用于制备抗菌肽的山羊成纤维细胞系与鸡输卵管上皮细胞系的建立

摘要

抗菌肽因具有广谱杀菌、抗肿瘤、抗病毒和抗原虫等特点而成为新型抗生素类药物的研究热点。为了加快抗菌肽的生产速度，提高抗菌肽的产量，本研究在克隆获得中国林蛙皮肤抗菌肽基因Temporin-1CEa的基础上，构建山羊乳腺特异性表达载体pBC1-neo-Temporin-1CEa，将其线性片段导入山羊成纤维细胞中，通过G418筛选获得转抗菌肽基因的山羊成纤维细胞系;利用克隆获得的鸡输卵管上皮特异表达调控序列5OV和Temporin-1CEa基因，构建鸡输卵管特异性表达抗菌肽的双顺反子逆转录病毒载体pMX-GFP-5OV-Temporin1CEa;为了建立鸡输卵管基因表达调控的体外模型，在建立鸡输卵管封闭内部消化法(Obturated Interior Digesting，OID法)的基础上建立了鸡输卵管上皮细胞系;采用脂质体法将pMX-GFP-5OV-Temporin1CEa载体转染至鸡输卵管上皮细胞中，检测其在细胞中的表达情况。本研究的主要结果如下:
　　1.山羊乳腺特异性表达载体的构建根据GenBank中的参照序列克隆Temporin-1CEa基因并将其连入pBC1-neo载体中，PCR鉴定、酶切鉴定及测序结果均显示成功获得山羊乳腺特异性表达载体pBC1-neo-Temporin-1CEa;
　　2.转抗菌肽基因山羊成纤维细胞系的建立由山羊耳缘组织获得的原代成纤维细胞传代培养后转入pBC1-neo-Temporin-1CEa线性片段，用含有300μ g/ml G418的培养基筛选出转基因山羊成纤维细胞;对获得的细胞进行形态观察，以及群体倍增时间、冷冻复苏、染色体核型、细胞免疫组织化学等检测，结果显示本研究获得了具有良好生长特性及遗传稳定性的转抗菌肽基因的山羊成纤维细胞系;
　　3.双顺反子逆转录病毒载体的构建根据GenBank中的参照序列扩增技术克隆鸡卵清蛋白基因的5'调控序列(5OV)，并将其与Temporin-1 CEa基因、GFP基因连入pMX载体中，PCR鉴定、酶切鉴定及测序结果均显示成功构建pMX-GFP-5OV-Temporin1 CEa载体;
　　4.鸡输卵管上皮细胞系的建立本研究建立了分离培养鸡原代输卵管上皮细胞的OID法，并对获得的原代上皮细胞进行了传代培养、群体倍增时间、冷冻复苏、染色体核型、细胞免疫组织化学、Marker基因表达及转染能力等一系列的鉴定与检测。其结果为:与现有的剪切法和刮取法无法获得鸡输卵管上皮细胞系不同，采用OID法可以建立鸡输卵管上皮细胞系，且细胞具有正常的形态、良好的生长特性及稳定性的遗传特性;表明本研究成功建立了鸡输卵管上皮细胞系，并命名为XYF-142;
　　5.双顺反子逆转录病毒载体与XYF-142细胞模型的检测将pMX-GFP-5OV-Temporin-1CEa载体转染至XYF-142细胞中后，观察GFP基因的表达情况并检测转染细胞中Temporin-1CEa基因的转录情况;其结果显示不仅在转染细胞中观察到GFP基因的表达，而且在转染细胞总RNA中检测到Temporin-1CEa基因的转录。表明本研究构建的鸡输卵管特异性表达Temporin-1CEa基因的逆转录病毒载体pMX-GFP-5OV-Temporin-1CEa具有双顺反子特性;与此同时，表明本研究建立的鸡输卵管上皮细胞系XYF-142可以作为外源基因在鸡输卵管中表达调控的体外模型。
　　综上所述，本研究成功获得转抗菌肽基因的山羊成纤维细胞系，并成功构建鸡输卵管特异性表达Temporin-1CEa基因的双顺反子逆转录病毒载体pMX-GFP-5 OV-Temporin-1CEa，及可作为外源基因在鸡输卵管中表达调控的体外模型——鸡输卵管上皮细胞系XYF-142。本研究为进一步开展通过山羊乳汁或鸡蛋获得中国林蛙抗菌肽的相关研究奠定坚实基础。

目录

摘要

1 绪论

1．1 抗菌肽

1．1．1 抗菌肽的研究史

1．1．2 抗菌肽的多样性

1．1．3 抗菌肽的作用特点

1．1．4 抗菌肽的作用机制

1．1．5 Temporin抗菌肽家族和Temporin-1CEa

1．2 转基因动物

1．2．1 转基因技术

1．2．2 基因表达组织特异性调控元件

1．2．3 动物生物反应器

1．3 本研究的目的与意义

2 转抗菌肽基因山羊成纤维细胞系的建立

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 实验载体

2．1．3 试剂与设备

2．2 实验方法

2．2．1 乳腺特异性表达载体的构建

2．2．2 山羊成纤维细胞的培养

2．2．3 转基因山羊成纤维细胞系的建立

2．3 实验结果

2．3．1 乳腺特异性表达载体的鉴定

2．3．2 转基因山羊成纤维细胞系的建立

2．4 讨论

2．5 本章小结

3 鸡输卵管上皮细胞系的建立及双顺反子载体的检测

3．1 实验材料

3．1．1 实验动物

3．1．2 实验载体

3．1．3 试剂与设备

3．2 实验方法

3．2．1 双顺反子逆转录病毒载体的构建

3．2．2 鸡输卵管上皮细胞系的建立

3．2．3 双顺反子逆转录病毒载体及XYF-142细胞模型的检测

3．3 结果

3．3．1 双顺反子逆转录病毒载体的鉴定

3．3．2 鸡输卵管上皮细胞系的建立

3．3．3 双顺反子逆转录病毒载体及XYF-142细胞模型的检测

3．4 讨论

3．5 本章小结

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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