是提供一种有效、简单、简便的可重复产生羊水细胞系的新方法，尤其是其用于制备腺病毒载体、AAV载体和反转录病毒或慢病毒载体的用途。

完全出乎意料的发现在产前诊断中，通过出于诊断目的的羊水活组织检查(羊水穿刺)常规获得的羊水中的细胞(羊水细胞)用腺病毒E1A和E1B基因转染，得到大量以功能活跃的方式表达E1A和E1B基因的永久性细胞系，它们适合产生基因转移载体。

因此，本发明的一个方面是一种永久性羊水细胞系，它含有至少一种核酸，实现腺病毒E1A和E1B区域的基因产物的表达。根据本发明，“永久性细胞系”意味着相应的细胞在某些方面经基因改造，从而能在细胞培养物中永久持续生长。相反“原代细胞”意味着通过从器官取下，亚培养获得的细胞，具有有限的寿命。为了本发明的目的，可用本文提到的方法获得永久性羊水细胞系，包括用腺病毒E1功能转染原代羊水细胞。至少一种引起腺病毒E1基因产物表达的核酸可以是任何合适的核酸或导致这些基因产物稳定表达的核酸。它/它们可整合入细胞的基因组，即染色体，或存在于染色体外，例如作为游离复制的质粒或小染色体。另外，各种基因产物的表达可由一条和相同的核酸分子，或例如不同的核酸分子实现。“表达”在本领域指产生基因产物的过程，它是实现特定性状或特定性能的特殊蛋白质，或不翻译成蛋白质的RNA形式(例如反义RNA、tRNA)。实现所需表达的合适可能性对于熟练技术人员根据本描述，特别是提出的方法也是明显的。新的羊水细胞系不仅适合用于一般产生基因转移载体，还特别适合产生特征是缺失E1A和E1B基因的第一代腺病毒载体，它被细胞系补偿。

至少一种核酸还优选引起腺病毒E2A、E2B和/或E4区域和/或Cre重组酶的表达。这使得细胞系特别适合产生第二代腺病毒载体，其特征是除了缺失E1A和E1B基因，还缺失E2和/或E4基因。噬菌体P1 Cre重组酶的表达特别有利于在E1A-和E1B缺失的辅助病毒的帮助下，产生能力大的腺病毒载体(另见Parks等，见上；Hardy等，见上)。在组成型启动子，优选磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子的控制下表达E1A区基因产物是有利的。如果在腺病毒启动子，优选腺病毒E1B启动子的控制下，有利于表达E1B区的基因产物。这可能的替代方法是使用例如巨细胞病毒(CMV)启动子。所有腺病毒基因产物优选来自同一亚属的腺病毒，例如来自人腺病毒5型(Ad5)。永久性羊水细胞系通常是人细胞系，因为这特别适合制备衍生自人病毒，例如人腺病毒或人AAV的基因转移产物。

这可能的一种替代物是来自灵长类或其它哺乳动物，例如牛的细胞系，特别适合产生衍生自存在于特定物种中并流行的病毒的基因转移载体。例如，用牛腺病毒E1A和E1B转化羊水细胞获得的永久性羊水细胞系适合产生衍生自牛腺病毒的载体。

本发明的另一个方面是制备永久性羊水细胞系，特别是上述定义的羊水细胞系的方法，包括用至少一种使得E1A和E1B区的腺病毒基因产物表达的核酸转染羊水细胞。然后如果适于进一步分离细胞克隆，如需要，克隆以获得单一的细胞系。本文中的术语“转染”意味着任何适合将核酸引入细胞的方法。可能提到的例子是电穿孔化、任何类型的脂质体系统和这些方法的组合。本文中的术语“羊水细胞”在广义上指所有存在于羊水中，可通过羊水活组织检查获得的细胞。它们衍生自羊膜或来自与羊水接触的胎儿组织。描述了三大类羊水细胞，根据形态特征区分：成纤维细胞样细胞(F细胞)、上皮样细胞(E细胞)和羊水细胞(AF细胞)(Hohn等，Pediat.Res.8，746-754，1974)。AF细胞是主要的细胞类型。因此狭义上说，“羊水细胞”指AF型的羊水细胞。优选使用原代羊水细胞。称为“原代”的细胞是可通过从生命体取下，亚培养，生命有限的细胞，而称为“永久性”的细胞系能不受限制的持续生长。在该关系中特别优选的是使用人细胞系(见上)。然而也可以使用灵长类和其它哺乳动物，如牛的原代羊水细胞。根据本文的描述，对于熟练技术人员明显的是可以用能从羊膜例如通过胰酶消化，或通过绒膜绒毛活组织检查获得的类似细胞，用于产生相应的永久性细胞系。

实现腺病毒E1基因产物表达的至少一种核酸可以是基因组DNA、cDNA、合成的DNA、RNA或mRNA。优选使用的核酸是DNA表达载体形式。其例子是整合的载体、细菌质粒、游离复制的质粒或小染色体。优选通过转染整合入受体细胞的基因组的表达质粒。术语“至少一种核酸”表达了事实，即实现表达的元件可以存在于一条或同样的核酸，或不同的核酸上。例如，可提供用于表达E1A、E1B、E2A、E2B和/或E4区和/或Cre重组酶的基因产物的分离核酸。可以想像要转染的羊水细胞已表达这些基因产物之一，因此仅需要实现其它基因产物的表达，或仅通过引入合适的调控元件触发一种或多种这些基因产物的表达。合适的用于产生，以及如果合适，核酸的诱变，基因表达和蛋白质分析的技术和方法是熟练技术人员已知的(见例如Sambrook，J.等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HaroborLaboratory Press(1989)；Glover，D.M.，DNA cloning：A practical approach，vol.II：Expression Systems，IRL Press(1995)；Ausubel等，Short protocols inmolecular biology，John Wiley & Sons(1999)；Rees，A.R.等，Proteinengineering：A practical approach，IRL press(1993))。优选E1A区的基因产物或多种基因产物在组成型启动子，特别是磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子的控制下表达，E1B区的基因产物在腺病毒启动子，特别是腺病毒E1B启动子的控制下表达。还可以用例如巨细胞病毒(CMV)启动子代替腺病毒启动子。

在一个具体实施例中，羊水细胞的转染和/或得到的细胞系还实现腺病毒E2A和/或E2B和/或E4区域和/或Cre重组酶的基因产物的表达。所有在现有技术中先前讨论过或另外公开的可能性对于本领域技术人员都是可得的。关于各基因，还对于下列信息提供了参考：E2A：Genbank登录号#M73260；Kruiyer等，Nucl.Acids.Res.9，4493-4500，1982。E2B：Genbank登录号#M73260；Dekker等，Gene 27，115-120，1984；Shu等，Virology 165，384-356，1988。E3：Genbank登录号#M73620；Cladaras等，Virology 140，28-43，1985。E4：Genbank登录号#M73620和D12587；Virtanen等，J.Virol.51，822-831，1984；Dix等，J.Gen.Virol.73，2975-2976，1992。在某些情况下已知仅Ad2的阅读框是已知的，然后可通过与例如Ad5.Cre重组酶：Genbank登录号#X03453；Sternberg等，J.Mol.Biol.187，197-212，1986的序列比较而指定。

腺病毒基因产物优选都衍生自特定的腺病毒血清型，特别是来自人腺病毒5型(Ad5)。作为用于转化羊水细胞的E1A和E1B基因的起源的具体腺病毒血清型不是本发明的关键。可用于本发明的腺病毒血清型的例子是现有技术中已知的，包括40种以上的人血清型，例如Ad12(亚属A)、Ad3和Ad7(亚属B)、Ad2和Ad5(亚属C)、Ad8(亚属D)、Ad4(亚属E)、Ad40(亚属F)(Wigand等，于：Adenovirus DNA，Doerfler编，Martinus Nijhoff Publishing，Boston，pp.408-441，1986)。在本发明的一个优选例中，衍生自亚属C的腺病毒载体是通过用衍生自同一亚属的腺病毒的E1A和E1B基因转化产生的。例如，血清型2或5的腺病毒载体是通过用血清型2或5的E1A和E1B基因转化羊水细胞产生的。基于Ad12的腺病毒载体是通过用Ad12的E1A和E1B基因转化羊水细胞产生的等。为了产生非人类腺病毒载体，包括熟知的衍生自牛、羊、猪和其它哺乳动物的腺病毒的腺病毒载体，通过转化特定物种的羊水细胞产生羊水细胞系。这通常是必需的，因为腺病毒的功能通常不能跨越物种界限有效补偿。

在本发明的一个具体实施例中，用表达Ad5的E1A和E1B基因的表达质粒转染通过产前诊断范围内的羊水活组织检查由于诊断理由获得的羊水细胞，这些细胞不再用于诊断目的。设计该构建物，使得E1A基因在小鼠磷酸甘油酸激酶启动子的控制下，E1B基因在天然腺病毒E1B启动子的控制下。用相应的SV40病毒序列替换了天然E1B剪接受体位点和E1B聚腺苷酸序列。用质粒DNA转染几周后，观察到大量细胞克隆，将这些分离，克隆，建立为不死细胞系并分析。所有分析的细胞克隆表达E1A和E1B蛋白。用E1缺失的、表达β-gal的腺病毒载体感染，然后染色，显示所有细胞能被感染。用E1缺失的第一代腺病毒载体的感染实验揭示该细胞系适合产生腺病毒载体。在这些实验中，细胞系开始是用表达β-gal的第一代腺病毒载体感染的。48-72小时后，当细胞显示细胞病变效果(CPE)时，收集细胞，冻融三次从细胞释放腺病毒载体。用部分细胞裂解液感染293细胞，基因转移24小时后用组织化学法检测β-gal表达。可以直接从β-gal阳性细胞的数量计算载体在单个细胞系中的产量。用该方法可不困难的和可重复的获得羊水细胞系，非常适合用于制备基因转移载体。一些分离的细胞系实现腺病毒载体产生与293细胞的能力相同甚至更好。如预期的，细胞系显示在制备重组腺病毒载体中有差异(见图4)。鉴定出细胞系N52.E6和N52.F4生长迅速，特别良好的产生腺病毒载体，具有用这些细胞系制备基因转移载体的有益性能。

用于转化羊水细胞的表达E1A和E1B的表达载体的设计排除了通过腺病毒载体或腺病毒辅助病毒与整合入转化的羊水细胞中的DNA同源重组，产生复制竞争性腺病毒(RCA)，与293细胞相反。作为这种设计的代替品，可将各种表达质粒上的单个E1功能引入要转染的细胞。当然，对于293细胞也可以用例如PCR或感染测定法进行转化羊水细胞，测试基因转移载体产生中产生的批的RCA含量。然后如果合适，丢弃含RCA的批。

因此本发明的另一个方面涉及可用本文提出的方法获得的永久性羊水细胞系。在一个特定实施例中，本发明涉及1999年10月26日根据布达佩斯条约保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ)的永久性羊水细胞系N52.E6，并获得了保藏号DSMACC2416。

在另一个方面，本发明涉及用羊水细胞产生腺病毒转化的永久性羊水细胞系。术语“腺病毒转化的”在本文中意味着用一种或多种转化性腺病毒基因转化。因此“转化”指将受到生长控制的真核细胞转换成所谓的永久性细胞系，其生长不受限制。另一个方面是用E1A和E1B区的腺病毒基因产物制备永久性羊水细胞系。

本发明还包括用永久性羊水细胞系产生基因转移载体。本文中的“基因转移载体”通常意味着所有载体，其中一种或多种治疗基因可转移到或引入所需的靶细胞，特别是具有该性能的病毒载体。另外，可用永久性羊水细胞系产生腺病毒突变株。“腺病毒突变株”意味着在E1A和/或E1B中至少具有一个突变的腺病毒。然而在一个优选例中，与腺病毒基因转移载体相反，它们不携带任何治疗基因。其典型的例子是不表达E1B 55kD蛋白的腺病毒突变株(例如腺病毒突变株d1520(Barker等，Virology156，107-121，1987))。不表达E1B 55kD蛋白的腺病毒突变体对于肿瘤病的治疗具有极大利益，因为病毒突变株唯一在肿瘤细胞中表达，但不在或以可忽略的程度在原代正常细胞中表达(Bischoff等，Science274，373-376，1996；Kirn等，Nature Med.4，1341-1342，1998)。

优选实施例是永久性羊水细胞系产生腺病毒载体、AAV(腺病毒相关病毒)载体、反转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒-AAV嵌合载体、腺病毒-反转录嵌合载体和/或腺病毒-慢病毒嵌合载体的用途。还可以是制备疱疹病毒载体的用途。

AAV载体通常仅含AAV的ITR和一些邻接的非编码AAV序列。它们携带外源DNA的能力大约是4.5kb。如上所述，存在各种产生重组AAV载体的系统。对于这些系统相同的是提供了重组载体复制、表达和包装必需的成分。特别是，这些载体含有编码AAV rep和cap蛋白和腺病毒辅助病毒功能的表达盒。AAV产生必需的腺病毒辅助病毒功能是E1A、E1B、E2、E4和VA基因。在表达E1A和E1B的羊水细胞系中提供了E1A和E1B功能，因此可用于产生AAV载体。可通过与腺病毒共转染或通过与表达E2、E4和VA的质粒共转染，或通过用腺病毒/AAV或单纯疱疹病毒/AAV杂交载体提供E2、E4和VA功能(Samulski等，见上；Allen等，见上；Tamayose等；见上；Chiorini等，见上；Ferrari等，见上；Salvetti等，见上；Xiao等，见上；Grimm等，见上；Zhang等，见上)。

反转录病毒载体，即衍生自反转录病毒的载体与基因治疗方法，例如用于中枢神经系统中转染的载体同样非常重要(Suhr等，Arch.Neurol.56，287-292，1999)。可在稳定产生载体的细胞系中，或通过瞬时转染产生反转录病毒载体。用于产生反转录病毒载体的各成分通常包括表达一种或多种结构蛋白和复制和整合蛋白的质粒，以及含有载体本身的质粒(Miller于：Retroviruses，Coffin，hughes，Varmus编，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1997，pp.437-473)。如果使用含有复制起始位点的质粒，例如复制的SV40起始位点，修饰羊水细胞系，从而稳定表达启动质粒复制的蛋白质。例如，就含有SV40复制起始点的质粒而言，用表达SV40T抗原的羊水细胞系。

慢病毒载体是衍生自慢病毒的载体(Naldini等，Science272，263-267，1996；Dull等，J.Virol.72，8463-8471，1998)。可在稳定产生载体的细胞系中，或通过瞬时转染产生慢病毒载体。

“嵌合载体”意味着产生从两种或多种不同病毒载体的核酸融合物的载体。根据本发明对于产生嵌合载体的描述，可用永久性羊水细胞系。在该系统中，例如，腺病毒载体，优选容量大的腺病毒载体携带具有整合性病毒的序列信息，该病毒衍生自例如反转录病毒或AAV。在靶细胞中转录后，携带治疗基因的整合性病毒从腺病毒背景中释放(例如在通过产生转导临近细胞并作为DNA稳定整合的感染性反转录病毒颗粒，产生的反转录病毒插入物的情况)。已描述过293细胞中产生的嵌合载体的例子，例如作为嵌合的腺病毒-反转录病毒载体(Feng等，Nature Biotech.15，866-870，1997)和作为腺病毒-AAV嵌合载体(Recchia等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，2615-2620，1999)。在表达E1A和E1B的羊水细胞系产生是优选的，因为与293细胞相反，不会通过同源重组产生复制竞争性载体。

腺病毒载体，即衍生自腺病毒的载体，对于在基因治疗范围内的转染载体特别重要。腺病毒载体可以是第一代腺病毒载体，第二代腺病毒载体，DNA容量大的腺病毒载体和/或缺失的腺病毒载体，它们是在永久性羊水细胞系的帮助下产生的。

a)第一代腺病毒载体的制备

第一代腺病毒载体的特征通常是缺失E1A和E1B基因。一些第一代腺病毒载体除了缺失E1A和E1B基因，还缺失E3区域。E3功能是负责腺病毒载体在细胞培养物中生长。

第一代腺病毒载体可以在表达E1A和E1Bd羊水细胞系中产生。这是通过优选用3-5感染单位/细胞(3-5MOI)感染表达E1A和E1B的细胞。在36-72小时后，细胞显示出细胞病变作用。用标准方法收集细胞。可用CsCl密度梯度离心或通过层析法纯化腺病毒载体。

b)第二代腺病毒载体的制备

第二代腺病毒载体的特征是缺失E1A和E1B基因。一些第二代腺病毒载体还缺失E3区域。除了缺失E1A和E1B基因，第二代腺病毒的特征是灭活和优选缺失至少一种其它必要的腺病毒基因。例如E2A基因、E2B基因和/或E4基因，或例如缺失E2功能与E4功能的组合。

为了制备第二代腺病毒载体，由于灭活和/或缺失载体本身不表达的功能必须由羊水细胞系提供。为此，稳定表达E1A和E1B的羊水细胞系可以通过转染表达编码一种或多种其它腺病毒功能的基因产物的表达盒，来稳定修饰。例如，为了制备除了缺失E1A和E1B基因，还缺失E2A、E2B和/或E4基因的第二代腺病毒载体，将合适的基因或多种基因通过与选择性标记一起转染引入表达E1A和E1B的羊水细胞系。除了表达E1A和E1B功能，还表达E2A、E2B和/或E4功能的细胞克隆然后可用于制备特定的第二代载体。E2和/或E4基因通常在组成型活跃或可调节的异源启动子转录的控制下。

c)大DNA容量的腺病毒载体的制备

大DNA容量的腺病毒载体的特征是缺失大部分或全部病毒编码序列。这些载体优选仅含有病毒ITR和病毒包装信号。通过反式辅助病毒提供腺病毒功能。描述了各种产生大DNA容量的腺病毒载体系统。对于迄今所述和使用辅助病毒的所有系统相同的是对应于复制缺陷、E1A和E1B缺失的腺病毒。辅助病毒含有完整的包装信号(Mitani等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，3854-3858，1995；Fisher等，Virology 217，11-22，1996；Kumar-Singh和Chamberlain，Hum.Mol.Genet.5，913-921，1996)，或突变的包装信号(Kochanek等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93，5731-5736，1996)。对于后一种情况而言，载体优选包装入病毒衣壳，因为辅助病毒含有弱化的包装信号，因此包装效率较低。另外，可在感染制备细胞系后用重组酶切除辅助病毒的包装信号(Parks等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，13565-13570，1996；Hardy等，J.Virol.71，1842-1849，1997)。例如，辅助病毒的包装信号可以侧接噬菌体P1的loxP识别序列。噬菌体P1的Cre重组酶的表达导致辅助病毒包装信号的切除。然而由于不存在包装信号，不发生辅助病毒的衣壳包装。通过与选择性标记一起转染入表达E1A和E1B的羊水细胞系，引入噬菌体P1的Cre重组酶。除了表达E1A和E1B功能，还表达噬菌体P1的Cre功能的细胞克隆然后可用于产生特定的大DNA容量的载体。

d)“缺失”腺病毒载体的制备

“缺失”的腺病毒载体被描述成具有位于病毒基因组中的噬菌体P1的loxP识别序列的第一代载体，该序列的位置是当感染表达Cre的293细胞时，通过在loxP识别序列之间重组除去了大部分病毒编码序列或所有病毒编码序列。这些载体的基因组大小约9kb。吸收外源DNA的能力也是约9kb(Lieber等，J.Virol.70，8944-8960，1996)。为了用于制备缺失的腺病毒载体，通过与选择性标记一起转染，将噬菌体P1的Cre重组酶基因引入表达E1A和E1B的羊水细胞系。除了表达E1A和E1B功能，还表达噬菌体P1的Cre功能的细胞然后可用于制备部分缺失的Ad载体。

e)向性改变的基因转移载体的制备

在一个优选例中，用永久性羊水细胞系制备向性改变的基因转移载体。病毒和衍生自该病毒的病毒载体的向性决定了具体细胞类型是否能被载体成功转导。将基因转移载体吸收入细胞是成功的将基因转移入该细胞的第一步。因此病毒载体的向性是体外或体内基因转移入具体细胞或组织有效性的主要因素。病毒表面(就腺病毒或AAV载体或慢病毒载体而言是衣壳)与靶细胞细胞膜的相互作用是吸收入特定细胞必需的。虽然病毒载体吸收入靶细胞的确切机制有时在不同载体之间变化，在所有的情况下病毒载体的表面结构(通常是蛋白质配体)和靶细胞上的结构(通常是受体或粘着分子)起到了主要作用。腺病毒载体的吸收通过例如受体介导的内吞作用发生。这限制了部分腺病毒衣壳与细胞受体结合。就衍生自Ad2或Ad5的腺病毒载体而言，根据现有知识通常纤维蛋白的把手结构域部分与柯萨基腺病毒受体(CAR)结合，部分五邻体基与ανβ3或ανβ5整合蛋白结合。根据现有知识，把手结构域与CAR的结合是载体粘附到靶细胞细胞膜上必需的，而五邻体基与整合蛋白的结合是载体内化入靶细胞必需的。

可用羊水细胞系制备向性改变的载体。这应用于例如第一和第二代腺病毒载体、大DNA容量的腺病毒载体、缺失的腺病毒载体、腺病毒嵌合载体、AAV载体、反转录病毒和/或慢病毒载体的产生。可用各种策略在羊水细胞系制备向性改变的载体。用于特定向性改变的载体的策略可随不同载体(例如腺病毒载体、AAV载体、反转录病毒载体)而改变。对于各种策略相同的是改变具体载体(就腺病毒和AAV病毒而言是病毒衣壳，就反转录病毒和慢病毒载体而言是病毒荚膜)的表面，从而改变载体与靶细胞的结合。修饰腺病毒载体的例子是：

a)在不同血清型之间交换纤维蛋白：这得到衣壳携带不同血清型的纤维蛋白的腺病毒载体。其例子是用衍生自血清型17(Zabner等，J.Virol.73，8689-8695，1999)或血清型9(Roelvink等，J.Virol.70，7614-7621，1996)的纤维蛋白交换腺病毒载体的天然纤维蛋白。其它例子是用衍生自血清型7a(Gall等，J.Virol.70，2116-2123，1996)或血清型3(Stevenson等，J.virol.71，4782-4790，1997；Krasnykh等，J.Virol.70，6839-6846，1996；Douglas等，Neuromuscul.Discard.7，284-298，1997)衍生的纤维蛋白交换腺病毒载体的天然纤维蛋白。

b)纤维蛋白的除去：可通过遗传操纵除去纤维蛋白，使载体吸收单独通过五邻体基或六邻体蛋白的相互作用发生(Falgout等，J.Virol.62，622-625，1988；Legrand等，J.Virol.73，907-919，1999)。

c)用肽修饰纤维蛋白的C末端：其例子是用聚赖氨酸肽(Yoshida等，hum.Gene Ther.9，2503-2515，1998：Wickham等，Nat.Biotechnol.14，1570-1573，1996；Wickham等，J.Virol.71，8221-8229，1997)，聚组氨酸残基(Douglas等，Nat.Biotechnol.17，470-475，1999)，或胃分泌素释放肽(Michael等，GeneTher.2，660-668，1995)修饰C末端。

d)通过插入肽修饰纤维蛋白的把手结构域部分：其例子是插入FLAG表位(Krasnykh等，J.Virol.72，1844-1852，1998)或插入RGD肽(Dmitriev等，J.virol.72，9706-9713，1998；Kasono等，Clin Cancer Res.5，2571-2579，1999)。

e)五邻体基的修饰：其一个例子是用LDV基序在载体与α4β1整合蛋白介导结合的帮助下替换五邻体基中的RGD基序(Wickham等，Gene Ther2，750-56，1995)。

f)六邻体蛋白的修饰：其一个例子是衍生自脊髓灰质炎病毒3型的表位插入(Crompton等，J.Gen.Virol.75，133-139，1994)。

可用于改变羊水细胞系中产生的载体的向性的另一种方法是基于使用介导载体与细胞膜结构结合的配体，例如细胞受体或粘附分子。这些配体可以是肽、蛋白质或抗体。配体可以与载体表面通过各种方法连接。可用抗体或化学交联反应产生配体与载体表面(就腺病毒或AAV载体而言是衣壳)的连接。在使用抗体时，可能用专一性针对载体衣壳的抗体(例如针对纤维蛋白把手结构域的)。另外，可以用专一性针对作为新表位引入载体衣壳的表位(例如FLAG表位或myc表位)的抗体。其例子是技术人员熟知的。用双特异性抗体的例子在Wickham等，J.Virol.70，6831-6838，1996中所述(抗-FLAG/抗-α-整合蛋白)；在Wickham等，Cancer Immunol.Immunther.45，149-151，1997；Harati等，Gene Ther.6，801-807，1999(抗-FLAG/抗E-选择蛋白)用于转导内皮细胞；在Miller等，Cancer Res.58，5738-5748，1998；Blackwell等，Arch.Otolaryngol.Head Neck Surg.125，856，863，1999(抗-Ad/抗-EGFR)用于转导肿瘤细胞；在Wickham等，J.Virol.71，7663-7669，1997(抗FLAG/抗-CD3)用于转导T细胞；在Tillman等，J.Immunol.162，6378-6383，1999(抗-CD40/抗-Ad)用于转达树突细胞。使用相对于和配体偶联的病毒衣壳决定簇具有专一性的单链抗体的例子描述于Watkins等，Gene Ther.4，1004-1012，1997；在Goldman等，Cancer Res.57，1447-1451，1997；Rancourt等，Clin.Cancer Res.4，2455-2461，1988；Gu等，Cancer Res.59，2608-2614，1999；Rogers等，Gene Ther.4，1387-1392，1997(抗-Ad/FGF2)用于转导表达FGF2-受体的肿瘤细胞；在Douglas等，Nat.Biotchnol.14，1574-1578，1996；Douglas等，Neuromuscular Disord.7，284-298，1997(抗-Ad/Folat)用于转导在细胞表面表达叶酸受体肿瘤细胞。

就例如通过在Ad5的纤维蛋白的把手结构域中引入配体，除去了天然向性，用其它向性代替的基因转移载体而言，可能必须通过优选稳定表达识别新配体的受体，来修饰永久性羊水细胞系(Douglas等，Nat.Biotechnol.17，470-475，1999)。永久性羊水细胞系也可能用于产生在产生一种或多种结构蛋白质中具有缺陷的基因转移载体。可通过在永久性羊水细胞系中补偿基因转移载体的具体缺陷进行。例如，可在补偿纤维蛋白缺陷的羊水细胞系中产生在纤维蛋白的基因编码中具有突变的腺病毒载体。可通过在羊水细胞系中引入纤维表达盒，在该羊水细胞系中稳定或可诱导表达纤维蛋白实现(Von Seggern等，J.Gen.Virol.79，1461-1468，1998)。羊水细胞系中表达的纤维蛋白可以是天然的、未修饰的纤维蛋白或也可以是改变的，例如向性改变的纤维蛋白(Von Seggern等，见上)。也可能在永久性羊水细胞系中产生完全缺乏纤维蛋白的腺病毒载体(Legrand等，J.virol.73，907-919，1999；Von Seggern等，J.Virol.73，1601-1608，1999)。

使用表达E1A和E1B的羊水细胞系是优选的，因为与293细胞相反，没有通过同源重组产生的复制-竞争性载体。在用羊水细胞系制备基因转移载体方面的一个具体实施例中，该细胞系是本发明的细胞系。

治疗性基因

可由转化的羊水细胞，即永久性羊水细胞系中产生的载体编码和表达的基因产物，特别是治疗性基因产物可以是例如任何肌肉蛋白质、凝血因子、膜蛋白或细胞周期蛋白。可用转化的羊水细胞产生的载体表达的蛋白质的例子是肌营养不良蛋白(Hoffman等，Cell 51，919，1987)、凝血因子VIII(Wion等，Nature 317，726，1985)、囊性纤维变性跨膜调控蛋白(CFTR)(Anderson等，Science 251，679，1991)、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)(Murakami等，J.Biol.Chem.，263，18437，1988)、α1-抗胰蛋白酶(Fagerhol等，于：Hum.Genet.，vol.11，Harris编，Plenum，New York，p.1，1981)。编码蛋白质的基因是已知的，可从基因组或cDNA库中克隆出来。这些基因的例子是肌营养不良蛋白基因(Lee等，Nature 349，334，1991)、凝血因子VIII基因(Toole等，Nature 312，342，1984)、CFTR基因(Rommens等，Science245，1059，1989，Riordan等，Science 224，1066，1984，Riordan等，Science245，1066，1989)、OTC基因(Horwich等，Science 224，1066，1984)和α1-抗胰蛋白酶基因(Lemarchand等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，6482，1992)。

其它由转化的羊水细胞产生的载体表达的基因的例子是治疗肿瘤病的p53基因(Wills等，Hum.Gene Ther.5，1079，1994，Clayman等，Cancer Res.55，1，1995)、用于治疗血管增生疾病的Rb基因(Chang等，Science 267，518，1995)、或单纯疱疹病毒(HSV)1型用于治疗肿瘤病的胸腺嘧啶激酶基因。转化的羊水细胞中产生的载体表达的基因不是编码蛋白质必需的。因此例如可以表达功能性RNA。这些RNA的例子是反义RNA(Magrath，Ann.Oncol.5，Suppl 1)，67-70 1994，Milligan等，Ann.NY Acad.Sci.716，228-241，1994，Schreier，Pharma.Acta.Helv.，68，145-159 1994)，和催化性RNA(Cech，Biochem.Soc.Trans.21，229-234，1993；Cech，Gene 135，33-36，1993；Long等，FASEB J.7，25-30，1993；Rosi等，Pharm.Therap.50，245-254，1991)。

转化羊水细胞中产生的载体除了治疗基因，还可以含有任何报道基因，从而能更好的跟踪载体的表达。报道基因的例子是本领域已知的，并包括例如β-半乳糖苷酶基因(fowler等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74，1507-1977)。

可在转化的羊水细胞中产生的载体可含有一种以上的基因。可在这些载体中产生的基因的最大数目由特定载体的吸收能力和基因大小而定。

调控在转化的羊水细胞中产生的载体的治疗性基因的表达的启动子选择不是关键的。显示出组成型、组织特异性或可调节活性的病毒或非病毒启动子可用于病毒蛋白质或功能性RNA。SV40或巨细胞启动子(Andersson等，J.Biol.Chem.264，8222-8229，1964)可用于例如组成型表达基因。使用突变肌酸激酶(MCK)启动子允许蛋白质或功能性RNA在骨骼肌肉和心肌中组织特异性表达。可用可调节系统定量和定性控制基因表达(Furth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，9302-9306，1994)。

可以在能在转化的羊水细胞中产生的载体中包括影响受体细胞内载体行为的基因元件。这些元件的例子是促进载体DNA核靶向的元件(Hodgson，Biotechnology13，222-225，1995)。

可在体外或在体内运用该方法所制备的载体。体外基因转移发生在体外，例如在培养物中的细胞中或为了基因转移从身体取出的原代细胞中加入载体。就体内基因转移而言，可以各种方法，视要诱导的组织施用载体颗粒。例子是动脉或静脉血管全身注射，直接注射入相关组织(例如肝脏、大脑、肌肉)，滴注入相关器官(例如肺或胃肠道)或直接涂布用于表面(例如皮肤或膀胱)。

下列图和实施例是为了详细说明本发明，而不是为了限制它。

附图描述

图1显示了克隆的总结：图1A图解描述了质粒STK146的克隆步骤。图B描述了腺病毒5型基因组左侧末端约15％，包括E1 RNA、编码区、E1A和E1B转录的起始位点，和剪接供体和剪接受体位点以及克隆重要的聚腺苷酸序列。重要的是Ad5碱基对3511的剪接供体位点在质粒STK146克隆中被保留，但剪接受体位点和聚腺苷酸信号已被SV40的相应功能代替。另外，Ad5的E1A启动子被PGK启动子替换。因此STK146含有来自碱基对505-5322的Ad5序列，用该质粒转化的细胞系不含存在于第一代或第二代腺病毒载体或在loxP辅助病毒中的Ad5序列。

图2显示了通过用腺病毒E1功能转化的羊水细胞获得的胰岛细胞(图2A和图2B)，和用单细胞克隆出的细胞系N52.E6(DSMZ ACC2416；图2C)和N52.F4(图2D)。此时应注意细胞系和单细胞克隆与羊水细胞形态不同，它们一般更小，无生长接触抑制。

图3通过RNA印迹显示STK146与8种不同E1转化的羊水细胞系的整合状态。

图4在表格中显示在各种克隆细胞系中产生第一代腺病毒载体，基于bfu(蓝色生成单位)/细胞和适当的细胞系基于噬斑形成的转染效力。

图5显示Ad5的E1A和E1B蛋白质在11个克隆的羊水细胞系的表达(蛋白质印迹)。

图6显示重组腺病毒载体在两种克隆的细胞系N52.E6和N52.F4中合成的时间过程。图6A显示第一代腺病毒载体的合成，图6B显示大DNA容量的腺病毒载体的合成。

实施例

1.克隆

图1描述了克隆的总结。

a)质粒STK136

质粒STK136含有[Bluescript KsII(Stratagene)中的小鼠磷酸甘油酸激酶启动子(SEQ NO.1；Adra等，Gene 60，65-74，1987)，如下产生：

用EcoRV消化3.5微克质粒PGK-hAAT(Kay等，Hepatology 21，815-819，1995)，按大小在1.5％琼脂糖凝胶中分级。在溴乙锭染色后寻找含有PGK启动子的0.5kb条带，切割出来，电洗脱DNA。同时，用EcoRV和HincII消化pBluescript KSII，对游离DNA末端去磷酸化。然后用苯酚/氯仿抽提后和乙醇沉淀后，等摩尔量连接这些DNA片段，转化到超感受态XL-2Blue细菌(Stratagene)中。用限制性消化确定质粒克隆的特征，从其得到的质粒称为STK136(分离物#6)。

b)质粒STK137

质粒STK137含有完整的Ad5 E1表达盒，包括SV40的3’碱基和聚腺苷酸信号，如下产生：

Ad5序列bp505-841(SEQ NO.2)的PCR扩增(PCR I)

用寡核苷酸27759(SEQ NO.3)和27634(SEQ NO.4)各400纳克、0.2mM dNTP和1.25U Pfu聚合酶在10mM KCl中、10mM(NH₄)₂SO₄、20mM Tris/HCl，pH8.75，2mMMgSO₄、0.1％Triton X-100、100微克/毫升BSA在下列条件下扩增10纳克质粒pXC1(Microbix)：

I 94℃10分钟，

II 94℃1分钟，50℃2分钟，72℃3分钟，

III 72℃10分钟。

重复步骤II 15次。用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)如厂商所述纯化DNA，用乙醇沉淀。

为了克隆PCR片段，用EcoRV消化2.5微克pBluescript KSII，对游离DNA末端去磷酸化，与等摩尔的PCR片段连接，转化入XL-2Blue细胞。其中得到的质粒在下文称为#1。

Ad5序列bp3328-3522(PCRII)(SEQ NO.5)的PCR扩增：

用寡核苷酸27635(SEQ NO.6)和27636(SEQ NO.7)各400纳克在上述条件下扩增10纳克质粒pXC1(Microbix)。PCR后，用苯酚/氯仿抽提DNA，用乙醇沉淀，用EcoRI消化，用苯酚/氯仿抽提，沉淀并溶解在30微升TE中。

在质粒pGL2-Basic bp1978-2749(PCRIII)(SEQ NO.8)的帮助下PCR扩增SV40的3’剪接和聚腺苷酸信号：

用寡核苷酸27637(SEQ NO.9)和27638(SEQ NO.10)各800纳克、0.4mM dNTPS和2.5U Pfu聚合酶在上述条件下扩增20纳克质粒pGL2-Basic(Promega，Genbank/EMBL Acc.No.：X65323)。PCR后，用苯酚/氯仿抽提DNA，用乙醇沉淀，用EcoRI消化，再次用苯酚/氯仿抽提，用乙醇沉淀，溶于30微升TE。然后在50微升体积中连接PCR II和III的各10微升DNA，用乙醇沉淀并用BamHI在100微升体积中消化。再次苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀后，DNA与等摩尔量的pBluescriptKSII DNA连接，后者之前已用BamHI消化并去磷酸化。得到的质粒在下文中称为#29。为了进一步克隆，用SacII和BglII消化质粒DNA #29，去磷酸化，用苯酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀。同时，用BglII和SacII消化3.5微克pXCl，用电泳和电洗脱分级2.9kb片段。连接等摩尔量的两种DNA，转化入XL-2 Blue细胞。从其得到的质粒在本文下文中称为#5。对于STK 137的最终克隆，用HincII和BspEI消化#1，洗脱约350bp的片段。作为载体DNA，用KspI(SacII的同裂酶)消化质粒#5，用T4聚合酶补满末端，进行苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀。然后用BspEI消化DNA，末端去磷酸化，再次进行苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀。两种DNA连接并转化入XL-2 Blue细胞。从其得到的质粒称为STK137(分离物#34)。

c)质粒STK146(SEQ NO.18)

质粒STK146含有小鼠PGK启动子，Ad5完整的E1区域(bp505-3522)和SV40的3’剪接和聚腺苷酸信号。

为了克隆，用EcoRV和BamHI消化4微克STK137，并电泳分级，电洗脱3.7kb片段。另外，用EcoRV和BamHI消化3.3微克STK136，去磷酸化，苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀。连接等量的两种质粒，并转化成XL-2Blue细胞。其中得到的质粒称为STK139。STK139的最终序列分析揭示在bp2613的突变(此处的数字按照Ad5 DNA序列)，导致酪氨酸到精氨酰胺的氨基酸交换(2613TAC→GAC)。因此，用pXC1的BstEII(bp1915)-BglII(bp3328)片段替换了STK139中含有突变的片段。这是通过用BstEII和BglII消化STK139，去磷酸化，苯酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，用电泳分级，电洗脱5.8kb片段进行的。pXC1也用BstEII和BglII类似消化，电泳分级，电洗脱出1.4kb片段。连接和转化后，对来自4个质粒克隆的DNA测序；两个在bp2613含有正确的序列。2号分离物完全测序，在下文中称为STK146。

d)STK146的序列分析

用10pmol下列序列引物在标准条件下对500纳克STK146#2进行测序：

引物28231 Ad5 nt.901-920 (SEQ NO.11)28232 Ad5 nt.1301-1320 (SEQ NO.12)28233 Ad5 nt.1701-1720 (SEQ NO.13)28234 Ad5 nt.2100-2119 (SEQ NO.14)28235 Ad5 nt.2500-2519 (SEQ NO.15)28236 Ad5 nt.2853-2872 (SEQ NO.16)28237 Ad5 nt.3249-3268 (SEQ NO.17)

2.原代羊水细胞和细胞系的培养

所有细胞培养试剂、培养基和血清购自GIBCO Life Technologies。在一些实验中用作对照的细胞系293在含有10％胎牛血清(FCS)、1x青霉素/链霉素的改良Eagle’s培养基(MEM)(100x，Cat#10378-016)中，37℃，95％湿度和5％CO2下培养。用从羊水通过作为产前诊断一部分的羊水穿刺获得的原代胚胎细胞产生新的E1转化的细胞系。活体检查后，用常规方法将细胞接种在塑料培养瓶中，在Ham’s F10培养基(营养混合物Ham’s F10和L-谷氨酰胺，Cat#31550-023)、2.5微克/毫升Fungizione(两性霉素B，Cat#15290-018)中培养。一些细胞附着在细胞培养瓶底部并增殖。约2周后得到足够染色体分析的细胞。建立染色体组型后，用数量和结构上正常的羊水细胞培养物产生细胞系。在各种实验中使用之前3、6或7周通过羊水穿刺获得的三种不同来源的细胞。所用的营养培养基是Ham’s F10培养基、10％FCS、2％UltraserCr、1x抗生素/抗真菌素溶液、2.5微克/毫升Fungizione。培养条件是37℃、95％湿度和5％CO₂。转染7天后，在Ham’s F10培养基、10％FCS、1x青霉素/链霉素中进一步培养羊水细胞。单细胞克隆产生后，将这些转移到新的皿中，进一步在含有10％FCS、1x青霉素/链霉素的α-MEM中培养。

3.羊水细胞的转染和转化

为了转染，将羊水细胞以2-5×10⁵/皿的密度接种在细胞培养皿(直径60毫米，表面积22.1平方厘米)中，翌日转染。为了转染，用ScaI消化20微克质粒STK146，用苯酚/氯仿抽提，用乙醇沉淀，吸收入20微升TE中，得到0.5微克/微升浓度的DNA。在开始的实验中，取出后分别在5个培养皿中用Effectene转染试剂盒如厂商(Qiagen)所述按如下转染羊水细胞3-7周：

将用ScaI消化的4微克STK146与146微升EC缓冲液混合。加入8微升增强剂后，简单振摇溶液，室温保温5分钟。然后加入25微升Effectene，振摇10秒钟后，室温再保温10分钟。在此期间，仔细从培养基上吹去细胞，用4毫升新鲜营养培养基(见上文节2)替换。培养完成后，将转染混合物与1毫升新鲜营养培养基混合，小心滴加到细胞上。再次如上所述培养细胞。转染7日后，将各培养皿中的细胞转移到更大的培养皿(直径150mm，表面积147.8mm²)中。这是通过小心吹去培养基，用PBS洗涤细胞，在胰蛋白酶中脱离，转移到新的培养皿中，进一步如节2所述培养18-22天，然后可清楚看见转染克隆细胞的小岛，并清楚的与羊水细胞以形态区分(图2A、2B)。在未转化的羊水细胞培养物中的主要部分由较大的细胞构成，显示生长的接触抑制。转化的单细胞克隆中的细胞小得多，生长更迅速，不显示生长的接触抑制。它们长成由较小的细胞彼此靠紧形成的小岛，在光学显微镜下是明显的，可毫不困难的鉴别出来。挑出这些细胞小岛，转移到含上述新的培养皿(直径60mm)中。再次生长后，将细胞系转移到147.8平方厘米的细胞培养皿中，进一步如2所述培养。在第一次转移到147.8厘米平方的细胞培养皿中后，计数细胞传代数。开始，除去后3-7周被转染的约40个细胞克隆进一步培养。然后即延长培养后一些细胞克隆的形态剧烈变化，它们显示生长特征不稳定。进一步实验限于进一步培养和分析8种形态稳定的细胞系。这些称为如下：GS.A55(取出后3周转染的羊水细胞产生的)，GS.N21，GS.N24，GS.N27，GS.N49，GS.N51，GS.N52，GS.N53(取出后从转染7周的羊水细胞获得)。

第一次传代中，所有细胞克隆显示相同的形态，但是随后传代这发生了改变。因此例如，一些细胞克隆改变，表现出非常圆的形状，在进一步传代后不再有粘性。其它细胞克隆显示出广泛的空泡形成，但这对其生长不出现什么作用。单细胞克隆后，所有细胞系显示均一的形态，例如N52.EG和N52.F4具有上皮外观。它们的生长速率和细胞密度与293细胞相当。

4.转化的效力

为了确定用E1功能的转化更有效，如节3所述转染各含有2-5×10⁵个细胞的7个新培养皿。在转染仅24小时后转移细胞到147.8平方厘米的培养皿中，进一步在Ham’s F-10培养基、10％胎牛血清、2％UltroserG、1x抗生素/抗真菌溶液、2.5微克/毫升Fungizione中培养5天，在Ham’s培养基、10％胎牛血清、1x青霉素/链霉素溶液中再次培养25天。含有未转染细胞的培养皿在相同条件下作为对照培养。同时，计数一次转化事件获得的形态清晰可辨(见图2A、2B)的集落。在所有除了未转染对照平板以外的细胞培养皿中对单细胞克隆计数。平均每个平板有4个细胞克隆，对应于转化效力0.5-1×10⁵细胞。

5.单细胞克隆

如上所述，一些细胞系显示不同的形态特征，因此对于每种细胞系建立了达10个单细胞系。在这些情况下各细胞系的传代不同：GS.A55：P17，GS.N21：P24，GS.N24：P20，GS.N27：P19，GS.N49：P21，GS.N51：P39，GS.N52：P22，GS.N53：P20。为此，将细胞与细胞培养皿分开，以5×10⁶细胞/毫升浓度以营养培养液稀释1∶1000，1∶50,000和1∶500,000。将来自所有稀释液的100微升细胞接种到96孔板中，再次培养单一细胞得到的明显细胞克隆。图2C显示细胞系GS.N52.E6(DSMZNo.)和图2D显示细胞系N52.F4；两种细胞克隆都衍生自原细胞系GS.N52。

6.E1细胞系的特征确定

a)RNA印迹分析

进行RNA印迹分析以调查细胞系E1区域的整合状态。这是用来自所有8个E1羊水克隆的分离的基因组DNA进行的(见节5)，各5微克用EcoRV消化，电泳分级并转移到尼龙膜上。EcpRV在E1表达盒中切割一次。与放射性标记STK146的杂交确定了所有克隆中整合1-2个STK146。图3显示E1细胞克隆的整合模式。对于所有克隆明显有主要的两条高分子量条带，表明单一拷贝的整合。细胞克隆GS.N24和GS.N52各显示另一条强度较大的条带，可能表明串联STK146拷贝的整合。由于细胞克隆中没有任何比用ScaI和EcoRV消化的STK146更小的拷贝，提出所有整合物是完整而且无缺失的。

b)重组腺病毒的产生

单一细胞克隆后，测试细胞克隆制备重组腺病毒的能力。这是通过在约70％汇合的24-孔板中，以约5MOI(感染复数)的Adβgal(重组第一代腺病毒载体)感染各细胞系的3-5个单细胞克隆。感染后48小时，冻融三次裂解细胞，感染293细胞，随后染色细胞分析Adβgal量(MacGregor等，于：Gene Transfer and ExpressionProtocols，Murray编，Humana，Clifton，NJ，vol.7，pp.217-235，(1991))检测β-半乳糖苷酶产生(图4)。该方法得到仅近似的重组腺病毒产量，因为细胞数量和因此所用的病毒数可能在不同的细胞克隆中，由于其大小和生长速度是不同的。在进一步的实验中更确切的分析了在该第一个测试中得到最大产率的细胞克隆。这是通过在3个皿(直径100毫米，表面积60平方厘米)上接种3×10⁷个细胞进行的。翌日进行细胞计数，基于发现的细胞数用5MOI Adβgal感染。感染后48小时，收集细胞并冻融裂解3次，感染293细胞，随后染色分析Adβgal的量。图4描述了结果。

c)转染效力

测试某些克隆的细胞系的蚀斑形成。这是通过用2微克感染性质粒GS66用磷酸钙法转染约70％汇合的细胞培养皿进行的。质粒GS66含有在核苷酸440-3523的E1区域具有缺失的完整腺病毒基因组。在该质粒中腺病毒末端重复序列(ITR)侧接SwaI限制性切割位点，从而感染性病毒和蚀斑可以在转染SwaI-消化的质粒后产生。转染约24小时后，用10毫升MEM、1％琼脂糖、0.5x青霉素/链霉素、0.05％酵母抽提物覆盖细胞。在37℃，95％湿度，5％CO₂下培养约1周，蚀斑可见。图4显示每种情况下2个独立的转染的平均计算出的蚀斑数。

d)Ad5的E1A和E1B功能表达

用单克隆抗体的蛋白质印迹分析检测Ad5-E1A和E1B-21kD蛋白在克隆的细胞系中的表达。

在PBS/1mM EDTA中仔细从细胞培养物(直径10厘米)上分离细胞，沉淀并吸收在150微升50mM的Tris/HCl，PH8，140mM NaCl，0.5％NP40，4mM EDTA，2mM EGTA，0.5mM PMSF，5％甘油中。额外的Dounce研磨裂解细胞，13,000rpm离心10分钟，用蛋白质测定试剂盒(BIORAD，Microassay Procedure)测定上清液中的蛋白质浓度。在12％SDS聚丙烯酰胺凝胶上分级10微克蛋白质，转移到硝基纤维素膜(HybondECL.Amersham Pharmacia Biotech)上，用抗E1A或抗E1B 21kD抗体(Calbiochem，稀释1∶300)孵育。翌日，洗涤印迹并与二抗-小鼠抗体(E1A)或偶联了辣根过氧化物酶的抗-大鼠抗体(E1B)杂交。与等体积的增强溶液1和2孵育(ECL，AmershamPharmacia Biotech)开始辣根过氧化物酶反应，简单接触X-光胶片显示发生的光化学反应。图5显示了蛋白质印迹分析的结果。

e)重组的第一代腺病毒载体和具有大DNA容量的腺病毒载体产生的时间过程

两个克隆的细胞系N52.E6和N52.F在上述实验中显示最高的重组第一代腺病毒载体产率。关于时间过程的进一步了解对于腺病毒载体的最佳生产是重要的，尤其是当这些细胞适应悬浮培养，而且不能用细胞病变效果跟踪感染的成功时。对于该分析，用5MOI Adβgal感染各含3×10⁶个细胞的皿(直径6厘米)，在感染后指定的时间收集。再次感染293细胞，染色并计数蓝细胞测定重组腺病毒的数量(图6A)。

在将来还要用新的细胞系产生大DNA容量的腺病毒载体(见上)。这些腺病毒载体的产生需要辅助病毒，对裂解感染周期反式提供缺失的功能和蛋白。用loxP识别序列和细胞系在感染后表达的Cre重组酶除去这些辅助病毒的包装信号。因此在将来的实验中新的E1转化的细胞系要用表达Cre的质粒转染，重组酶将稳定表达。

已在之前的实验中测试了是否新的E1羊水细胞也能产生大DNA容量的腺病毒载体，和其生产动力学和制备的载体量是否相当于用现存表达Cre的293细胞。为此，用5MOI loxP辅助病毒和10MOI AdGS46(β-gal表达的DNA容量的腺病毒载体)感染各含3×10⁶细胞的细胞系N52.E6和N52.F4的几个培养皿，在感染后指定的时间收集。再次通过感染293细胞，染色并计数蓝细胞确定具有大DNA容量的表达β-gal的腺病毒载体的产率(图6B)。在羊水细胞中合成的大DNA容量的腺病毒载体量相当于在表达Cre的293细胞中产生的(数据未显示)。

                       序列表<110>科全耐克，S.(Kochanek，S.)<120>永久羊水细胞系，其产生和产生基因转移载体的用途<160>18<170>Word 6.0，PC-DOS/MS-DOS<210>1<211>513<212>DNA<213>小鼠磷酸甘油酸启动子<400>1gaattctacc gggtagggga ggcgcttttc ccaaggcagt ctggagcatg cgctttagca  60gccccgctgg cacttggcgc tacacaagtg gcctctggcc tcgcacacat tccacatcca  120ccggtaggcg ccaaccggct ccgttctttg gtggcccctt cgcgccacct tctactcctc  180ccctagtcag gaagttcccc cccgccccgc agctcgcgtc gtgcaggacg tgacaaatgg  240aagtagcacg tctcactagt ctcgtgcaga tggacagcac cgctgagcaa tggaagcggg  300taggcctttg gggcagcggc caatagcagc tttgctcctt cgctttctgg gctcagaggc  360tgggaagggg tgggtccggg ggcgggctca ggggcgggct caggggcggg gcgggcgccc  420gaaggtcctc cggaggcccg gcattctcgc acgcttcaaa agcgcacgtc tgccgcgctg  480ttctcctctt cctcatctcc gggcctttcg acc                               513<210>2<211>336<212>DNA<213>Ad5<400>2gagtgccagc gagtagagtt ttctcctccg agccgctccg acaccgggac tgaaaatgag  60acatattatc tgccacggag gtgttattac cgaagaaatg gccgccagtc ttttggacca  120gctgatcgaa gaggtactgg ctgataatct tccacctcct agccattttg aaccacctac  180ccttcacgaa ctgtatgatt tagacgtgac ggcccccgaa gatcccaacg aggaggcggt  240ttcgcagatt tttcccgact ctgtaatgtt ggcggtgcag gaagggattg acttactcac  300ttttccgccg gcgcccggtt ctccggagcc gcctcac                           336<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>3atcgagtgcc agcgagtaga gttttctcc                                     29<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>4gtgaggcggc tccggagaac cg                                            22<210>5<211>216<212>DNA<213>Ad5<400>5ctcgcggatc cagatctgga aggtgctgag gtacgatgag acccgcacca ggtgcagacc   60ctgcgagtgt ggcggtaaac atattaggaa ccagcctgtg atgctggatg tgaccgagga   120gctgaggccc gatcacttgg tgctggcctg cacccgcgct gagtttggct ctagcgatga   180agatacagat tgaggtactg aaatggaatt ccggtc                             216<210>6<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>6gacgccaatt ccatttcagt acctcaatct gt                                 32<210>7<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>7ctcgcggatc cagatctgga aggtgctgag g                                  32<210>8<211>782<212>DNA<213>SV40(pGL2basic)，Genbank X65323<400>8cgactgaatt caatttttaa gtgtataatg tgttaaacta ctgattctaa ttgtttgtgt  60attttagatt ccaacctatg gaactgatga atgggagcag tggtggaatg cctttaatga  120ggaaaacctg ttttgctcag aagaaatgcc atctagtgat gatgaggcta ctgctgactc  180tcaacattct actcctccaa aaaagaagag aaaggtagaa gaccccaagg actttccttc  240agaattgcta agttttttga gtcatgctgt gtttagtaat agaactcttg cttgctttgc  300tatttacacc acaaaggaaa aagctgcact gctatacaag aaaattatgg aaaaatattc  360tgtaaccttt ataagtaggc ataacagtta taatcataac atactgtttt ttcttactcc  420acacaggcat agagtgtctg ctattaataa ctatgctcaa aaattgtgta cctttagctt  480tttaatttgt aaaggggtta ataaggaata tttgatgtat agtgccttga ctagagatca  540taatcagcca taccacattt gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacctc ccacacctcc  600ccctgaacct gaaacataaa atgaatgcaa ttgttgttgt taacttgttt attgcagctt  660ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac  720tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tggatccgtc  780ga                                                                 782<210>9<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>9cgactgaatt caatttttaa gtgtataatg tg                                32<210>10<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>10tcgacggatc cagacatgat aagatac                                      27<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>11ccttgtaccg gaggtgatcg                                              20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>12tggcgcctgc tatcctgaga                                                20<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>13tacatctgac ctcatggagg                                                20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>14caagaatcgc ctgctactgt                                                20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>15ggctgcagcc aggggatgat                                                20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>16agggttcggg gctgtgcctt                                                20<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>17cctgaacggg gtgtttgaca                                                20<210>18<211>7090<212>DNA<213>质粒STK146<400>18gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt  60caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa  120ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt  180gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt  240tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt  300ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg  360tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga  420atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa  480gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga  540caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa  600ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca  660ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta  720ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac  780ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaat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