双基因共整合山羊乳腺上皮细胞系与成纤维细胞系的建立及转基因兔的获得

摘要

生长激素对于乳腺的发育具有调节作用，服用生长激素能够有效的提高泌乳奶牛的产奶量，当前研究主要是通过使生长激素在乳腺中过表达，在大型动物模型中提高其乳腺的发育水平，从而改进奶的产量。另一方面生长激素管理着β-casein受体的激活以及其表达水平的高低，研究表明，β-casein基因的HRE序列高度保守，在转基因时可以在不同动物中通用，是构建乳腺特异性表达载体的常用启动子元件，因而生长激素能够提高以β-casein为启动子的外源蛋白在乳腺细胞中的表达量。 本研究使用了以β-casein序列为启动予以及rhPA为外源基因的乳腺特异性表达载体PCL25/rhPA(PtPA)，目的是通过电转染的方法获得整合gGH与rhPA双基因整合的山羊胎儿成纤维细胞与乳腺上皮细胞，通过对双基因整合山羊乳腺上皮细胞的诱导表达结果进行分析，以及两种细胞分别作为供核细胞制备转基因重构胚的差异，研究gGH对rhPA表达量的影响与乳腺上皮细胞用于体细胞核移植的可行性。 本研究首先使用PCR方法从质粒中扩增出了山羊生长激素基因(gGH)，经序列比对无误后构建了乳腺特异性表达载体PCL25/gGH(PLGH)，并且使用本实验室保存的以山羊β-casein基因为调控序列的PCL25/rhPA((PtPA)乳腺特异性表达载体进行双基因的共整合实验。在共转染了山羊成纤维细胞与乳腺上皮细胞后，筛选出的双基因整合的乳腺上皮细胞进行催乳素的诱导，取上清进行ELISA的检测，研究gGH在山羊的细胞水平对rhPA表达量高低的影响。使用原核显微注射的方法制备转基因兔，同时注射两种质粒PtPA与PLGH，通过对兔的PCR检测，获得了双基因共整合的转基因兔。同时以两种细胞作为供核细胞制备转基因克隆胚，培养后观察克隆胚的生长与发育情况。 本研究共获得转基因兔4只，其中整合了gGH与rhPA双基因的转基因兔3只，1只雌性兔，2只为雄性。整合了gGH单基因的转基因兔1只，为雌性。共获得gGH与rhPA双基因整合的山羊胎儿成纤维细胞株15株，经PCR验证无误，获得gGH与rhPA双基因整合的山羊乳腺上皮细胞株67株，经PCR验证无误，ELISA检测后5株高表达rhPA。共制备以山羊胎儿成纤维细胞为共供核细胞的重构胚30枚，以山羊乳腺上皮细胞为供核细胞的重构胚25枚，前者的融合率为83.33％，后者为72.00％，以乳腺细胞进行供核的融合率明显低于使用成纤维细胞供核，但相差不大，说明山羊乳腺上皮细胞可以用于体细胞核移植制备转基因山羊。 本研究表明，gGH基因能提高以β-casein基因为调控序列的rhPA的表达，并且gGH在兔的体内并没有对兔的生长与发育产生影响。通过对山羊乳腺上皮细胞供核制备的重构胚融合情况的观察，发现山羊乳腺上皮细胞能够正常用于体细胞核移植的实验，但要注意前期的融合过程需要进行大量的制备，以保证融合的有效性。 本研究成功制备了转双基因两种细胞系，并探讨了制备重构胚的可行性，为今后探索多个外源性功能基因在山羊体内的共表达奠定了基础，也为将来制备高表达转基因动物提供了新思路、新方法。

目录

论文说明

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1．生长激素的研究进展

2．转基因动物乳腺生物反应器生产重组t-PA的研究进展

3．双基因的协同的作用

第二章 山羊生长激素基因载体的构建

1 试验材料

2 试验方法

2．1 gGH cDNA片段的获得

2．2 PCR扩增Neo基因序列

2．3 PLGH载体的构建

3．结果

4．讨论

第三章 双基因共整合山羊胎儿成纤维细胞系的制备

1．试验材料

2．试验方法

2．1 胎儿成纤维细胞的准备

2．2 胎儿性别鉴定

2．3 胎儿成纤维细胞的冻存

2．4 质粒DNA的制备

2．5 PLGH与PtPA双基因共转染胎儿成纤维细胞

2．6 双基因转染胎儿成纤维细胞转染条件的优化

2．7 转染细胞的筛选

2．8 挑取单克隆

2．9 单克隆细胞的PCR验证

3 结果

4 讨论

第四章 双基因整合山羊乳腺上皮细胞系的建立

1．试验材料

2 试验方法

2．1 奶山羊乳腺上皮细胞的原代培养

2．2 乳腺上皮细胞的纯化

2．3 细胞的冻存

2．4 PLGH与PtPA共转染山羊乳腺上皮细胞

2．5 G418的药物筛选培养

2．6 挑取单克隆

2．7 细胞株的PCR整合检测

2．8 催乳素处理及ELISA检测

3 结果

4 讨论

第五章 PLGH与PtPA乳腺特异性表达载体制备转基因兔

1 试验材料

2 试验方法

2．1 显微注射用质粒载体的准备

2．2 转基因免的制备

2．3 转基因兔的整合检测

3 结果

4 讨论

第六章 山羊转基因克隆胚的构建

1 试验材料

2 试验方法

2．1 卵母细胞供体羊的准备

2．2 供核细胞的准备

2．3 卵母细胞的准备和重构胚的制备

2．4 重组胚的电融合与核移植胚胎的激活

3 结果

4 讨论

全文总结

参考文献

致谢

声明